Articolo metodologico

Spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo per lo studio della dinamica strutturale dell'alfa-sinucleina in condizioni fisiologiche

DOI:

10.3791/64050

⸱

23 giugno 2022

 , 
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'insieme strutturale dell'alfa-sinucleina monomerica influenza la sua funzione fisiologica e le proprietà fisico-chimiche. Il presente protocollo descrive come eseguire la spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo e le successive analisi dei dati per determinare le informazioni conformazionali sul monomero di questa proteina intrinsecamente disordinata in condizioni fisiologiche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'alfa-sinucleina (aSyn) è una proteina intrinsecamente disordinata i cui aggregati fibrillari sono abbondanti nei corpi di Lewy e nei neuriti, che sono i segni distintivi della malattia di Parkinson. Tuttavia, gran parte della sua attività biologica, così come la sua aggregazione, coinvolge centralmente la forma monomerica solubile della proteina. La delucidazione dei meccanismi molecolari di aSyn biologia e fisiopatologia richiede metodi strutturalmente altamente risolti ed è sensibile alle condizioni biologiche. Le sue strutture meta-stabili dispiegate nativamente rendono l'aSyn monomerico intrattabile a molte tecniche di biologia strutturale. Qui, viene descritta l'applicazione di uno di questi approcci: spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio (HDX-MS) sulla scala temporale al millisecondo per lo studio di proteine con bassa stabilità termodinamica e deboli fattori di protezione, come aSyn. Alla scala temporale del millisecondo, i dati HDX-MS contengono informazioni sull'accessibilità al solvente e sulla struttura legata all'idrogeno di aSyn, che vengono perse a tempi di etichettatura più lunghi, producendo in definitiva una risoluzione strutturale fino al livello di amminoacidi. Pertanto, HDX-MS può fornire informazioni ad alte risoluzioni strutturali e temporali sulla dinamica conformazionale e la termodinamica, le interazioni intra e intermolecolari e l'impatto strutturale di mutazioni o alterazioni delle condizioni ambientali. Sebbene ampiamente applicabile, è dimostrato come acquisire, analizzare e interpretare misurazioni HDX-MS al millisecondo in aSyn monomerico.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo1. È caratterizzato dalla formazione di inclusioni citoplasmatiche note come corpi di Lewy e neuriti di Lewy nella regione della substantia nigra pars compacta del cervello. Queste inclusioni citoplasmatiche sono state trovate per contenere aggregati della proteina intrinsecamente disordinata aSyn2. Nel PD e in altre sinucleinopatie, aSyn si trasforma da uno stato disordinato solubile in uno stato malato insolubile e altamente strutturato. Nella sua forma nativa, l'aSyn monomerico adotta una vasta gamma di conformazioni stabilizzate da interazioni elettrostatiche a lungo raggio tra i suoi N- e C-termini e interazioni idrofobiche tra la sua regione C-terminus e la componente beta non amiloide (NAC) 3,4,5,6. Eventuali interruzioni in queste interazioni stabilizzanti, come mutazioni, modifiche post-traduzionali e cambiamenti nell'ambiente locale, possono portare al misfolding del monomero, innescando così il processo di aggregazione7.

