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Articolo metodologico

Rigenerazione epiteliale intestinale in risposta all'irradiazione ionizzante

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DOI:

10.3791/64028

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27 luglio 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

In questo articolo

Sommario

Il tratto gastrointestinale è uno degli organi più sensibili alle lesioni sui trattamenti radioterapeutici contro il cancro. È allo stesso tempo un sistema di organi con una delle più alte capacità rigenerative a seguito di tali insulti. Il protocollo presentato descrive un metodo efficace per studiare la capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.

Abstract

L'epitelio intestinale è costituito da un singolo strato di cellule ma contiene più tipi di cellule terminalmente differenziate, che sono generate dalla proliferazione attiva delle cellule staminali intestinali situate sul fondo delle cripte intestinali. Tuttavia, durante gli eventi di danno intestinale acuto, queste cellule staminali intestinali attive subiscono la morte cellulare. L'irradiazione gamma è un trattamento del cancro del colon-retto ampiamente utilizzato che, sebbene terapeuticamente efficace, ha l'effetto collaterale di esaurire il pool di cellule staminali attive. Infatti, i pazienti sperimentano frequentemente la sindrome da radiazioni gastrointestinali durante la radioterapia, in parte a causa della deplezione di cellule staminali attive. La perdita di cellule staminali intestinali attive nelle cripte intestinali attiva un pool di cellule staminali intestinali di riserva tipicamente quiescenti e induce la dedifferenziazione delle cellule precursori secretorie ed enterocitarie. Se non fosse per queste cellule, l'epitelio intestinale mancherebbe della capacità di recuperare dalla radioterapia e da altri importanti insulti tissutali. I nuovi progressi nelle tecnologie di tracciamento del lignaggio consentono il monitoraggio dell'attivazione, della differenziazione e della migrazione delle cellule durante la rigenerazione e sono stati impiegati con successo per studiarlo nell'intestino. Questo studio mira a rappresentare un metodo per l'analisi delle cellule all'interno dell'epitelio intestinale del topo dopo lesioni da radiazioni.

Introduzione

L'epitelio intestinale umano coprirebbe approssimativamente la superficie di mezzo campo da badminton se posizionato completamente piatto1. Invece, questo singolo strato cellulare che separa gli esseri umani dal contenuto delle loro viscere è compattato in una serie di proiezioni simili a dita, villi e rientranze, cripte che massimizzano la superficie dell'intestino. Le cellule dell'epitelio si differenziano lungo un asse crypt-villus. I villi sono costituiti principalmente da enterociti che assorbono i nutrienti, cellule caliciformi che secernono muco e cellule enteroendocrine che producono ormoni, mentre le cripte consistono principalmente di cellule di Paneth produttrici di defensina, cellule staminali attive e di riserva e cellule progenitrici 2,3,4,5. Inoltre, la comunicazione bidirezionale che queste cellule hanno con le cellule stromali e immunitarie del compartimento mesenchimale sottostante e il microbiota del lume generano una complessa rete di interazioni che mantiene l'omeostasi intestinale ed è fondamentale per il recupero dopo l'infortunio 6,7,8.

L'epitelio intestinale è il tessuto auto-rinnovante più rapidamente nel corpo umano, con un tasso di turnover di 2-6 giorni 9,10,11. Durante l'omeostasi, le cellule staminali attive alla base delle cripte intestinali (cellule colonnari della base della cripta), contrassegnate dall'espressione del recettore 5 accoppiato alla proteina G contenente ripetizioni ricco di leucina (LGR5), si dividono rapidamente e forniscono cellule progenitrici che si differenziano in tutte le altre linee epiteliali intestinali. Tuttavia, a causa del loro alto tasso mitotico, le cellule staminali attive e i loro progenitori immediati sono particolarmente sensibili alle lesioni da radiazioni gamma e subiscono apoptosi dopo irradiazione 5,12,13,14. Alla loro perdita, le cellule staminali di riserva e le cellule non staminali (sottopopolazioni di progenitori e alcune cellule terminalmente differenziate) all'interno delle cripte intestinali subiscono l'attivazione e ricostituiscono il compartimento della cripta basale, che può quindi ricostituire le popolazioni cellulari dei villi e, quindi, rigenerare l'epitelio intestinale15. Utilizzando tecniche di tracciamento del lignaggio, diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che le cellule staminali di riserva (quiescenti) sono in grado di supportare la rigenerazione dopo la perdita di cellule staminali attive 13,16,17,18,19,20,21,22. Queste cellule sono caratterizzate dalla presenza dell'oncogene della proteina 1 del complesso polycomb (Bmi1), del gene della trascrittasi inversa della telomerasi di topo (mTert), dell'omeobox Hop (Hopx) e del gene della proteina 1 di ripetizione ricco di leucina (Lrig1). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule non staminali sono in grado di ricostituire le cripte intestinali in caso di lesioni 23,24,25,26,27,28,29,30,31. In particolare, è stato dimostrato che i progenitori delle cellule secretorie e degli enterociti subiscono una dedifferenziazione in caso di lesione, ritornano a cellule staminali e supportano la rigenerazione dell'epitelio intestinale. Studi recenti hanno identificato cellule che esprimono marcatori multipli che possiedono la capacità di acquisire caratteristiche simili a staminali in caso di lesione (come DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. hanno dimostrato che anche le cellule di Paneth mature (LYZ +) possono contribuire alla rigenerazione intestinale37. Inoltre, oltre a causare l'apoptosi delle cellule epiteliali intestinali e ad interrompere la funzione della barriera epiteliale, l'irradiazione provoca disbiosi della flora intestinale, attivazione delle cellule immunitarie e inizio di una risposta pro-infiammatoria e attivazione delle cellule mesenchimali e stromali38,39.

