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Articolo metodologico

Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di Caenorhabditis dauer

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DOI:

10.3791/64062

⸱

31 maggio 2022

 ,  ,  , 
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo delinea i metodi per condurre un test gravitazionale su larga scala con larve di Caenorhabditis dauer. Questo protocollo consente una migliore rilevazione del comportamento della gravitassi rispetto a un test basato su piastra.

Abstract

La sensazione di gravità è un processo importante e relativamente poco studiato. Il rilevamento della gravità consente agli animali di navigare nell'ambiente circostante e facilita il movimento. Inoltre, la sensazione di gravità, che si verifica nell'orecchio interno dei mammiferi, è strettamente correlata all'udito - quindi, la comprensione di questo processo ha implicazioni per la ricerca uditiva e vestibolare. Esistono saggi di gravitassi per alcuni organismi modello, tra cui Drosophila. I singoli vermi sono stati precedentemente analizzati per la loro preferenza di orientamento mentre si depositano in soluzione. Tuttavia, non è stato descritto un test affidabile e robusto per Caenorhabditis gravitaxis. Il presente protocollo delinea una procedura per l'esecuzione di saggi di gravitasi che possono essere utilizzati per testare centinaia di caenorhabditis alla volta. Questo test su larga scala e a lunga distanza consente una raccolta dettagliata dei dati, rivelando fenotipi che potrebbero non essere rilevati in un test standard basato su piastra. Il movimento Dauer lungo l'asse verticale viene confrontato con i controlli orizzontali per garantire che la polarizzazione direzionale sia dovuta alla gravità. La preferenza gravitattica può quindi essere confrontata tra ceppi o condizioni sperimentali. Questo metodo può determinare i requisiti molecolari, cellulari e ambientali per la gravitassi nei vermi.

Introduzione

Percepire l'attrazione gravitazionale della Terra è cruciale per l'orientamento, il movimento, la coordinazione e l'equilibrio di molti organismi. Tuttavia, i meccanismi molecolari e i neurocircuiti della sensazione di gravità sono poco compresi rispetto ad altri sensi. Negli animali, la sensazione di gravità interagisce e può essere superata da altri stimoli per influenzare il comportamento. Segnali visivi, feedback propriocettivi e informazioni vestibolari possono essere integrati per generare un senso di consapevolezza del corpo rispetto all'ambiente circostante di un animale 1,2. Al contrario, la preferenza gravitattica può essere alterata in presenza di altri stimoli 3,4,5. Pertanto, il comportamento gravitattico è ideale per studiare la sensazione di gravità e comprendere la complessa integrazione sensoriale e il processo decisionale del sistema nervoso.

C. elegans è un organismo modello particolarmente utile per lo studio della gravitassi a causa del suo ciclo di vita polifenico. Se esposte a fattori di stress durante lo sviluppo, tra cui calore, sovraffollamento o mancanza di cibo, le larve di C. elegans si sviluppano in dauers, che sono altamente resistenti allo stress6. Come dauers, i vermi svolgono comportamenti caratteristici, come la nictazione, in cui i vermi "stanno in piedi" sulla coda e agitano la testa, che possono facilitare la dispersione verso habitat migliori7. I saggi di gravitaxis di C. elegans e C. japonica suggeriscono che le larve di dauer gravitassano negativamente e che questo comportamento è più facilmente osservato nei pazienti che negli adulti 8,9. Il test della gravitassi in altri ceppi di Caenorhabditis può rivelare variazioni naturali nel comportamento gravitattico.