Mentre esiste una grande quantità di ricerche sulle forme oligomeriche e fibrillari di aSyn 8,9,10,11, c'è un bisogno cruciale di studiare la forma monomerica della proteina e capire meglio quali conformisti sono funzionali (e come) e quali sono inclini ad aggregare 8,9,10,11 . Essendo intrinsecamente disordinato, solo 14 kDa di dimensioni e difficile da cristallizzare, il monomero aSyn non è suscettibile alla maggior parte delle tecniche biologiche strutturali. Tuttavia, una tecnica in grado di misurare la dinamica conformazionale di aSyn monomerico è millisecondo HDX-MS, che ha recentemente generato importanti osservazioni strutturali che sarebbero difficili o impossibili da ottenere altrimenti 12,13,14. Millisecond HDX-MS misura sensibilmente la media dell'insieme conformazionale proteico monitorando lo scambio isotopico a idrogeno ammidico, indicando l'accessibilità al solvente e la partecipazione alla rete di legame a idrogeno di una particolare regione proteica sulla scala temporale del millisecondo. È necessario sottolineare l'aspetto millisecondo dell'HDX-MS poiché, a causa della sua natura meta-stabile e dispiegata nativamente, aSyn presenta una cinetica di scambio idrogeno molto veloce che si manifesta ben al di sotto del limite inferiore dei sistemi HDX-MS convenzionali. Ad esempio, la maggior parte della molecola aSyn ha completamente scambiato idrogeno per deuterio in condizioni intracellulari in meno di 1 s. Diversi laboratori hanno ora costruito strumentazione a miscelazione rapida; in questo caso, viene utilizzato un prototipo di strumento a flusso di spegnimento a miscelazione rapida in grado di eseguire HDX-MS con un tempo morto di 50 ms e una risoluzione temporale di 1 ms15. Mentre il millisecondo HDX-MS è stato recentemente molto importante nello studio di aSyn, è importante per studiare proteine / regioni intrinsecamente disordinate più ampiamente e un gran numero di proteine con loop / regioni che sono solo debolmente stabili. Ad esempio, farmaci peptidici (ad esempio, insulina; GLP-1/glucagone; tirzepatide) e le proteine di fusione peptidica (ad esempio, l'inibitore dell'HIV FN3-L35-T1144) sono i principali formati farmacologici in cui le informazioni strutturali e di stabilità in fase di soluzione possono essere un input critico per le decisioni di sviluppo del farmaco e, tuttavia, la porzione peptidica è spesso solo debolmente stabile e intrattabile da HDX-MS alla scala temporale dei secondi 16,17,18,19,20 . I metodi emergenti HDX-MS con etichettatura nei domini secondi/minuti hanno dimostrato di ricavare informazioni strutturali per i G-quadruplex del DNA, ma dovrebbe essere possibile estenderlo a strutture oligonucleotidiche più diverse mediante l'applicazione di HDX-MS21 al millisecondo.

Gli esperimenti HDX-MS possono essere eseguiti a tre diversi livelli: (1) bottom-up (per cui la proteina etichettata viene digerita proteoliticamente), (2) middle-down (in cui la proteina etichettata viene digerita proteoliticamente e i peptidi risultanti vengono ulteriormente frammentati da tecniche di soft-fragmentation) e (3) top-down (per cui le tecniche di soft-fragmentation frammentano direttamente la proteina etichettata)22 . Pertanto, i dati sub-molecolari HDX-MS ci consentono di localizzare il comportamento di scambio in regioni specifiche di una proteina, rendendo fondamentale avere un'adeguata copertura della sequenza per tali esperimenti. La risoluzione strutturale di qualsiasi esperimento HDX-MS si basa sul numero di peptidi proteolitici o frammenti derivati dalla proteina durante la digestione o la frammentazione morbida, rispettivamente. In ciascuno dei tre tipi di esperimento sopra descritti, il cambiamento nello scambio ammidico in ogni peptide / frammento è mappato sulla struttura primaria della proteina per indicare il comportamento delle regioni localizzate della proteina. Mentre la massima risoluzione strutturale è raggiunta attraverso la frammentazione morbida, la descrizione di questi esperimenti è fuori dallo scopo del presente studio, che si concentra sulla misurazione delle conformazioni monomeriche aSyn. Risultati eccellenti possono essere ottenuti con il flusso di lavoro "bottom-up" comunemente applicato descritto qui.

Qui vengono fornite procedure su (1) come preparare e gestire campioni aSyn e buffer HDX-MS, (2) come eseguire la mappatura peptidica per un esperimento HDX-MS bottom-up, (3) come acquisire dati HDX-MS su aSyn monomerico in condizioni fisiologiche, in particolare nel dominio del tempo millisecondo (utilizzando uno strumento personalizzato; sono stati descritti anche strumenti alternativi per l'etichettatura dei millisecondi), e (4) come elaborare e analizzare i dati HDX-MS. I metodi che utilizzano aSyn monomerico a pH fisiologico (7.40) in due condizioni di soluzione sono esemplificati qui. Sebbene siano di fondamentale utilità nello studio di aSyn, queste procedure possono essere applicate a qualsiasi proteina e non sono limitate alle proteine intrinsecamente disordinate.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Espressione proteica e purificazione di aSyn

  1. Preparare aSyn seguendo un report pubblicato in precedenza9.
  2. Dializzare in un tampone di conservazione sicuro (ad esempio, Tris, pH 7,2 ).
  3. Se necessario, concentrare il campione (ad esempio, tubi microcentrifuga con filtro spin utilizzando 3 kDa MWCO, 14.000 x g per circa 10-30 minuti, vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Si consiglia di non concentrarsi eccessivamente. L'integrità dell'insieme monomerico non è stata verificata oltre i 25 μM.
  4. Aliquota e conservazione a -80 °C
    NOTA: La proteina monomerica aSyn è stabile fino a 1 anno in queste condizioni di conservazione.