La radiazione gamma è un prezioso strumento terapeutico nel trattamento del cancro, soprattutto per i tumori del colon-retto40. Tuttavia, l'irradiazione influisce significativamente sull'omeostasi intestinale inducendo danni alle cellule, che portano all'apoptosi. L'esposizione alle radiazioni provoca molteplici perturbazioni che rallentano il recupero di un paziente ed è caratterizzata da lesioni e infiammazioni della mucosa nella fase acuta e diarrea, incontinenza, sanguinamento e dolore addominale a lungo termine. Questa panoplia di manifestazioni è indicata come tossicità da radiazioni gastrointestinali. Inoltre, la progressione indotta dalle radiazioni della fibrosi transmurale e/o della sclerosi vascolare può manifestarsi solo anni dopo il trattamento38,41. Contemporaneamente alla lesione stessa, la radiazione induce una risposta di riparazione nelle cellule intestinali che attiva le vie di segnalazione responsabili dell'avvio e dell'orchestrazione della rigenerazione42. La malattia dell'intestino tenue indotta da radiazioni può originarsi dalla radioterapia pelvica o addominale fornita ad altri organi (come cervice, prostata, pancreas, retto)41,43,44,45,46. Il danno da irradiazione intestinale è, quindi, un problema clinico significativo e una migliore comprensione della fisiopatologia risultante è probabile che faccia avanzare lo sviluppo di interventi per alleviare le complicanze gastrointestinali associate alla radioterapia. Esistono altre tecniche che consentono di indagare lo scopo rigenerativo dell'epitelio intestinale oltre alle radiazioni. Sono stati sviluppati modelli murini transgenici e chimici per studiare l'infiammazione e la successiva rigenerazione47. Il destrano solfato di sodio (DSS) induce infiammazione nell'intestino e porta allo sviluppo di caratteristiche simili a quelle della malattia infiammatoria intestinale48. Una combinazione di trattamento DSS con il composto pro-cancerogeno azoxymethane (AOM) può provocare lo sviluppo di cancro associato alla colite48,49. La lesione indotta da ischemia da riperfusione è un altro metodo impiegato per studiare il potenziale rigenerativo dell'epitelio intestinale. Questa tecnica richiede esperienza e conoscenza chirurgica50. Inoltre, le suddette tecniche causano diversi tipi di lesioni rispetto alle radiazioni e possono portare al coinvolgimento di diversi meccanismi di rigenerazione. Inoltre, questi modelli richiedono molto tempo, mentre la tecnica di radiazione è abbastanza breve. Recentemente, metodi in vitro che utilizzano enteroidi e colonoidi generati dall'intestino e dal colon sono stati utilizzati in combinazione con lesioni da radiazioni per studiare i meccanismi di rigenerazione intestinale51,52. Tuttavia, queste tecniche non ricapitolano completamente l'organo che modellano53,54.

Il protocollo presentato include la descrizione di un modello murino di danno da radiazioni gamma in combinazione con un modello genetico che, a seguito del trattamento con tamoxifene, consente di tracciare linee originate dalla popolazione di cellule staminali di riserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Questo modello utilizza un'irradiazione totale corporea di 12 Gy, che induce lesioni intestinali abbastanza significative da attivare le cellule staminali di riserva, consentendo comunque la successiva indagine della capacità rigenerativa intestinale entro 7 giorni dalla lesione55.

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Protocollo

Tutti i topi sono stati ospitati nella Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) della Stony Brook University. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Stony Brook University (IACUC) ha approvato tutti gli studi e le procedure che coinvolgono soggetti animali. Gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti rigorosamente in conformità con il protocollo di gestione degli animali approvato (IACUC # 245094).

NOTA: I ceppi di topo B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) e B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) sono stati ottenuti commercialmente (vedi tabella dei materiali) e incrociati per ottenere Bmi1-Cre ER; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) topi, come descritto in precedenza56,57,58.

1. Alloggiamento di Bmi1-Cre ER; Mouse Rosa26 eYFP

  1. Tenere i topi in una struttura per animali a una temperatura compresa tra 68-72 ° F e umidità compresa tra 30-70%, in un ciclo luce / buio di 12 ore / 12 ore, con acqua e normale chow ad libitum.
  2. Prima degli esperimenti, confermare i genotipi dei topi utilizzando una tecnica di genotipizzazione PCR standard57,58.