I meccanismi per la sensazione di gravità sono stati caratterizzati in Euglena, Drosophila, Ciona e varie altre specie usando i saggi di gravitaxis 3,10,11. Nel frattempo, gli studi sulla gravitaxis a Caenorhabditis inizialmente hanno fornito risultati contrastanti. Uno studio sulla preferenza orientativa di C. elegans ha scoperto che i vermi si orientano a testa bassa in soluzione, suggerendo una preferenza gravitattica positiva12. Nel frattempo, sebbene i dauers di C. japonica siano stati identificati precocemente come gravitattici negativi8, questo comportamento è stato descritto solo recentemente in C. elegans9. Diverse sfide sorgono nello sviluppo di un saggio di gravitaxis rappresentativo nei vermi. I ceppi di Caenorhabditis sono mantenuti su piastre di agar; Per questo motivo, i saggi comportamentali utilizzano tipicamente piastre di agar come parte del loro disegno sperimentale13,14,15. Il primo test di gravitassi riportato in Caenorhabditis è stato eseguito posizionando una piastra su un lato con un angolo di 90 ° rispetto alla piastra di controllo orizzontale8. Tuttavia, il comportamento della gravitassi non è sempre robusto in queste condizioni. Mentre i vermi adulti possono essere saggiati per la preferenza orientativa nella soluzione12, questa preferenza direzionale può anche essere dipendente dal contesto, portando a comportamenti diversi se i vermi strisciano piuttosto che nuotare. Inoltre, C. elegans è sensibile ad altri stimoli, tra cui la luce e i campi elettromagnetici16,17, che interferiscono con le loro risposte alla gravità9. Pertanto, un test di gravitassi aggiornato che scherma contro altre variabili ambientali è importante per sezionare i meccanismi di questo processo sensoriale.

Nel presente protocollo viene descritto un saggio per l'osservazione della Caenorhabditis gravitaxis. La configurazione di questo studio si basa in parte su un metodo sviluppato per studiare l'integrità neuromuscolare18,19. Le larve di Dauer sono coltivate e isolate con procedure standard20. Vengono quindi iniettati in camere costituite da due pipette sierologiche da 5 ml riempite con agar. Queste camere possono essere orientate verticalmente o orizzontalmente e posizionate all'interno di una gabbia di Faraday buia per 12-24 ore per schermare dalla luce e dai campi elettromagnetici. La posizione di ciascun verme nelle camere viene registrata e confrontata con i taxi verticali di un ceppo di riferimento come C. elegans N2.

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Protocollo

I ceppi utilizzati nel presente studio sono C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (vedi tabella dei materiali). Per ogni test è stata utilizzata una popolazione mista di dauers.

1. Preparazione della camera

  1. Lavora in una cappa aspirante. Impostare l'area di lavoro con un bruciatore Bunsen, 1-2 lamette da barba, pinze, pinzette e una superficie di taglio in plastica (vedere Tabella dei materiali).
  2. Per ogni camera, raccogliere due pipette sierologiche da 5 ml. Rimuovere il tappo di cotone da una pipetta con una pinzetta. Tenere una lametta sul bruciatore Bunsen fino a quando non è caldo usando le pinze. Utilizzare la lama riscaldata per tagliare l'estremità affusolata della seconda pipetta in modo che l'intera pipetta abbia un diametro uniforme (Figura 1A).
  3. Lavorando rapidamente, avvicinare le due estremità della pipetta modificate alla fiamma, sciogliendole leggermente. Unire queste estremità premendole saldamente insieme, assicurandosi che le pareti di entrambe le pipette siano continue. Se dopo l'unione sono visibili degli spazi vuoti, spezzarli e ripetere questo passaggio (Figura 1A,B).