2. Preparazione del buffer HDX

NOTA: poiché Tris ha un coefficiente di temperatura elevato, la misurazione del pH deve essere regolata per la temperatura alla quale verrà eseguita la reazione HDX, che è di 20 °C in questo protocollo.

  1. Preparare il tampone di equilibrio per lo stato A e lo stato B pesando 0,002 mol di Tris in 100 ml di acqua di grado LC-MS. Per lo stato B, aggiungere 29,8 mg di KCl, 14,2 mg di MgCl2, 36,8 g di CaCl2 e 836 mg di NaCl al tampone Tris. Regolare il pH a 7,40 ± 0,05.
    NOTA: il tampone di equilibrio deve contenere le condizioni alle quali aSyn deve essere studiato. In questo caso, si tratta di 20 mM Tris a pH 7,4 +/− sali.
  2. Preparare il tampone di etichettatura per lo stato A e lo stato B pesando 0,002 mol di Tris in 100 ml di acqua deuterata. Per lo Stato B, aggiungere 29,8 mg di KCl, 14,2 mg di MgCl2, 36,8 g di CaCl2 e 836 mg di NaCl al tampone di etichettatura Tris. Il pD del tampone di etichettatura corrisponde al pH del tampone di equilibrio. Poiché pH = pD - 0,41, regolare in modo che il pHmetro legga 6,99 ± 0,0523,24.
    NOTA: il buffer di etichettatura deve avere gli stessi componenti del buffer di equilibrio, tranne per il fatto che viene preparato utilizzando acqua deuterata.
  3. Preparare il tampone di tempra pesando 0,010 mol di Tris e 0,050 mol di urea e portare a 100 ml con acqua di grado LC-MS. Regolare il pH a 2,50 ± 0,05 a 0,5 °C.
    NOTA: prima degli esperimenti HDX è necessario eseguire una schermata del buffer di tempra per identificare il miglior buffer di spegnimento per la proteina di interesse. Diverse concentrazioni e combinazioni di denaturanti (ad esempio, urea e guanidinio cloridrato) e agenti riducenti (ad esempio, tris (2-carbossietil) fosfina) vengono sottoposti a screening, insieme a parametri fisici come il volume e la temperatura di intrappolamento, per dispiegare e digerire efficacemente la proteina estinta. Un tampone di tempra composto da 100 mM Tris e 0,5 M urea a pH 2,50 è ottimale per il presente studio.
  4. Preparare il tampone di lavaggio della colonna di digestione pesando 0,125 mol di guanidinio cloridrato in una bottiglia di vetro Duran. Aggiungere 25 mL di metanolo e 250 μL di acido formico. Portare a 250 ml con acqua di grado LC-MS.
    NOTA: per la colonna di pepsina Enzymate BEH (vedere Tabella dei materiali), utilizzare un tampone di lavaggio a colonna di 0,5 M di guanidinio cloridrato, 10% (v/v) metanolo e 0,1% (v/v) di acido formico.
  5. Preparare il lavaggio debole della siringa pipettando 0,5 μL di acido formico in 249,5 mL di acqua di grado LC-MS.
  6. Preparare il lavaggio forte della siringa mescolando parti uguali di acqua di grado LC-MS, metanolo, acetonitrile e isopropanolo. Aggiungere acido formico a una concentrazione finale del 2% (v/v).
    NOTA: per prevenire la contaminazione incrociata tra i vari tamponi e la proteina e per consentire la pulizia della porta di iniezione, è fondamentale che vengano preparate soluzioni di lavaggio delle siringhe e che il percorso del flusso verso la valvola (spesso chiamato "fodera di lavaggio") sia completamente innescato con liquido. L'acido formico è facoltativo per il lavaggio debole della siringa.