2. Preparazione di animali e materiali

  1. Trasferire i topi nella stanza sperimentale almeno 7 giorni prima di qualsiasi sperimentazione per consentire ai topi di acclimatarsi.
  2. Abbina gli animali sperimentali e di controllo in base al sesso e all'età.
  3. Sottoporre gli animali di controllo a ricombinazione Cre-mediata indotta da tamoxifene, ma non a irradiazione (trattamento fittizio, 0 Gy), assicurandosi nel contempo che gli animali da esperimento ricevano l'iniezione di tamoxifene e siano esposti all'irradiazione gamma.
  4. Preparare la soluzione di tamoxifene. Risospendere la polvere di tamoxifene in olio di mais sterile ad una concentrazione di 30 mg/ml. Sonicare per 3 minuti in cicli di 30 s ON e 30 s OFF con ampiezza del 60% e quindi ruotare al buio per 1 ora a temperatura ambiente (RT). La soluzione di tamoxifene può essere congelata a -20 °C ma non congelarla/scongelarla più di una volta. Preferibilmente, preparare una soluzione fresca ogni volta e non conservarla.
    NOTA: Il tamoxifene è sensibile alla luce. Avvolgerlo con carta stagnola durante la rotazione a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: Il tamoxifene è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolo per la salute (GHS08) e pericolo per l'ambiente (GHS09).
  5. Preparare la soluzione madre di 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU). Risospendere la polvere di EdU in 1/5 del volume totale di dimetilsolfossido sterile (DMSO) e aggiungere lentamente i restanti 4/5 del volume totale di acqua ultrapura sterile. A completa dissoluzione, aliquote e conservare a -20 °C.
    ATTENZIONE: 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) e dimetilsolfossido (DMSO) sono sostanze potenzialmente pericolose: pericolo per la salute (H340 e H631 e H227, H315 e H319, rispettivamente). EdU può causare difetti genetici ed è sospettato di danneggiare la fertilità o i bambini non ancora nati, e DMSO può causare irritazione della pelle e degli occhi.
  6. Preparare i reagenti per la raccolta e la fissazione dei tessuti: diluire l'etanolo per preparare una soluzione acquosa al 70%, raffreddare DPBS a 4 °C e preparare il tampone fissativo di Bouin modificato (50% etanolo e 5% acido acetico in H2O distillato) e formalina tamponata al 10%.
    ATTENZIONE: L'alcol etilico è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolo per la salute (H225-H319), infiammabile (GHS02) e causa tossicità acuta (GHS07). L'acido acetico è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolosa per la salute (H226-H314), infiammabile (GHS02) e corrosiva (GHS05). La formalina è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolosa per la salute (H350, H315, H317, H318, H370) e corrosiva. La formalina può causare cancro, irritazione della pelle e degli occhi, danni agli organi e reazioni allergiche cutanee.
  7. Preparare l'attrezzatura necessaria per l'eutanasia secondo un metodo approvato (camera CO2 , per esempio), un kit di dissezione dei topi (forbici, pinze), piastre di Petri, un ago da 16 G gavage attaccato a una siringa da 10 ml per lavare l'intestino e cassette istologiche.

