CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

Vigneshwaran Venkatesan; Abisha Crystal Christopher; Karthik V. Karuppusamy; Prathibha Babu; Manoj Kumar K. Alagiri; Saravanabhavan Thangavel

doi:10.3791/64064

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Articolo metodologico

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

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DOI:

10.3791/64064

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9 agosto 2022

Vigneshwaran Venkatesan^*¹^,² , Abisha Crystal Christopher^*¹^,³ , Karthik V. Karuppusamy¹^,² , Prathibha Babu¹^,² , Manoj Kumar K. Alagiri¹^,² , Saravanabhavan Thangavel¹

¹Centre for Stem Cell Research (CSCR), A unit of InStem Bengaluru, Christian Medical College campus, ²Manipal Academy of Higher Education, ³Thiruvalluvar University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

Abstract

CRISPR / Cas9 è uno strumento di editing genetico altamente versatile ed efficiente adottato ampiamente per correggere varie mutazioni genetiche. La fattibilità della manipolazione genica delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) in vitro rende le HSPC una cellula bersaglio ideale per la terapia genica. Tuttavia, le HSPC perdono moderatamente il loro potenziale di attecchimento e ripopolamento multilineare in coltura ex vivo . Nel presente studio sono descritte condizioni di coltura ideali che migliorano l'attecchimento di HSPC e generano un aumento del numero di cellule geneticamente modificate in vivo. Il rapporto attuale mostra le condizioni di coltura in vitro ottimizzate, tra cui il tipo di terreno di coltura, l'integrazione unica di cocktail di piccole molecole, la concentrazione di citochine, le piastre di coltura cellulare e la densità di coltura. Inoltre, viene fornita una procedura ottimizzata di modifica genetica HSPC, insieme alla convalida degli eventi di modifica genetica. Per la convalida in vivo , vengono visualizzati l'infusione di HSPCs geneticamente modificata e l'analisi post-attecchimento nei destinatari di topo. I risultati hanno dimostrato che il sistema di coltura ha aumentato la frequenza delle HSC funzionali in vitro, con conseguente robusto attecchimento di cellule geneticamente modificate in vivo.

Introduzione

L'inaccessibilità ai donatori compatibili con l'antigene leucocitario umano (HLA) in contesti di trapianto allogenico e il rapido sviluppo di strumenti di ingegneria genetica altamente versatili e sicuri rendono il trapianto di cellule staminali ematopoietiche autologhe (HSCT) una strategia di trattamento curativo per le malattie ereditarie del sangue ^1,2. La terapia genica con cellule staminali e progenitrici ematopoietiche autologhe (HSPC) comporta la raccolta di HSPC dei pazienti, la manipolazione genetica, la correzione delle mutazioni che causano malattie e il trapianto di HSPC geneticamente corretti nel ....