3. Procedura di mappatura dei peptidi

  1. Preparare l'esempio seguendo il passaggio seguente.
    1. Il filtro ha scongelato il brodo proteico aSyn dal congelatore a -80 °C con filtri a siringa da 0,22 μm. Misurare l'assorbanza della proteina madre filtrata a 280 nm per determinare la concentrazione secondo la legge di Beer-Lambert. Diluire la proteina ad una concentrazione di 5 μM nel tampone di equilibrio (fase 2.1.).
      NOTA: La legge di Beer-Lambert: A = εcl, dove A è assorbanza, ε è il coefficiente di estinzione della proteina alla lunghezza d'onda misurata (280 nm qui) con unità M−1cm−1, c è la concentrazione proteica in M, e l è la lunghezza del percorso in cm. Per aSyn26 wild-type, ε = 5960 M−1cm−1.
  2. Impostare il metodo di cromatografia liquida.
    1. Creare un file di ingresso con un tempo di caricamento/trapping di 3 minuti ad una pressione di 7000-9000 psi, seguito da un gradiente dal 5% di acetonitrile al 40% di acetonitrile in 7 minuti, seguito da ripetute fasi di lavaggio del 5%-95% acetonitrile-acqua per 10 min.
    2. Assicurarsi che lo spray di blocco (ad esempio, encefalina di leucina, vedere Tabella dei materiali) scorra a 2000 psi e sia collegato alla sonda di spruzzatura di blocco della sorgente dello spettrometro di massa.
  3. Impostare i metodi di spettrometria di massa MSE .
    NOTA: MSE è un metodo di acquisizione indipendente dai dati a banda larga senza isolamento di massa precursore. Pertanto, tutti gli ioni all'interno dell'intervallo m/z selezionato sono ulteriormente frammentati utilizzando la dissociazione indotta da collisione (CID)27.
    1. Nel file di metodo MS, scegli MSE Continuum e imposta un tempo di acquisizione compreso tra 2-10 minuti, sorgente elettrospray e modalità di risoluzione positiva. Acquisisci MSE oltre 50-2000 Da, scansionando ogni 0,3 s.
    2. Per la funzione 1 (bassa energia), impostare la trappola e trasferire le energie di collisione a 4 V. Per la funzione 2 (alta energia), impostare l'energia di collisione di trasferimento della rampa in modo che sia costante a 4 V e l'energia di collisione della trappola sia come indicato nella Tabella 1 per ciascun livello di energia di mappatura.
      NOTA: È possibile utilizzare anche i metodi MSE di mobilità ionica. Metodi di mappatura alternativi (ad esempio, acquisizione dipendente dai dati o DDA) possono essere utilizzati a discrezione dell'utente.
  4. Impostare il robot autocampionatore (vedere Tabella dei materiali).
    1. Aggiungere 50 μL della proteina da 5 μM a un flaconcino di recupero totale. Posizionare il flaconcino in una posizione di campionamento nella camera destra HDX. Assicurarsi che questa camera sia a 0,5 °C.
    2. Aggiungere un flaconcino di reagente del tampone di equilibrio e due flaconcini di reagente del tampone di etichettatura alle posizioni del reagente uno, due e tre nella camera sinistra HDX. Assicurarsi che questa camera sia a 20 °C impostando il regolatore di temperatura Peltier (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere un flaconcino di tampone di tempra alla posizione del reagente uno nella camera destra HDX.
    3. Aggiungere otto flaconcini di recupero totale nelle posizioni di reazione della camera sinistra HDX e otto flaconcini di recupero massimo nelle posizioni di reazione della camera destra HDX.
      NOTA: Per garantire la completa pulizia e la massima riproducibilità dei volumi erogati, si consiglia di eseguire un lavaggio a siringa e un lavaggio primario sulle siringhe autocampionatore. Ad esempio, eseguire una sequenza di (1) lavaggio debole, (2) lavaggio forte, (3) lavaggio debole prima di iniziare gli esperimenti di mappatura. Questa sequenza può essere ripetuta ampiamente e si consiglia di farlo fino a 20 volte o fino a quando la siringa non è completamente bagnata.
    4. Impostare un elenco di esempio con i metodi LC e MS appropriati nel software di pianificazione e avviare la pianificazione.
      NOTA: Per il presente studio, Chronos viene utilizzato come software di pianificazione (vedere Tabella dei materiali).
  5. Elaborare i dati di mappatura.
    1. Identificare i peptidi dai file dell'esperimento di mappatura utilizzando un software appropriato (vedere Tabella dei materiali).
    2. Importare i dati di identificazione dei peptidi in DynamX (vedere Tabella dei materiali) utilizzando i seguenti parametri di soglia peptidica: intensità minima = 5000, lunghezza minima della sequenza = 0, lunghezza massima della sequenza = 40, prodotti minimi = 1, prodotti minimi per amminoacido = 0,25, prodotti consecutivi minimi = 2, intensità minima della somma per i prodotti = 0, punteggio minimo = 0 e errore MH+ massimo (ppm) = 0.
      NOTA: in alternativa, derivare le impostazioni ottimizzate in base a un flusso di lavoro consigliato28.
    3. Seleziona Dati dal menu e fai clic su Importa risultati PLGS. Fare clic su Aggiungi per scegliere i file di dati pertinenti per l'assegnazione spettrale. Quando tutti sono stati aggiunti, fare clic su Avanti e inserire le impostazioni del filtro sopra. Quindi, fare clic su Fine.
    4. Curare manualmente le assegnazioni isotopiche per ottenere la mappa finale di copertura peptidica di aSyn in DynamX.