3. Irradiazione gamma total-body (TBI) e raccolta di tessuti

  1. Due giorni prima dell'esposizione all'irradiazione gamma, iniettare agli animali da esperimento una singola dose di tamoxifene per indurre la ricombinazione Cre-mediata e il tracciamento del lignaggio cellulare BMI1/EYFP+ . Pesare ogni animale e calcolare una dose di 40 mg/kg di peso corporeo di tamoxifene risospeso in olio di mais. Disinfettare la zona addominale con etanolo al 70% e somministrare tamoxifene per via intraperitoneale utilizzando un ago da 27G collegato a una siringa da 1 ml.
  2. Osservare gli animali per le successive 48 ore per escludere potenziali tossicità da tamoxifene.
  3. Trasferire i topi nella sala di irradiazione come specificato dall'istituzione locale.
  4. Calcolare il tempo di esposizione all'irradiazione rilasciato dalla sorgente di 137Cs in base all'attuale intensità di dose esatta. Ad esempio, se l'intensità di dose corrente è pari a 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), il tempo di esposizione in minuti è calcolato come dose desiderata/0,759. Per irradiare gli animali ad una dose di 12 Gy TBI, il tempo di esposizione è ~15,81 min (15 min e 48 s).
  5. Disinfettare la camera del campione nell'irradiatore gamma con una soluzione di etanolo al 70%; Posizionare il tappetino assorbente e gli animali all'interno della camera del campione.
    NOTA: Gli animali trattati con finzione devono essere collocati nella sala di irradiazione ma non esposti all'irradiazione gamma.
  6. Posizionare il coperchio e chiudere la camera.
  7. Programmare l'irradiatore gamma per esporre gli animali a 12 Gy TBI.
    1. Accendere la macchina ruotando la chiave nella posizione START.
    2. Immettere il numero dell'operatore utilizzando una tastiera numerica e confermare premendo INVIO.
    3. Immettere il numero PIN utilizzando una tastiera numerica e confermare premendo INVIO.
    4. Premere 1 per le opzioni.
    5. Premere 1 per le impostazioni del timer.
    6. Premere 1 per il tempo di irradiazione.
    7. Immettere l'impostazione del timer per il ciclo successivo utilizzando una tastiera numerica (formato hh:mm:ss) e confermare premendo INVIO.
    8. Confermare nuovamente le impostazioni premendo INVIO.
    9. Tornare al menu Home premendo CLEAR 2x.
    10. Premere START per avviare l'esposizione.
  8. Lasciare la stanza per il tempo di esposizione attiva. La macchina si arresterà automaticamente allo scadere del tempo preimpostato e inizierà a emettere un segnale acustico.
    ATTENZIONE: Il cesio-137 (137Cs) è una sostanza pericolosa mortale (pericolo per la salute: H314). L'esposizione esterna a grandi quantità di 137C può causare ustioni, malattie acute da radiazioni e persino la morte.
  9. Spegnere la macchina ruotando la chiave in posizione STOP.
  10. Aprire la camera di campionamento, togliere il coperchio, trasferire gli animali nella gabbia e disinfettare la camera di campionamento con una soluzione di etanolo al 70%.
  11. Trasferire gli animali nella stanza di stabulazione convenzionale e osservare le loro condizioni dopo il trattamento.
  12. Monitorare il peso degli animali ogni giorno e eutanasia immediatamente (nonostante il punto temporale pianificato) se si osservano sintomi di alterato benessere, angoscia o perdita di peso superiore al 15% del peso corporeo iniziale.
  13. Tre ore prima dell'eutanasia pianificata disinfettare la zona addominale e, utilizzando una siringa da insulina da 28G, iniettare nei topi 100 μL di soluzione madre di EdU (somministrata per via intraperitoneale).
  14. Raccogliere gli intestini prossimali a 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 168 h dopo l'irradiazione.
    1. Eseguire l'eutanasia CO2 secondo gli standard dell'istituzione di origine.
      ATTENZIONE: L'anidride carbonica è una sostanza pericolosa (H280). Contiene gas sotto pressione; può esplodere se riscaldato. Può spostare l'ossigeno e causare un rapido soffocamento.
    2. Quindi, sezionare la parte prossimale dell'intestino tenue, rimuovere i tessuti attaccati, sciacquare con DPBS freddo usando un ago di alimentazione dritto da 16 G collegato a una siringa da 10 ml, fissare con il tampone fissativo di Bouin modificato usando un ago di alimentazione dritto da 16 G collegato a una siringa da 10 ml, tagliare longitudinalmente e arrotolare l'intestino prossimale usando la tecnica swiss-roll come descritto in precedenza59.
  15. Mettere i tessuti in una cassetta istologica e lasciare per 24-48 ore a temperatura ambiente in un contenitore con formalina tamponata al 10%. Il volume della formalina dovrebbe essere sufficiente a coprire completamente le cassette istologiche. Allo scadere del tempo di incubazione, utilizzando una pinza, trasferire le cassette istologiche nel contenitore riempito con etanolo al 70%. Quindi, procedere con l'incorporazione di paraffina tissutale.
    NOTA: L'incorporazione di paraffina tissutale è stata eseguita dal Research Histology Core Laboratory della Stony Brook University. La procedura può essere interrotta qui e i blocchi di paraffina possono essere conservati a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: La formalina è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolosa per la salute (H350, H315, H317, H318, H370) e corrosiva. La formalina può causare cancro, irritazione della pelle e degli occhi, danni agli organi e reazioni allergiche cutanee.

