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Articolo metodologico

Isolamento e coltura di tre tipi di cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale

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⸱

DOI:

10.3791/64065

⸱

23 agosto 2022

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di cellule staminali mesenchimali dalle arterie del cordone ombelicale, dalla vena e dalla gelatina di Wharton.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale (UC-MSC) sono un'importante fonte di cellule per la medicina rigenerativa. Le UC-MSC possono essere isolate dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale, così come dalle arterie ombelicali e dalla vena ombelicale. Sono conosciute come cellule staminali perivascolari ottenute dalle arterie ombelicali (UCA-PSC), cellule staminali perivascolari ottenute dalla vena ombelicale (UCV-PSCs) e cellule staminali mesenchimali ottenute dalla gelatina di Wharton (WJ-MSCs). UCA-PSC e UCV-PSC sono periciti derivati da regioni perivascolari che sono progenitori delle MSC. L'isolamento e la coltura dei tre tipi di cellule è una fonte importante per lo studio del trapianto e della riparazione di cellule staminali. Il presente protocollo si concentra sull'isolamento e la coltura di cellule attraverso la separazione meccanica, la coltura aderente e il crawling delle cellule. Attraverso questa tecnica, è possibile derivare i tre diversi tipi di cellule staminali. I marcatori della superficie cellulare sono stati rilevati mediante citometria a flusso. Le cellule staminali sono state rilevate per il potenziale di differenziazione multilineage mediante differenziazione adipogenica, osteogenica e neurale-simile, che è coerente con il fenotipo delle MSC. Questo protocollo sperimentale espande l'origine delle UC-MSC. Inoltre, il metodo di isolamento cellulare fornisce una base per ulteriori studi sulla medicina rigenerativa e altre applicazioni.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (UC-MSC) sono ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa a causa del loro funzionamento non invasivo, della bassa immunogenicità e dell'assenza di controversie etiche1. In molti studi, le UC-MSC isolate dalla gelatina di Wharton (WJ) possono attaccarsi alla parete, subire una multi-differenziazione ed esprimere marcatori di cellule staminali mesenchimali (MSC)2. Tuttavia, quasi tutte le MSC originano dalla regione perivascolare3. I periciti, come sottoinsieme delle cellule perivascolari, sono cellule progenitrici delle MSC4. Pertanto, le UC-MSC possono essere isolate dal cordone ombelicale WJ, dalle arterie ombelicali (UCA) e dalla vena ombelicale (UCV), note rispettivamente come UCA-PSC, UCV-PSCs e WJ-MSCs5. Questo metodo mirava a isolare e coltivare i tre diversi tipi di cellule staminali. L'isolamento e la cultura di UCA-PSC, UCV-PSC, e WJ-MSC sono molto importanti per fornire più fonti di MSC.

Il presente studio descrive l'isolamento, la coltura e l'applicazione futura di UCA-PSC, UCV-PSC e WJ-MSC, che hanno adesione cellulare, esprimono i marcatori delle MSC e hanno una differenziazione multidirezionale. Le cellule staminali isolate sono state osservate al microscopio e sottoposte a coltura cellulare, passaggio cellulare, crioconservazione cellulare e recupero cellulare. La logica alla base dell'uso di questa tecnica era che le cellule strisciavano fuori dal tessuto. Rispetto al metodo precedente, come la citometria a flusso o le tecniche di microsfere immunomagnetiche, che erano complesse e costose6, le US-MSC possono essere isolate in modo massivo con il metodo della separazione aderente e del crawling cellulare; Questi sono stati utilizzati nello studio precedente5. L'analisi della citometria a flusso è stata eseguita sulle cellule staminali derivate per rilevare se queste cellule esprimono marcatori MSC. La differenziazione multidirezionale delle cellule staminali è stata introdotta per rilevare se i tre tipi di cellule hanno il potenziale per differenziarsi in adipociti, osteoblasti e neuroblasti. L'isolamento e la coltura di tre tipi di cellule staminali dal cordone ombelicale sono stati importanti nell'uso clinico e utili per i ricercatori per diverse applicazioni future.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico per la Ricerca Clinica, Terzo Ospedale Affiliato, Università di Soochow. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai soggetti umani. Gli individui con parto vaginale a termine o taglio cesareo sono stati inclusi nel presente studio per ottenere il cordone ombelicale. Il cordone ombelicale proviene da neonati sani senza pregiudizi di genere. Il neonato aveva un punteggio di Apgar di 8-10. Il punteggio di Apgar è un test rapido per i neonati somministrato subito dopo la nascita. Questo test controlla il tono muscolare, la frequenza cardiaca e altri segni del bambino per vedere se sono necessarie ulteriori cure mediche o di emergenza7. D'altra parte, i pazienti con malattie importanti, come cuore, fegato, reni o altre malattie infettive, sono stati esclusi dal presente studio.