4. Studio di scambio idrogeno/deuterio al millisecondo

  1. Pulire lo strumento prototipo FastHDX (vedere Tabella dei materiali) prima di iniziare gli esperimenti HDX.
    1. Aprire la GUI del software HDX compatibile e consentire l'inizializzazione del sistema.
    2. Immettere la temperatura della camera campione a 20 °C e la camera di spegnimento a 0,5 °C. Fare clic su Imposta per applicare le nuove temperature.
    3. Installare i tubi della centrifuga con acqua di grado LC-MS in tutte le prese.
    4. Nella scheda Titrator Plumbing Delivery , controllare sia le siringhe sinistra che quelle destra e fare clic su Prime per rimuovere eventuali bolle d'aria latenti nei tubi. Ripeti fino a quando tutte le bolle sono sparite.
    5. Nella scheda Macro , selezionare tutte le caselle relative alle siringhe. Fare clic su Calibra posizione iniziale delle siringhe. Fare clic su Wash Syringe Load Loop. Fare clic su Lava tutti i volumi del ciclo di miscelazione.
    6. Ripetere il passaggio 4.1.5. 1x di più.
    7. Se nelle siringhe tampone compaiono bolle, degassare scollegando la siringa ed espellendo la bolla verticalmente. Sostituire la siringa e ricalibrare in posizione zero.
  2. Configurare lo strumento prototipo FastHDX per esperimenti HDX.
    1. Aggiungere 500 uL di aSyn filtrato da 5 μM in un flaconcino di recupero totale e posizionare all'interno di un frigorifero da tavolo per evitare oligomerizzazione e aggregazione indotte dalla temperatura.
    2. Aggiungere 50 ml di tamponi di equilibrio, etichettatura e tempra a ciascun buffer (2. Fasi di preparazione del buffer HDX 1-3) ingresso nelle camere sinistra e destra.
    3. Aggiungere 50 mL di tampone di lavaggio della colonna (2. Fase di preparazione del tampone HDX 4) all'ingresso di lavaggio della pepsina.
    4. Per innescare le linee di lavaggio delle proteine e delle colonne 1x, controllare le siringhe sinistra e destra nella scheda Consegna idraulica del titolatore e fare clic su Prime una volta.
      NOTA: Qualsiasi clic successivo su Prime causerà ulteriori ripetizioni del processo primo, con conseguente consumo di grandi quantità di campione proteico. Si consiglia di evitare questo, anche quando c'è un ritardo nel software dopo che è stato tentato un clic sul pulsante.
    5. Ripetere i passaggi 4.1.5. 1x.
    6. Nella scheda Flusso di spegnimento manuale , immettere le impostazioni richieste, spiegate nei passaggi 4.2.7.-4.2.10.
    7. Per un esperimento di percorso temporale, immettere i tempi in millisecondi utilizzando il pulsante Punti simbolici . Se sono necessarie repliche, aggiungere lo stesso punto temporale più volte, ad esempio, per un triplice di 50 ms, è necessario inserire 50 50 50. L'elenco di esempio nel software dello spettrometro di massa (MassLynx è usato qui, vedi Tabella dei materiali) deve corrispondere esattamente a quei punti temporali.
      NOTA: i nomi dei file dell'elenco dei campioni dello spettrometro di massa e/o il testo di esempio devono essere utilizzati per garantire una registrazione permanente dei tempi di etichettatura HDX corrispondenti a quelli immessi nella GUI del software FastHDX. I tempi di etichettatura per ogni esecuzione del campione non verranno memorizzati da nessun'altra parte.
    8. Impostare Tempo trappola (min) come lunghezza del tempo di abbondanza. Qui, sono le 3.00.
    9. Impostare Wait for HPLC (mins) = (tempo di trappola + tempo di esecuzione + 1,5 min).
      NOTA: ad esempio, per un esperimento con 3 min di trapping e 17 min di gradiente, questo sarà di 21,50 min.
    10. Fare clic sulla casella Esegui vuoto solo se si eseguono esperimenti vuoti tra le esecuzioni di esempio. In caso affermativo, assicurarsi una voce (ad esempio, una riga valida nell'elenco di esempio) nel software per l'esecuzione vuota dopo ogni esecuzione di esempio.
    11. Una volta che l'elenco di esempio è pronto sul software, evidenziare le voci appropriate e avviare l'esecuzione nel software facendo clic sul pulsante Riproduci e FastHDX nel software.
      NOTA: a causa dello scrambling di idrogeno/ deuterio, i metodi solo MS o le tecniche di frammentazione morbida (dissociazione a trasferimento di elettroni, dissociazione a cattura elettronica e fotodissociazione ultravioletta) possono essere utilizzati solo29. Per aSyn a un pH fisiologico di 7,40, i punti temporali che vanno da 50 ms a 300 s sono più applicabili in quanto coprono l'intera curva di assorbimento del deuterio8.