4. Analisi istologica

  1. Raffreddare le cassette istologiche contenenti i campioni di tessuto incorporati in paraffina mettendole sul ghiaccio per almeno 1 ora. Usando un microtomo, preparare sezioni spesse 5 μm per la colorazione. Ogni tessuto deve essere affettato orizzontalmente per coprire l'intero campione arrotolato.
    1. Dopo aver tagliato il blocco di paraffina, trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldato fino a 45 °C e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: La procedura può essere interrotta qui e le diapositive possono essere conservate a temperatura ambiente.
  2. Posizionare i vetrini in un portavetrini e cuocere in forno a 65 °C per una notte. Le diapositive possono essere cotte per un tempo più breve, 1-2 h. Tuttavia, questo non è consigliabile nel caso di vetrini appena tagliati (meno di 1 mese).
    NOTA: posizionare il set di colorazione manuale sotto il cappuccio chimico ed eseguire le incubazioni con xilene, etanolo ed ematossilina sotto il cappuccio chimico.
  3. Il giorno dopo, raffreddare i vetrini posizionandoli in un portavetrini sotto la cappa chimica per 10 minuti.
  4. Deparaffinizzare i tessuti posizionando il portavetrino in un contenitore riempito con xilene al 100% per 3 minuti. Ripetere l'incubazione utilizzando xilene fresco al 100%.
    NOTA: Da quel momento, assicurarsi che i campioni siano sempre bagnati.
    ATTENZIONE: Lo xilene è una sostanza potenzialmente pericolosa: infiammabile (GHS02), che causa tossicità acuta (GHS07) e pericolo per la salute (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). I potenziali effetti pericolosi sono che è fatale se ingerito o entra nelle vie aeree e può causare irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. Inoltre, può influenzare le funzioni motorie causando sonnolenza o vertigini e causare danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta.
  5. Reidratare le sezioni in un gradiente di etanolo posizionando il portavetrino in sequenza in contenitori riempiti con le seguenti soluzioni: 100% etanolo, 2 min; 95% etanolo, 2 min; 70% etanolo, 2 min.
  6. Trasferire il portavetrino nel contenitore pieno di acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente per 2 minuti.
  7. Posizionare il portavetrino in un contenitore riempito con soluzione di ematossilina e colorare per 5 minuti (sotto il cappuccio chimico).
  8. Trasferire il portavetrino nel contenitore pieno di acqua di rubinetto e risciacquare con acqua corrente fino a quando la colorazione dell'ematossilina diventa bluastra, in genere dopo 2 minuti.
  9. Trasferire il portavetrino nel contenitore riempito con una soluzione di carbonato di litio al 5% (p/v). Immergere 10x.
    ATTENZIONE: Il carbonato di litio è una sostanza potenzialmente pericolosa: causa tossicità acuta (GHS07) e pericolo per la salute (H302 - H319). È dannoso se ingerito, dannoso a contatto con la pelle e provoca gravi irritazioni agli occhi.
  10. Trasferire il portavetrino nel contenitore pieno di acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente per 2 minuti.
  11. Posizionare il portavetrini in un contenitore pieno di eosina e colorare per 5 minuti.
  12. Trasferire il portavetrino nel contenitore riempito con etanolo al 70% e risciacquare brevemente (10 s).
  13. Disidratare le sezioni posizionando il portavetrino in sequenza nei contenitori riempiti con soluzioni di gradiente di etanolo: etanolo al 95%, 5 immersioni; 100% etanolo, 5 tuffi.
  14. Pulire i vetrini posizionando il portavetrini nel contenitore riempito con xilene al 100% per 3 minuti. Ripetere l'incubazione utilizzando xilene fresco al 100%.
  15. Estrarre il vetrino dal rack, asciugare l'area intorno ai tessuti con un tovagliolo di carta e, a seconda delle dimensioni del campione, aggiungere una goccia o due di supporto di montaggio a base di xilene sulla superficie del campione. Montare posizionando delicatamente una vetrina sopra il vetrino (fare attenzione a non lasciare bolle d'aria). Premere delicatamente se necessario. L'intera superficie del vetro deve essere coperta e sigillata.
  16. Asciugare i vetrini lasciandoli sotto il cappuccio chimico durante la notte. In genere, il mezzo di montaggio si solidifica in meno di 24 ore. Per garantire che i vetrini siano asciutti, è possibile creare un vetrino campione. Utilizzando una slitta vuota, posizionare una goccia del mezzo di montaggio e lasciare sotto il cappuccio chimico durante la notte. Il giorno dopo, tocca la goccia e controlla se è solidificata.
  17. Quando i vetrini si asciugano, analizzare l'istologia dei tessuti utilizzando un microscopio ottico o un microscopio più avanzato con un canale di campo luminoso.
    1. Posizionare un vetrino da microscopio sul palco, spostarsi fino a quando il campione è al centro del campo visivo, regolare la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco e utilizzare una lente dell'obiettivo di ingrandimento 10x e / o 20x per analizzare l'istologia rispetto ai tessuti di controllo (fittizi irradiati).
    2. Se il microscopio è dotato di una fotocamera, scattare anche le immagini.
      NOTA: la procedura può essere interrotta qui; I vetrini possono essere conservati a temperatura ambiente e analizzati in seguito. Non tenere i vetrini più a lungo di 30 giorni poiché la colorazione svanisce lentamente.