1. Raccolta del cordone ombelicale umano

  1. Immergere il cordone ombelicale del neonato in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e trasportarlo a 4 °C.
    NOTA: Nel presente studio sono stati utilizzati tre cordoni ombelicali di tre donatori.
  2. Rimuovere immediatamente il sangue del cordone ombelicale in condizioni sterili e tagliare lungo l'asse lungo dei vasi sanguigni in 20 cm di cordone ombelicale. Separare i 20 cm appropriati delle arterie ombelicali e della vena e rimuovere con cura la gelatina di Wharton sulla superficie.
    NOTA: Le colture di espianti sono state ottenute da ciascuna regione, tritate in piccoli pezzi (1-2 mm3) per evitare la contaminazione incrociata tra i tre tipi di cellule staminali.
  3. Tagliare le arterie ombelicali, la vena e la gelatina di Wharton a una dimensione di 1-2 mm3 e inocularli in piastre di coltura cellulare da 100 mm. Eseguire l'inoculazione delle arterie ombelicali, della vena e della gelatina di Wharton utilizzando una pinzetta seguendo un rapporto precedentemente pubblicato5. Non prerivestire le piastre di coltura da 100 mm.
    NOTA: L'intervallo tra le arterie ombelicali, la vena o la gelatina di Wharton era di circa 1 cm. Un tempo di raccolta troppo lungo prima di separare le cellule può influire sulla vitalità e sulla quantità delle cellule. Si consiglia di separare immediatamente le arterie e la vena dal cordone ombelicale. Il tempo di raccolta è stato fino a 4 ore.

2. Isolamento e coltura di UCA-PSC, UCV-PSC e WJ-MSC

  1. Posizionare le piastre di coltura cellulare capovolte per 3 ore in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per garantire che le arterie ombelicali, la vena e il tessuto gelatinoso di Wharton si attacchino saldamente alle piastre di coltura cellulare prima di aggiungere il terreno di coltura.
    1. Dopo 3 ore, riportare le piastre di coltura cellulare in posizione normale. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura cellulare (LG-DMEM, 10% FBS, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina, vedere Tabella dei materiali) al piatto di coltura cellulare.
  2. Aggiungere 3 mL e 2 mL di terreno di coltura nella piastra di coltura cellulare rispettivamente il 3° e il 7° giorno della prima settimana. Fare attenzione a non toccare i blocchi di tessuto delle arterie del cordone ombelicale, della vena e della gelatina di Wharton.
  3. Cambiare metà del mezzo liquido due volte nella seconda settimana e l'intero mezzo liquido due volte nella terza settimana.
  4. Osservare le cellule che strisciano fuori dai blocchi di tessuto a circa 7 giorni dopo la coltura, quindi scartare i blocchi di tessuto quando le cellule sono fuse all'80% a ~2 settimane.
    1. Quando le cellule sono fuse al 100%, farle passare in un rapporto di 1:3 con 2 mL di tripsina allo 0,05% dopo centrifugazione a 600 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Le cellule primarie isolate da un cordone ombelicale erano circa 2 x 106 UCA-PSC, 1 x 106 UCV-PSC e 2 x 106 WJ-MSC. I 2 x 106 UCA-PSCs, 1 x 106 UCV-PSCs e 2 x 106 WJ-MSCs sono stati isolati da 20 cm di cordone ombelicale. Le cellule sono strisciate fuori in tutti e tre i cordoni ombelicali, il che indicava che i risultati tra gli isolamenti erano ripetibili.
    2. Seminare le cellule, mantenendo una concentrazione di 5 x 105/100 cm2 nella piastra di coltura. Conservare le 5 x 105 cellule in 1 mL di soluzione di crioconservazione (90% FBS, 10% DMSO). Nel presente studio sono state utilizzate cellule dal terzo al quinto passaggio.