2. Riempire le camere con agar

  1. Preparare NGM con agar al 4% secondo le procedure standard di vite senza fine21. Mentre l'agar è ancora fuso, riempire ogni camera collegandola ad un pipettor sierologico e aspirando lentamente la soluzione. Sigillare la punta con pellicola di paraffina prima di rimuovere la camera dal pipettatore. Appoggiare la camera piatta (parallela al piano di lavoro) per raffreddare.
    NOTA: Coprire il matraccio con pellicola trasparente (vedere Tabella dei materiali) dopo l'autoclave aiuta a prevenire la formazione di bolle nella soluzione18.
    1. Per ridurre al minimo eventuali variazioni nella consistenza dell'agar dovute a un raffreddamento irregolare, tenere il pipettatore (vedere la tabella dei materiali) parallelo al piano del banco mentre si disegna l'agar. Appoggiare le camere piatte sul piano di lavoro e lasciare che l'agar si indurisca prima di muoversi.
      NOTA: la percentuale di agar e il contenuto multimediale possono essere adattati all'esperimento. L'agar al 4% è più rigido della concentrazione di circa il 2% utilizzata per il versamento delle piastre e impedisce ai vermi di scavare attraverso il mezzo nelle nostre mani. Tuttavia, altri sperimentatori hanno osservato il comportamento di scavare da parte di vermi adulti fino al 9% di agar18,19.
  2. Una volta raffreddato, riscaldare una chiave esagonale da 3 mm (o un altro strumento metallico delle stesse dimensioni, vedi Tabella dei materiali) su un bruciatore Bunsen. Premerlo saldamente nella parete di ciascuna camera a circa 5 mm da un lato della linea mediana, creando una piccola apertura nella plastica (Figura 1C). Utilizzare una lama riscaldata per rimuovere il cotone e le estremità affusolate della camera e sigillare queste estremità con pellicola di paraffina.
    NOTA: Una volta preparata, ogni camera deve essere utilizzata entro 1 giorno o mantenuta a 4 °C per diversi giorni. Coprire eventuali aperture esposte con pellicola di paraffina per evitare che l'agar si secchi.

3. Larve di dauer isolanti

  1. 10-15 giorni prima dell'esperimento, suddividere ogni ceppo su 2-3 grandi piastre NGM con batteri OP50 e avvolgere con pellicola di paraffina. Dopo 10-15 giorni, ogni piatto deve essere completamente affamato con migliaia di larve di dauer presenti sull'agar, sulle pareti e sui coperchi.
    NOTA: Prepara i piatti in anticipo usando una ricetta OP50 spessa per il massimo affollamento (vedi Tabella dei materiali). La formazione di Dauer può anche essere indotta attraverso altri metodi, tra cui l'aggiunta di feromoni o crescendo a temperature più elevate22.
  2. Raccogliere i vermi sciacquando i coperchi e le piastre con tampone M9 e pipettando la soluzione in provette da centrifuga da 15 ml. Girare a 1.600 x g per 30-60 s a temperatura ambiente e aspirare la maggior parte del tampone M9 con una pipetta o un aspiratore a vuoto.
  3. Isolare i pazienti trattando con SDS all'1% seguito da un gradiente di flottazione del 30% di saccarosio seguendo il rapporto20 precedentemente pubblicato.
    1. Aggiungere 7 mL di soluzione SDS all'1% a ciascun pellet di verme. Lasciare i worm in SDS per 30 minuti; Ruotare continuamente i tubi durante questo periodo per consentire l'aerazione. Risciacquare 3-5 volte con M9 per rimuovere il detergente.
    2. Quindi, aggiungere 5 ml di M9 seguiti da 5 ml di soluzione fredda filtrata al 60% di saccarosio. Mescolare accuratamente, quindi centrifugare a 1.600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per creare un gradiente di separazione.
  4. Riempire le nuove provette da centrifuga da 15 mL con 2 mL di tampone M9. Schiacciare le estremità delle pipette Pasteur di vetro per allargare il foro e utilizzare queste pipette per trasferire lo strato superiore della soluzione (contenente dauers isolati) dal gradiente di saccarosio ai nuovi tubi. Risciacquare i dauers 3-5x con M9.
    NOTA: Ci saranno migliaia di dauers isolati in soluzione a questo punto. Possono essere utilizzati immediatamente o mantenuti aerati ruotando in 5-7 mL M9 durante la notte.