5. Colorazione con immunofluorescenza

  1. Raffreddare le cassette istologiche contenenti campioni di tessuto incorporati in paraffina ponendoli sul ghiaccio per almeno 1 ora. Usando un microtomo, preparare sezioni spesse 5 μm per la colorazione. Ogni tessuto deve essere affettato orizzontalmente per coprire l'intero campione arrotolato.
    1. Dopo aver tagliato il blocco di paraffina, trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldato a 45 °C e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: La procedura può essere interrotta qui e le diapositive possono essere conservate a temperatura ambiente.
  2. Posizionare i vetrini in un portavetrini e cuocere in forno a 65 °C per una notte. Le diapositive possono essere cotte per un tempo più breve, 1-2 h. Tuttavia, questo non è consigliabile nel caso di diapositive appena tagliate (meno di 1 mese fa).
    NOTA: Posizionare il set di colorazione manuale sotto il cappuccio chimico ed eseguire le incubazioni con xilene, etanolo e H2 O2 / metanolo sotto il cappuccio chimico.
  3. Il giorno dopo, raffreddare i vetrini posizionandoli in un portavetrini sotto la cappa chimica per 10 minuti.
  4. Deparaffinizzare i tessuti posizionando il portavetrino in un contenitore riempito con xilene al 100% per 3 minuti. Ripetere l'incubazione utilizzando xilene fresco al 100%.
    NOTA: Da quel momento, assicurarsi che i campioni siano sempre bagnati.
  5. Spegnere la perossidasi endogena incubando i vetrini per 30 minuti in un contenitore riempito con soluzione di perossido di idrogeno al 2% in metanolo sotto il cappuccio chimico.
    ATTENZIONE: L'alcol metilico è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolo per la salute (H225-H301, H311, H331-H370), infiammabile (GHS02) e causa tossicità acuta (orale, cutanea, inalazione) (GHS08). Il perossido di idrogeno è una sostanza potenzialmente pericolosa: corrosiva (GHS05) e causa tossicità acuta (GHS07).
  6. Reidratare le sezioni in un gradiente di etanolo posizionando il portavetrino in sequenza in contenitori riempiti con le seguenti soluzioni: 100% etanolo, 3 min; 95% etanolo, 3 min; 70% etanolo, 3 min.
  7. Trasferire il portavetrino in un contenitore pieno di acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente per 2 minuti.
  8. Per recuperare gli antigeni, trasferire il portavetrino in un contenitore con 250 mL di soluzione tampone citrato (10 mM di citrato di sodio, 0,05% Tween-20, pH 6,0) e cuocere a 110 °C per 10 minuti utilizzando una camera di decloaking.
  9. Trasferire l'intero contenitore nella cella frigorifera e consentire un raffreddamento graduale nel corso di 30 minuti.
  10. Dopo 30 minuti, sostituire la soluzione tampone citrato con acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente fino a rimuovere tutti i pezzi di paraffina galleggianti.
  11. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta), toccare un tovagliolo di carta e asciugare accuratamente l'area intorno al campione con un tovagliolo di carta. Disegna una forma chiusa attorno al campione usando una penna che fornisce una barriera idrofobica (penna PAP). Mettere in una camera umidificata.
  12. Bloccare con albumina sierica bovina (BSA) al 5% in TBS-Tween aggiungendo 200 μL della soluzione sulla superficie di una provetta. Assicurarsi che non vi siano perdite. Incubare a 37 °C in camera umidificata per 30 min.
  13. Rimuovere la soluzione di blocco toccando il vetrino su un tovagliolo di carta. Riporre in una camera umidificata. Aggiungere 100 μL della concentrazione appropriata degli anticorpi primari risospesi in un tampone bloccante e incubare a 4 °C con un leggero oscillolio durante la notte. Per BMI1/EYFP, utilizzare pollo anti-GFP (diluizione 1:500); per Ki-67, usare coniglio anti-Ki-67 (diluizione 1:200).
  14. Rimuovere la soluzione anticorpale toccando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare le diapositive in un portavetrini e trasferirle nel contenitore riempito con TBS-Tween. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 3 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di buffer TBS-Tween.
  15. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta), rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporli in una camera umidificata. Aggiungere 100 μL della concentrazione appropriata di anticorpi secondari risospesi in un tampone bloccante e incubare a 37 °C per 30 minuti. Gli anticorpi secondari devono essere coniugati con un fluoroforo. Per BMI1/EYFP, utilizzare l'asino anti-pollo Alexa Fluor 647 (diluizione 1:500); per Ki-67, utilizzare capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 (diluizione 1:500).
  16. Rimuovere la soluzione anticorpale toccando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare le diapositive in un portavetrini e trasferirle nel contenitore riempito con TBS-Tween. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 3 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di buffer TBS-Tween.
  17. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta), rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporli in una camera umidificata. Aggiungere 100 μL della soluzione colorante EdU preparata secondo le istruzioni del produttore e utilizzando il fluoroforo Alexa Fluor 555.
  18. Rimuovere la soluzione EdU toccando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare le diapositive in un portavetrini e trasferirle nel contenitore riempito con TBS-Tween. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 2 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di buffer TBS-Tween.
  19. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta); Rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporre in una camera umidificata. Eseguire la controcolorazione di Hoechst 33258 aggiungendo 100 μL della soluzione di Hoechst 33258 (diluizione 1:1000 in TBS-Tween) sulla superficie del campione. Incubare al buio a temperatura ambiente per 5 min.
  20. Rimuovere la soluzione di Hoechst 33258 picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare le diapositive in un portavetrini e trasferirle in un contenitore pieno di TBS-Tween. Lavare i vetrini agitando per 5 min.
  21. Estrarre il vetrino dal portavetrino, asciugare l'area intorno ai tessuti con un tovagliolo di carta e, a seconda delle dimensioni del campione, aggiungere una goccia o due di mezzo di montaggio a base di acqua sulla superficie del campione. Montare posizionando delicatamente una vetrina sopra il vetrino (fare attenzione a non lasciare bolle d'aria). Premere delicatamente se necessario. L'intera superficie del vetro deve essere coperta e sigillata.
  22. Asciugare i vetrini lasciandoli al buio a temperatura ambiente durante la notte. In genere, il supporto di montaggio si solidifica in meno di 24 ore. Per garantire che i vetrini siano asciutti, è possibile creare un vetrino campione. Utilizzare una diapositiva vuota; Posizionare una goccia del mezzo di montaggio e lasciare sotto il cappuccio chimico durante la notte. Il giorno dopo, tocca la goccia e controlla se è solidificata.
  23. Quando i vetrini si asciugano, i tessuti colorati possono essere analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri a lunghezza d'onda di emissione che consentono la visualizzazione della colorazione Ki-67, EdU e BMI1/EYFP (535 nm, 646 nm e 700 nm, rispettivamente).
  24. Posizionare un vetrino da microscopio sul palco, spostarsi fino a quando il campione è al centro del campo visivo, regolare la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco e utilizzare l'obiettivo con ingrandimento 10x e/o 20x per analizzare la colorazione rispetto ai tessuti di controllo (fittizia irradiata). Se il microscopio è dotato di una fotocamera, è possibile acquisire anche immagini. Scatta immagini per ciascun canale separatamente e uniscile in seguito.
    NOTA: la procedura può essere interrotta qui; i vetrini possono essere conservati a 4 °C e successivamente analizzati. Non tenere i vetrini più a lungo di 14 giorni poiché la colorazione svanisce lentamente.