3. Rilevamento di marcatori di superficie delle MSC mediante citometria a flusso

  1. Digerire le cellule di terza generazione con lo 0,05% di tripsina per ottenere una sospensione a cellula singola. Centrifugare le cellule a 600 x g per 4 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante cellulare utilizzando una pipetta Pasteur. Quindi risospendere 1 x 105 cellule in 100 μL di PBS (1% FBS). Valuta il numero di cellule contando le cellule utilizzando un emocitometro a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato8.
  2. Incubare le cellule 1 x 105 con vari anticorpi ficoeritrina contro CD13 (FITC, 0,1 mg/mL), CD34 (FITC, 0,1 mg/mL), CD45 (FITC, 0,1 mg/mL), CD73 (FITC, 0,1 mg/mL) e HLA-DR (FITC, 0,1 mg/mL) al buio per 30 minuti. Per i controlli, incubare 1 x 105 cellule con FITC-IgG (FITC Mouse Anti-Human IgG, 0,1 mg/mL) (vedere la Tabella dei Materiali).
  3. Centrifugare le cellule a 600 x g per 4 minuti a temperatura ambiente, quindi scartare il surnatante cellulare utilizzando una pipetta Pasteur. Risospendere 1 x 105 cellule in 500 μL di PBS (1% FBS), rilevare mediante citometria a flusso e analizzare con FlowJo2 (vedere la Tabella dei materiali).

4. Differenziazione di UCA-PSC, UCV-PSC e WJ-MSC in adipociti

  1. Inoculare le cellule di terza generazione in piastre da 24 pozzetti a una densità di 6 x 104 cellule/cm2 con 500 μL di terreno cellulare (LG-DMEM, 10% FBS, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina, vedere la Tabella dei materiali) per pozzetto in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C.
  2. Cambiare il terreno cellulare dopo 24 ore e cambiare il gruppo di controllo in terreno cellulare (LG-DMEM, 10% FBS, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Condurre gli esperimenti dopo che le celle sono state fuse all'80% in piastre a 24 pozzetti.
    NOTA: Le cellule dei gruppi che hanno indotto l'adipogenesi sono state modificate in un mezzo di induzione adipogenico (kit di differenziazione adipogenica, vedi Tabella dei materiali). Il mezzo delle cellule in entrambi i gruppi è stato cambiato ogni 3 giorni.
  3. Osservare le goccioline lipidiche nelle cellule a circa 21 giorni dall'induzione nel gruppo di induzione adipogenica e quindi terminare l'induzione adipogenica.
    NOTA: Il terreno adipogenico è stato sostituito dal terreno di coltura cellulare per terminare l'induzione adipogenica 2,5. Inoltre, le cellule del gruppo di controllo non hanno mostrato cambiamenti significativi.
  4. Lavare le celle tre volte con PBS per 5 minuti e poi fissare con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le celle tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
  5. Scartare il PBS e asciugare le celle a temperatura ambiente per circa 20 minuti. Quindi, aggiungere 500 μL di soluzione di olio rosso O (0,5%) (vedi Tabella dei materiali) al pozzetto per 10 minuti.
  6. Rimuovere la soluzione di olio rosso O e lavare le celle con PBS tre volte per 5 minuti ciascuna. Osserva le cellule al microscopio.

5. Differenziazione delle cellule staminali in osteoblasti

  1. Introdurre 500 μl di gelatina allo 0,1% (vedere la Tabella dei materiali) per pozzetto in piastre di coltura a 24 pozzetti e gettarla via dopo 30 minuti.
  2. Inoculare 6 x 104/cm2 di cellule di terza generazione in piastre di coltura a 24 pozzetti e aggiungere 500 μL di terreno di coltura cellulare o di induzione osteogenica (kit di differenziazione osteogenica, vedere la tabella dei materiali) a ciascun pozzetto in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C. Nel gruppo di controllo, cambiare il terreno di coltura cellulare ogni 3 giorni, sostituendo anche il terreno di induzione osteogenica nel gruppo di differenziazione osteogenica ogni 3 giorni.
  3. Dopo 3-4 settimane, verificare la presenza di depositi di calcio nero nelle cellule. Lavare il pozzetto con PBS tre volte per 5 minuti ciascuna.
  4. Fissare le celle a temperatura ambiente con paraformaldeide al 4% per 15 min e lavare con PBS tre volte per 5 min ciascuna. Aggiungere la soluzione colorante rossa di alizarina (1%) al pozzetto per 20 minuti a temperatura ambiente, quindi scartarla.
  5. Dopo l'essiccazione per 30 minuti a temperatura ambiente, osservare le cellule al microscopio.

