Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di Caenorhabditis dauer

Sommario

Il presente protocollo delinea i metodi per condurre un test gravitazionale su larga scala con larve di Caenorhabditis dauer. Questo protocollo consente una migliore rilevazione del comportamento della gravitassi rispetto a un test basato su piastra.

Abstract

La sensazione di gravità è un processo importante e relativamente poco studiato. Il rilevamento della gravità consente agli animali di navigare nell'ambiente circostante e facilita il movimento. Inoltre, la sensazione di gravità, che si verifica nell'orecchio interno dei mammiferi, è strettamente correlata all'udito - quindi, la comprensione di questo processo ha implicazioni per la ricerca uditiva e vestibolare. Esistono saggi di gravitassi per alcuni organismi modello, tra cui Drosophila. I singoli vermi sono stati precedentemente analizzati per la loro preferenza di orientamento mentre si depositano in soluzione. Tuttavia, non è stato descritto un test affidabile e robusto per Caenorhabditis gravitaxis. Il presente protocollo delinea una procedura per l'esecuzione di saggi di gravitasi che possono essere utilizzati per testare centinaia di caenorhabditis alla volta. Questo test su larga scala e a lunga distanza consente una raccolta dettagliata dei dati, rivelando fenotipi che potrebbero non essere rilevati in un test standard basato su piastra. Il movimento Dauer lungo l'asse verticale viene confrontato con i controlli orizzontali per garantire che la polarizzazione direzionale sia dovuta alla gravità. La preferenza gravitattica può quindi essere confrontata tra ceppi o condizioni sperimentali. Questo metodo può determinare i requisiti molecolari, cellulari e ambientali per la gravitassi nei vermi.

Introduzione

Percepire l'attrazione gravitazionale della Terra è cruciale per l'orientamento, il movimento, la coordinazione e l'equilibrio di molti organismi. Tuttavia, i meccanismi molecolari e i neurocircuiti della sensazione di gravità sono poco compresi rispetto ad altri sensi. Negli animali, la sensazione di gravità interagisce e può essere superata da altri stimoli per influenzare il comportamento. Segnali visivi, feedback propriocettivi e informazioni vestibolari possono essere integrati per generare un senso di consapevolezza del corpo rispetto all'ambiente circostante di un animale ^1,2. Al contrario, la preferenz....

Protocollo

I ceppi utilizzati nel presente studio sono C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (vedi tabella dei materiali). Per ogni test è stata utilizzata una popolazione mista di dauers.

1. Preparazione della camera

1. Lavora in una cappa aspirante. Impostare l'area di lavoro con un bruciatore Bunsen, 1-2 lamette da barba, pinze, pinzette e una superficie di taglio in plastica (vedere Tabella dei materiali).
2. Per ogni camera, raccogliere due pipette sierologiche da 5 ml. Rimuovere il tappo di cotone da una pipetta con una pinzetta. Tenere una lametta sul bruciatore B....

Risultati

Confronto tra gravitassi tra specie
Seguendo la procedura sopra descritta, C. briggsae dauer gravitaxis può essere confrontato con C. elegans gravitaxis e controlli orizzontali. La distribuzione verticale (marrone) dei dauers di C. briggsae è inclinata verso le sommità delle camere, con una grande percentuale di vermi che raggiunge +7 (Figura 2A). In contrasto con i controlli orizzontali (aqua), in cui i dauers sono distribuiti in una curva appr.......

Discussione

Confronto con i metodi precedenti
A differenza della chemiotassi, la gravitassi in Caenorhabditis non può essere osservata in modo affidabile utilizzando un tradizionale progetto sperimentale di piastra di agar. Una capsula di Petri standard ha un diametro di 150 mm, risultando in soli 75 mm disponibili in entrambe le direzioni per i dauers per dimostrare la preferenza per la gravitaxi. Sebbene la preferenza orientativa di C. elegans possa essere saggiata nella soluzione

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di sodio dodecil solfato			all'1% Da magazzino 10% (p/v) SDS in acqua deionizzata
15 ml Provette da centrifuga	Falcon	14-959-53A
Chiave			Possono essere utilizzati altri strumenti metallici di dimensioni simili 4
% di agar in terreno di crescita normale (NGM) - 1 L			Prima della sterilizzazione in autoclave: 3 g di NaCl, 40 g di Agar, 2,5 g di peptone, 2 g di destrosio, 10 ml di uracile (2 mg/mL), 500 μ L Colesterolo (10 mg/mL), 1 mL di CaCl2, 962 mL di acqua deionizzata; Dopo la sterilizzazione in autoclave: 24,5 mL di tampone fosfato, 1 mL di 1 MgSO4 (1 M), 1 mL di streptomicina (200 mg/mL)
5 mL di pipette sierologiche	Fisherbrand	S68228C	Polistirene, non di vetro borosilicato
60% Soluzione fredda di saccarosio			60% saccarosio (p/v) in acqua deionizzata; sterilizzare per filtrazione (0,45 μ m filtro). Mantieni a 4 ° C
AF16 C. briggsae o altro ceppo			Disponibile presso il CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bruciatore
Involucro trasparente	Fisherbrand	22-305654
Centrifuga
Lamette da barba monouso	Fisherbrand	12-640
		Faraday	Può essere costruita utilizzando cartone e fogli di alluminio; 30" L x 6" L x 26" H o più grandi
Pennarelli			Sharpie o di altra marca per la marcatura su plastica
Nastro adesivo	Carolina	215620
M9 tampone			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans ceppola			Disponibile presso il CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Piastre NGM con agar OP50			1,7% (p/v) in NGM (vedi descrizione: 4% agar in NGM). Seme con film di paraffina OP50
	Bemis	13-374-10
Tagliere
Pinze
Miscelatore verticale rotante	BTLab SYSTEMS	BT913	Con barra provetta 22 x 15 mL
Pipettatore sierologico	Corning	357469
Stereomicroscopio	Laxco	S2103LS100
Contatore di conteggio	ULINE	H-7350
Terreni spessi per piastre NGM/agar - 1 L			Vedere il 4% di agar nella ricetta NGM; sostituire 40 g di agar con 20 g
di pinzette

esagonale da 3 mm sperimentale BunsenclinicaGabbia di a inchiostro in plastica per agar