5. Trattamento dei dati

  1. Caricare il file dei peptidi assegnati spettralmente dagli esperimenti di mappatura dei peptidi. Aprire il menu File e fare clic su Apri nel software DynamX (vedere Tabella dei materiali).
  2. Importare i file raw nel software di misurazione della massa preferito (ad esempio, DynamX, HDExaminer, ecc.). Apri il menu "Dati" e fai clic su MS Files. Fare clic su Nuovo stato per creare stati per ogni condizione proteica studiata.
    1. Fare clic su Nuova esposizione per aggiungere ogni timepoint HDX. Fare clic su Nuovo RAW per importare i file .raw. Trascinare ogni file .raw nella posizione corretta. Fare clic su OK al termine.
  3. Assegna automaticamente prima gli isotopi (questo è automatico dopo il passaggio 5.2. sopra), quindi cura manualmente l'assegnazione isotopica per garantire un'elevata qualità dei dati.
  4. Esportare i dati del cluster in un file .csv con colonne nel seguente ordine: nome della proteina, numero di inizio della sequenza, numero di fine sequenza, sequenza, modifica, frammento, assorbimento massimo possibile, massa delle specie monoisotopiche, nome dello stato, tempo di esposizione, nome del file, carica, tempo di ritenzione, intensità e centroide.
  5. Aprire il menu Dati nel software di misurazione di massa e fare clic su Esporta dati cluster.

6. Analisi dei dati

  1. Caricare i dati del cluster esportati nel software di analisi HDX preferito. Qui, HDfleX viene utilizzato30 (vedi Tabella dei materiali).
  2. Adatta i dati sperimentali per tutti i peptidi e gli stati, selezionando i metodi di correzione dello scambio posteriore appropriati per ottenere costanti di velocità osservate per la reazione HDX.
  3. Calcolare una soglia di significatività globale con il metodo preferito (HDfleX supporta diverse opzioni per questo) ed eseguire test di significatività ibrida per determinare le differenze significative tra gli stati rispetto a31,32.
    NOTA: se la differenza osservata è maggiore della soglia globale e il valore p è inferiore al livello di confidenza scelto (ad esempio, 95%), la differenza è considerata significativa.