4. Aggiunta di dauers alla camera

  1. Centrifugare a 1.600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare la maggior parte della soluzione M9 con una pipetta o un aspiratore a vuoto. Per stimare la densità dei vermi, contare manualmente il numero di vermi in tre goccioline separate da 1 μL al microscopio da dissezione. Utilizzare la media di questi conteggi per approssimare il numero di vermi per μL.
    NOTA: alcuni pipettatori di piccolo volume potrebbero non essere in grado di raggiungere il fondo di una provetta da centrifuga da 15 ml; In questo caso, una goccia concentrata di vermi può essere trasferita prima su un pezzo di film di paraffina.
  2. Tagliare l'estremità di una punta di pipetta da 10, 20 o 200 μL per allargare il foro. Impostare la micropipetta su un volume leggermente maggiore rispetto al volume di aspirazione previsto. Aspirare circa 1-2 μL della soluzione concentrata di vite senza fine (idealmente tra 100-300 vermi) e lasciare entrare una piccola quantità di aria nella punta.
    NOTA: Un gran numero di worm (1.000+) in una camera può aumentare la gamma di distanze percorse a causa del sovraffollamento9.
  3. Spingere delicatamente la punta della pipetta nell'agar mentre si preme la micropipetta. Questo creerà un sito di iniezione nell'agar senza intasare la punta. Rilascia i vermi nell'agar. Utilizzare la pellicola di paraffina per sigillare l'apertura.

5. Esecuzione e assegnazione del punteggio del test

NOTA: La gravitassi può essere testata in varie condizioni che possono influenzare il comportamento9.

  1. Per eliminare il maggior numero possibile di variabili, posizionare le camere all'interno di una gabbia di Faraday buia (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente.
  2. Etichettare ogni camera e appenderla verticalmente all'interno della gabbia di Faraday (eseguire questa operazione utilizzando nastro adesivo). Testare i controlli orizzontali contemporaneamente posizionando alcune camere piatte nelle stesse condizioni ambientali. Testare i ceppi sperimentali contro i vermi N2 orientati verticalmente come controllo positivo. Utilizzare camere orientate orizzontalmente contenenti Dauers N2 come controllo negativo aggiuntivo.
    NOTA: I saggi orizzontali e verticali devono essere eseguiti nello stesso ambiente all'interno del laboratorio per ridurre al minimo la variabilità ambientale tra le due condizioni. Una grande incubatrice può essere utilizzata per ospitare entrambe le gabbie di Faraday.
  3. I Dauer iniziano a disperdersi dal sito di partenza dopo poche ore e impiegano diverse ore per raggiungere entrambe le estremità della camera. Lasciare le camere indisturbate durante questo periodo e segnare entro 12-24 ore dopo l'iniezione.
    NOTA: Non utilizzare un paralitico (come l'azoturo di sodio) per immobilizzare i vermi che hanno raggiunto le estremità delle camere. Poiché viene misurata la distribuzione complessiva dei vermi invece di un indice di preferenza (come in un test a due scelte), l'azoturo di sodio non è necessario e può alterare i risultati.
  4. Rimuovere e segnare le camere gravitaxis una alla volta. Cerca i dauers vivi al microscopio da dissezione e segna le loro posizioni con l'inchiostro (Figura 1C, D). Non segnare i vermi entro 2,5 cm da entrambi i lati del sito di iniezione, poiché è improbabile che questi vermi dimostrino una preferenza direzionale.
    1. Inoltre, evitare di segnare vermi che sembrano morti o sono intrappolati nel liquido. Eliminare eventuali camere contenenti >50% di vermi morti o nuotatori.
      NOTA: una volta che la camera è stata rimossa dall'area di prova, deve essere valutata prontamente per la precisione. I dauer devono essere visibili solo tra la superficie dell'agar e la parete della pipetta. Se si osserva un comportamento di scavatura, considerare l'aumento della concentrazione di agar nei test futuri.
  5. Per quantificare i risultati, utilizzare un marcatore per dividere ciascuna metà della camera in sette sezioni di 3,5 cm a partire da 2,5 cm di distanza dal sito di iniezione (su alcune pipette, 3,5 cm = 1 mL di volume). Utilizzare un contatore di conteggio manuale (vedere Tabella dei materiali) per calcolare il numero di vermi osservati in ogni sezione.
    NOTA: ci dovrebbero essere sette sezioni su ciascun lato dell'origine, che possono essere numerate da -7 (in basso) a +7 (in alto). Questi numeri devono corrispondere alle stesse posizioni relative in base a come sono state costruite le camere; L'agar viene estratto dall'estremità -7 all'estremità +7 nel passaggio 2.