6. Differenziazione delle cellule staminali in neuroni

  1. Inoculare le 6 x 10cellule da 4/cm2 di terza generazione in piastre di coltura da 24 pozzetti, dove sono stati sostituiti i vetrini di copertura sterili trattati con L-polilisina. Posizionare i fogli rampicanti delle cellule (vedi Tabella dei materiali) nelle piastre a 24 pozzetti per differenziare le cellule in neuroni. Coltiva le cellule sui fogli di rampicamento cellulare.
  2. Quindi, aggiungere 500 μL di terreno di coltura cellulare al pozzetto e sostituire il terreno di coltura cellulare con 500 μL di terreno di induzione neurogenica9 (vedere la Tabella dei materiali) dopo 24 ore.
  3. Dopo l'induzione per 24 ore, aggiungere 10-7 mol/L di ATRA e 10 ng/mL di bFGF (vedi Tabella dei materiali) alla soluzione per mantenere la differenziazione indotta dei neuroni.
  4. Terminare l'induzione quando si formano evidenti sinapsi cellulari. Verificare la presenza di sinapsi cellulari evidenti utilizzando la tecnica della microscopia (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: La colorazione in immunofluorescenza è stata utilizzata per identificare i marcatori neuron-specifici dell'enolasi neurone-specifica (NSE, vedi Tabella dei materiali), che è un marcatore dei neuroni2.
  5. Eseguire l'imaging confocale sui fogli di arrampicata cellulare.

7. Colorazione in immunofluorescenza

  1. Dopo aver scartato la soluzione di coltura cellulare, lavare le cellule con 500 μL di PBS tre volte per 5 minuti ciascuna.
  2. Quindi, aggiungere 500 μl di paraformaldeide al 4% al pozzetto e fissare le celle a temperatura ambiente per 45 minuti.
  3. Lavare le celle con PBS tre volte per 5 minuti ciascuna.
  4. Permeabilizzare le celle con 100 μl di Triton-X allo 0,5% a temperatura ambiente per 5 minuti.
  5. Lavare le celle con 500 μL di PBS all'1% di BSA tre volte per 5 minuti ciascuna.
  6. Incubare le cellule con 500 μL di PBS con BSA al 3% e Triton X-100 allo 0,1% per pozzetto a 37 °C per 45 minuti per bloccare il sito di legame aspecifico.
  7. Diluire l'anticorpo primario contro l'NSE (1:100, vedere la Tabella dei materiali) con PBS (1:100) contenente l'1% di BSA e lo 0,1% di Triton X-100 e incubare le cellule con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C.
  8. Dopo aver scartato l'anticorpo primario, lavare le cellule con 500 μL di PBS contenente l'1% di BSA tre volte per 5 minuti ciascuna.
  9. Diluire l'anticorpo secondario fluorescente (goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488, vedi Tabella dei materiali) con PBS (1:200) contenente l'1% di BSA e lo 0,1% di Triton X-100 a 1:200 e incubare le cellule con l'anticorpo secondario a 37 °C al buio per 60 minuti.
  10. Lavare le celle con 500 μL di PBST (PBS contenente lo 0,1% di Tween-20) per pozzetto tre volte al buio per 5 minuti ciascuna.
  11. Quindi, aggiungere 200 μL di colorazione DAPI (PBST diluito, 0,1 μg/mL) al pozzetto per colorare il nucleo a temperatura ambiente senza luce per 5 minuti.
  12. Lavare le celle con 500 μL di PBST tre volte al buio per 5 minuti ciascuna.
  13. Aggiungere l'agente estinguente antifluorescenza al vetrino, quindi coprire delicatamente il vetrino con un vetro di copertura. Aggiungi gocce di smalto intorno al vetro di copertura per fissarlo.
  14. Osservare il vetro con un microscopio confocale laser. Utilizzare le seguenti impostazioni di microscopia: canale verde con laser a 488 nm e canale DAPI con 405 nm.

8. Saggio di proliferazione

  1. Seminare 2 x 103 celle per pozzetto in piastre a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto.
  2. Aggiungere 10 μL di kit per il conteggio delle cellule-8 (CCK-8, vedere la Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto.
  3. Dopo 2 giorni di incubazione, misurare il valore OD a 450 nm su un lettore di micropiastre nei giorni 1-7.
  4. Analizzare i valori di OD dei diversi tipi di cellule staminali utilizzando software statistici (vedi Tabella dei materiali) e presentarli come mezzi ± SD. Eseguire l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). Considera il valore P < 0,05 come statisticamente significativo.