6. Colorazione TUNEL

  1. Raffreddare le cassette istologiche contenenti campioni di tessuto incorporati in paraffina ponendoli sul ghiaccio per almeno 1 ora. Usando un microtomo, preparare sezioni spesse 5 μm per la colorazione. Ogni tessuto deve essere affettato orizzontalmente per coprire l'intero campione arrotolato.
    1. Dopo aver tagliato il blocco di paraffina, trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldato fino a 45 °C e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: La procedura può essere interrotta qui e le diapositive possono essere conservate a temperatura ambiente.
  2. Posizionare i vetrini in un portavetrini e cuocere in forno a 65 °C per una notte.
    NOTA: Le diapositive possono essere cotte per un tempo più breve, 1-2 ore. Tuttavia, non è consigliabile nel caso di vetrini appena tagliati (meno di 1 mese fa). Posizionare il set manuale di colorazione sotto il cappuccio chimico ed eseguire le incubazioni con xilene ed etanolo sotto il cappuccio chimico.
  3. Il giorno dopo, raffreddare i vetrini posizionandoli in un portavetrini sotto la cappa chimica per 10 minuti.
  4. Deparaffinizzare i tessuti posizionando il supporto dei vetrini in un contenitore riempito con xilene al 100% per 3 minuti. Ripetere l'incubazione utilizzando xilene fresco al 100%.
    NOTA: Da questo punto, assicurarsi che i campioni siano sempre bagnati.
  5. Reidratare le sezioni in un gradiente di etanolo posizionando il portavetrini in sequenza in contenitori riempiti con le seguenti soluzioni: 100% etanolo, 3 min; 95% etanolo, 3 min; 90% etanolo, 3 min; 80% etanolo, 3 min; 70% etanolo, 3 min.
  6. Trasferire il portavetrino in un contenitore pieno di acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente per 1 minuto.
  7. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta), toccare un tovagliolo di carta e asciugare accuratamente l'area intorno al campione con un tovagliolo di carta. Disegna una forma chiusa attorno al campione usando una penna che fornisce una barriera idrofobica (penna PAP). Mettere in una camera umidificata.
  8. Incubare con proteinasi K libera da DNasi. Aggiungere 100 μL della soluzione di proteinasi K libera da DNasi (diluizione 1:25 in DPBS) sulla superficie del campione all'interno della barriera idrofobica. Incubare a temperatura ambiente in camera umidificata per 15 min.
    ATTENZIONE: La proteinasi K è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolo per la salute (H315 - H319 - H334).
  9. Rimuovere la soluzione di proteinasi K picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare i vetrini in un portavetrini e trasferirli nel contenitore riempito con DPBS. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 2 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di DPBS.
  10. Preparare la miscela di reazione TUNEL: mescolare la soluzione dell'etichetta (1x) con la soluzione enzimatica (10x). Pipetta bene.
  11. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta); Rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporre in una camera umidificata. Aggiungere 50 μL di miscela di reazione TUNEL sulla superficie del campione e incubare al buio a 37 °C in una camera umidificata per 60 minuti. Per un controllo negativo, utilizzare solo la soluzione per etichette (senza TdT).
  12. Rimuovere la soluzione TUNEL picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare i vetrini in un portavetrini e trasferirli in un contenitore pieno di DPBS. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 2 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di DPBS.
  13. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta); Rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporre in una camera umidificata. Eseguire la controcolorazione di Hoechst 33258 aggiungendo 100 μL della soluzione di Hoechst 33258 (diluizione 1:1000 in TBS-Tween) sulla superficie del campione. Incubare al buio a temperatura ambiente per 5 min.
  14. Rimuovere la soluzione di Hoechst 33258 picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare i vetrini in un portavetrini e trasferirli nel contenitore riempito con DPBS. Lavare i vetrini agitando per 5 min.
  15. Estrarre la diapositiva dal portavetrina; Asciugare l'area intorno ai tessuti con un tovagliolo di carta e, a seconda delle dimensioni del campione, aggiungere una goccia o due di mezzo di montaggio a base di acqua sulla superficie del campione. Montare posizionando delicatamente una vetrina sopra il vetrino (fare attenzione a non lasciare bolle d'aria). Premere delicatamente se necessario. L'intera superficie del vetro deve essere coperta e sigillata.
  16. Asciugare i vetrini lasciandoli al buio a temperatura ambiente durante la notte. In genere, il mezzo di montaggio si solidifica in meno di 24 ore. Per garantire che i vetrini siano asciutti, è possibile creare un vetrino campione. Posizionare una goccia del mezzo di montaggio e lasciare al buio a temperatura ambiente durante la notte. Il giorno dopo, tocca la goccia e controlla se è solidificata.
  17. Quando i vetrini si asciugano, i tessuti colorati possono essere analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri a lunghezza d'onda ad emissione che consentono la visualizzazione della colorazione TUNEL (535 nm).
  18. Posizionare un vetrino da microscopio sul palco, spostarsi fino a quando il campione è al centro del campo visivo, regolare la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco e utilizzare una lente dell'obiettivo con ingrandimento 10x e / o 20x per analizzare la colorazione rispetto ai tessuti di controllo (fittizia irradiata). Se il microscopio è dotato di una fotocamera, è possibile acquisire anche immagini. Scatta immagini per ciascun canale separatamente e uniscile in seguito.
    NOTA: la procedura può essere interrotta qui; i vetrini possono essere conservati a 4 °C e analizzati in seguito. Non tenere i vetrini più a lungo di 14 giorni poiché la colorazione svanisce lentamente.