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Risultati

Confronto tra gravitassi tra specie
Seguendo la procedura sopra descritta, C. briggsae dauer gravitaxis può essere confrontato con C. elegans gravitaxis e controlli orizzontali. La distribuzione verticale (marrone) dei dauers di C. briggsae è inclinata verso le sommità delle camere, con una grande percentuale di vermi che raggiunge +7 (Figura 2A). In contrasto con i controlli orizzontali (aqua), in cui i dauers sono distribuiti in una curva appr...

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Discussione

Confronto con i metodi precedenti
A differenza della chemiotassi, la gravitassi in Caenorhabditis non può essere osservata in modo affidabile utilizzando un tradizionale progetto sperimentale di piastra di agar. Una capsula di Petri standard ha un diametro di 150 mm, risultando in soli 75 mm disponibili in entrambe le direzioni per i dauers per dimostrare la preferenza per la gravitaxi. Sebbene la preferenza orientativa di C. elegans possa essere saggiata nella soluzione

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta da borse di ricerca del National Institutes of Health al JHR (#R01 5R01HD081266 e #R01GM141493). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). Vorremmo ringraziare Pradeep Joshi (UCSB) per il suo contributo editoriale. Consulenza statistica fornita dall'UCSB DATALAB.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di sodio dodecil solfatoall'1% Da magazzino 10% (p/v) SDS in acqua deionizzata
15 ml Provette da centrifugaFalcon14-959-53A
ChiavePossono essere utilizzati altri strumenti metallici di dimensioni simili 4
% di agar in terreno di crescita normale (NGM) - 1 LPrima della sterilizzazione in autoclave: 3 g di NaCl, 40 g di Agar, 2,5 g di peptone, 2 g di destrosio, 10 ml di uracile (2 mg/mL), 500 μ L Colesterolo (10 mg/mL), 1 mL di CaCl2, 962 mL di acqua deionizzata; Dopo la sterilizzazione in autoclave: 24,5 mL di tampone fosfato, 1 mL di 1 MgSO4 (1 M), 1 mL di streptomicina (200 mg/mL)
5 mL di pipette sierologicheFisherbrandS68228CPolistirene, non di vetro borosilicato
60% Soluzione fredda di saccarosio60% saccarosio (p/v) in acqua deionizzata; sterilizzare per filtrazione (0,45 μ m filtro). Mantieni a 4 ° C
AF16 C. briggsae o altro ceppoDisponibile presso il CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bruciatore
Involucro trasparenteFisherbrand22-305654
Centrifuga
Lamette da barba monousoFisherbrand12-640
FaradayPuò essere costruita utilizzando cartone e fogli di alluminio; 30" L x 6" L x 26" H o più grandi
PennarelliSharpie o di altra marca per la marcatura su plastica
Nastro adesivoCarolina215620
M9 tampone22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans ceppolaDisponibile presso il CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Piastre NGM con agar OP501,7% (p/v) in NGM (vedi descrizione: 4% agar in NGM). Seme con film di paraffina OP50
Bemis13-374-10
Tagliere
Pinze
Miscelatore verticale rotanteBTLab SYSTEMSBT913Con barra provetta 22 x 15 mL
Pipettatore sierologicoCorning357469
StereomicroscopioLaxcoS2103LS100
Contatore di conteggioULINEH-7350
Terreni spessi per piastre NGM/agar - 1 LVedere il 4% di agar nella ricetta NGM; sostituire 40 g di agar con 20 g
di pinzette
esagonale da 3 mm sperimentale BunsenclinicaGabbia di a inchiostro in plastica per agar

Riferimenti

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