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Risultati

Isolamento e coltura di UCA-PSC, UCV-PSC e WJ-MSC dal cordone ombelicale
Le arterie ombelicali, la vena ombelicale e la gelatina di Wharton sono state separate meccanicamente dal cordone ombelicale e tagliate in pezzi di 2-3cm. La distanza tra le arterie, la vena o i blocchi di tessuto gelatinoso di Wharton era di circa 1 cm, disposti a forma di quinconce (Figura 1A-C). I tre tipi di cellule staminali sono stati isolati con un ...

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Discussione

Questo studio ha isolato tre diversi tipi di cellule dalle arterie del cordone ombelicale, dalla vena e dalla gelatina di Wharton. Il cordone ombelicale era uno scarto di consegna e il suo utilizzo era semplice, sicuro e senza controversie etiche5. Le UC-MSC sono originali e hanno una forte capacità di differenziazione1. Studi precedenti hanno dimostrato che la quantità di UC-MSC isolate dal cordone ombelicale con il metodo di digestione de...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno del Progetto di ricerca di base dell'Ufficio per la scienza e la tecnologia di Changzhou nell'ambito della sovvenzione numero CJ20200110 (a YJY), della National Nature Science Foundation of China (82001629, XQS), del Youth Program of Natural Science Foundation della provincia di Jiangsu (BK20200116, XQS) e del Jiangsu Province Postdoctoral Research Funding (2021K277B, XQS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di differenziazione adipogenicaGibcoA1007001Differenziazione multidirezionale
Soluzione di colorazione rossa di alizarinaSigmaA5533Differenziazione multidirezionale
Anticorpo contro CD13Thermo Fisher ScientificMA1-12034Analisi del flusso
Anticorpo contro CD34BD Biosciencesdelflusso
Anticorpo contro CD45BD Biosciences561865analisi del flusso
Anticorpo contro CD73BD Biosciencesanalisi delflusso
940294 Anticorpo contro HLA-DRBD Biosciences555560analisi del flusso
Agente estinguente anti-fluorescenzaAbcamAB103748Immunofluorescenza
Anti-IgG di topo H& L (Alexa Fluor 488)abcamab150113Differenziazione multidirezionale
ATRASTEMCELL Technologies302-79-4coltura cellulare
bFGFGibco13256029Differenziazione multidirezionale
BSASigmaV900933Immunofluorescenza
Incubatore cellulareThermo Fisher ScientificHERAcell 240icoltura cellulare
Kit conteggio cellule-8DojindoCK04proliferazione cellulare
CentrifugaThermo Fisher ScientificSorvall™ Coltura cellulare MTX-150
DAPISigma10236276001Immunofluorescenza
DMSOSigmaD1435Coltura cellulare
FBSGibco10099141Coltura cellulare
FITC Topo Anti-Human IgGBD BiosciencesAnalisiflusso
Citometro a flussoThermo Fisher ScientificA24864del flusso
Microscopio a fluorescenzaThermo Fisher ScientificIM-5analisi del flusso
GelatinaSigma48722Differenziazione multidirezionale
Leica MicroscopioLeicaDM500Differenziazione multidirezionale
LG-DMEM mediumGibco11-885-084Lettore di
micropiastreThermo Fisher ScientificProliferazione cellulareA51119500C
Induzione neurogenaGibcoA1647801Differenziazione multidirezionale Soluzione
di O rosso olioSigmaO1516Differenziazione multidirezionale
Induzione osteogenicaCyagenHUXXC-90021Differenziazione multidirezionale
ParaformaldeideSangon Biotech30525-89-4Pipetta Pasteur in immunofluorescenza
BiosharpBS-XG-03Lcoltura cellulare
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)Coltura cellularedi SH30256.LSiclone
Penicillina streptomicinaColtura cellularedi SV30010 Hyclone
Anticorpo primario contro NSESanta Cruz Biotechnologysc-292097Differenziazione
multidirezionaleSPSS 22.0IBMSPSS 22.0Analisi statistica
I fogli rampicanti cellulariCITOTEST Scientific80346-0910Differenziazione multidirezionale
TritonX-100Sangon Biotech9002-93-1Immunofluorescenza
TripsinaGibco25300120 coltura cellulare
Analisi 560942 del 560952 Analisi per colture cellulari

Riferimenti

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