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Risultati

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A causa della sua natura intrinsecamente disordinata, è difficile catturare gli intricati cambiamenti strutturali in aSyn a pH fisiologico. HDX-MS monitora lo scambio isotopico a idrogeno ammidico della spina dorsale, sondando le dinamiche e le interazioni conformazionali delle proteine. È una delle poche tecniche per acquisire queste informazioni ad alte risoluzioni strutturali e temporali. Questo protocollo è ampiamente applicabile a una vasta gamma di proteine e condizioni tampone, e questo è esemplificato dalla misur...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nel presente articolo vengono descritte le seguenti procedure: (1) esecuzione di esperimenti di mappatura peptidica su aSyn monomerico per ottenere la massima copertura di sequenza, (2) acquisizione di dati HDX-MS millisecondi su aSyn monomerico in condizioni fisiologiche e (3) esecuzione di analisi dei dati e interpretazione dei dati HDX-MS risultanti. Le procedure fornite sono generalmente semplici da eseguire, ogni esperimento di etichettatura dura in genere solo circa 8 ore per tre repliche e otto punti temporali e l...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NS è finanziato dalla borsa di studio Diamond Jubilee del Consiglio universitario. JJP è supportato da una UKRI Future Leaders Fellowship [Numero di sovvenzione: MR/T02223X/1].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 &volte; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μ m Colonna C18 Waters Corporation186002346Colonna analitica
Acetonitrile HPLC grado >99,9% HiPerSolvVWR20060.420Per fasi mobili LC
CaCl2Sigma AldrichC5670Sale per tamponi HDX
ChronosAxel Semrau (Acquistato da Waters Corporation)667006090Software di pianificazione per abilitare automaticamente più iniezioni di campioni HDX-MS. Il software alternativo è disponibile presso altri fornitori, ad esempio HDXDirector o LEAP Shell
Cloruro di deuterio, Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-2-50Per tamponi di marcatura HDX,
Ossido di deuterio (99,9% D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-4Acqua deuterata
DynamX 3.0Waters Corporation176016027Assegnazione isotopica e calcolo dell'incorporazione del deuterio
Colonna di pepsina BEH Colonna di pepsinaWaters Corporation186007233Colonna di digestione della pepsina
Acido formico, 99,0% di grado LC/MSFisher Scientific 10596814Per le fasi mobili LC
Guanidinium cloridratoSigma AldrichRDD001-500GChaotrope/Denaturante
HDfleXUniversità di ExeterN/Ahttps://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KClSigma AldrichP3911Sale per tamponi HDX
LEAP HDX-2 CTC PAL robot di campionamentoWaters Corporation725000637Robot autocampionatore
Leucina encefalinaWaters Corporation186006013Per la calibrazione lockspray della spettrometria di massa.
MassLynxWaters Corporation667004007Software di controllo dei metodi di ingresso e spettrometro
di massa Fiale di recupero massimoWaters Corporation600000670CVConfezione da 100 con tappi - utilizzati per il vassoio di tempra in LEAP HDX-2
MgCl2Sigma AldrichM8266Sale per tamponi HDX
Millipore 0.22 µ m filtri per siringheMilliporeN9CA7069BFiltri per siringhe
ms2minApplied Photophysics LtdN/Ahdx al millisecondo a miscelazione rapida
NaClSigma AldrichS9888Sale per tamponi HDX
Regolatore di temperatura PeltierLEAP Technologies Inc.HP115-COOL/DControllore Peltier per impostare con precisione la temperatura delle camere nel robot LEAP.
ProteinLynx Global Server 3.0Waters Corporation715001030Software di identificazione dei peptidi. Il software alternativo è disponibile presso altri fornitori.
Tappi per reagentiWaters Corporation186004632confezione da 100
vaschette per reagenti per LEAP HDX-2Waters Corporation186001420confezione da 100 esclusi tappi - utilizzati per tamponi in LEAP HDX-2
Deuterossido di sodio (99,5% in D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-57Per tamponi per marcatura HDX Provette
microcentrifuga con filtro centrifugo (3 kDa MWCO)Amicon (Merck Sigma Aldrich)UFC5003Micro provette da centrifuga per concentrare le proteine. Ciò facilita lo scambio del tampone e il caricamento accurato del campione per gli esperimenti HDX-MS.
Spettrometro di massa Synapt G2-SiWaters Corporation176850035Spettrometro di massa
Fiale a recupero totaleWaters Corporation600000671CVConfezione da 100 con tappi - utilizzati per l'etichettatura del vassoio in LEAP HDX-2
Tris-HCl SigmaAldrichT3253-250GBuffer
Trizma baseSigma AldrichT60040-B2005Buffer
UreaSigma AldrichU5378-1KGChaotrope/Denaturante
VanGuard 2,1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 colonna Waters Corporation186004623Colonna di desalinizzazione Trap
, , , strumento per

Riferimenti

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