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Risultati

L'uso dell'irradiazione totale corporea (TBI) a 12 Gy in combinazione con il tracciamento del lignaggio genetico murino consente un'analisi approfondita delle conseguenze delle lesioni da radiazioni nell'intestino. Per iniziare, Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP hanno ricevuto una singola iniezione di tamoxifene, che induce una maggiore espressione di proteine fluorescenti gialle (EYFP) all'interno di una popolazione di cellule staminali di riserva Bmi1+ . Due giorni dopo l'iniezione...

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Discussione

Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. Consente l'analisi precisa dei cambiamenti nell'epitelio intestinale nel corso di 7 giorni dopo l'infortunio. È importante sottolineare che i punti temporali selezionati riflettono fasi cruciali della lesione e sono caratterizzati da distinte alterazioni dell'intestino (lesioni, apoptosi, rigenerazione e fasi di normalizzazione)60. Questo modello di irradiazione è stato stabilito e attentamente valutato, dimostra...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere lo Stony Brook Cancer Center Histology Research Core per l'assistenza di esperti nella preparazione dei campioni di tessuto e la Divisione delle risorse animali da laboratorio presso la Stony Brook University per l'assistenza nella cura e nella gestione degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health DK124342 assegnate ad Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mlBD
309659-16G Aghi riutilizzabili per l'alimentazione di piccoli animali: DrittoVWR20068-630-27G
x 1/2" agoBD
305109-28G x 1/2" Siringa da insulina monogetto da 1 mlCovidien
1188128012-5-Etinil-2′-deossiuridina (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL in DMSO:acqua sterile (1:4 v/v), aliquotare e conservare in -20° C
Azer Scientific  10% Formalina tamponata neutraFisher Scientific22-026-213-B6.129X1-GT
(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/Jlaboratorio Jackson#:006148
B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Siero bovino Albumina Frazione V, shock termicoMillipore-Sigma3116956001
Pollo anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 kit di imaging, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-Olio
maisMillipore-SigmaC8267-Camera
di decloakingBiocare MedicalDC2012-Dimetil
solfossido (DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100sensibile alla luce
proteinasi libera da DNasi KInvitrogenC10618Hdiluito 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-Eosin
Fisher ScientificS176
Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse 90i Luce brillante e fluorescente, con obiettivi: 10X, 20XNikon
Fluoromount Aquoso Montaggio MedioMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0,759 Gy min-1
Capra anti-coniglio AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Soluzione di ematossilina, Gill n. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Microtomo rotante di Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, pentaidrato (bis-benzimide)Thermo Fisher ScientificDiluizione H3569:1000
Soluzione di perossido di idrogeno, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-Kit
rilevamento della morte cellulare in situ, fluoresceina (Roche)Millipore-Sigma11684795910
bloccante liquido Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Carbonato di litio (polvere/certificato ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000,5 g/1 L dH2O
Siringa Luer-Lok sterile, monouso, 10 mLVWR89215-218-Metanolo
VWRBDH1135-4LP
Pharmco Products  Alcool etilico, 200 PROOFFisher Scientific
NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acido acetico ACS GradoCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-Rabbit
anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Citoseal XYL Mezzo di montaggioFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie per la cottura di vetrini a 65 gradiFisher Scientific50-728-103
Citrato di sodio diidratoFisher ScientificS279-500
Kit di dissezione in acciaio inossidabileVWR25640-002
Superfrost Plus micro vetrini [dimensioni: 25 x 75 x 1 mm]VWR  48311-703
TamoxifeneMillipore-SigmaT564830 mg/mL in olio di mais sterile, preferibilmente fresco o conservazione a breve termine a -20 gradi; C, supporti
per 24 vetrini Tissue-Tek sensibili alla luce con manico staccabileSakura4465
Tissue-Tek  Accu-Edge  Lame a basso profiloSakura4689
Tissue-Tek  Set di colorazione manuale per vetriniSakura4451
Piastra per colorazione Tissue-Tek, verde con coperchioSakura4456
Piastra per colorazione Tissue-Tek, bianca con coperchioSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Cassette di elaborazione UnisetteVWR87002-292-VWR
Occhiali Micro CoverVWR48393-081
XileneFisher ScientificoX5P-1GAL
Il ceppo di di 1 di

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