Articolo metodologico

Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

DOI:

10.3791/64068

⸱

1 agosto 2022

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, University of Toronto, 4Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo descrive l'approvvigionamento chirurgico e la successiva decellularizzazione dei lembi suini vascolarizzati mediante la perfusione di detergente dodecilsolfato di sodio attraverso la vascolarizzazione del lembo in un bioreattore di perfusione personalizzato.

Abstract

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I difetti dei tessuti molli di grandi volumi portano a deficit funzionali e possono avere un grande impatto sulla qualità della vita del paziente. Sebbene la ricostruzione chirurgica possa essere eseguita utilizzando il trasferimento autologo del lembo libero o l'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA), tali metodi presentano anche degli svantaggi. Problemi come la morbilità del sito donatore e la disponibilità di tessuti limitano il trasferimento autologo del lembo libero, mentre l'immunosoppressione è una limitazione significativa della VCA. I tessuti ingegnerizzati in chirurgia ricostruttiva utilizzando metodi di decellularizzazione/ricellularizzazione rappresentano una possibile soluzione. I tessuti decellularizzati sono generati utilizzando metodi che rimuovono il materiale cellulare nativo preservando la microarchitettura della matrice extracellulare sottostante (ECM). Questi scaffold acellulari possono quindi essere successivamente ricellularizzati con cellule specifiche del ricevente.

Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi di approvvigionamento e decellularizzazione utilizzati per ottenere scaffold acellulari in un modello suino. Inoltre, fornisce anche una descrizione della progettazione e della configurazione del bioreattore di perfusione. I lembi includono l'omento suino, la fascia lata tensoriale e l'avambraccio radiale. La decellularizzazione viene eseguita tramite perfusione ex vivo di detergente a bassa concentrazione di sodio dodecilsolfato (SDS), seguita da trattamento enzimatico DNasi e sterilizzazione con acido peracetico in un bioreattore di perfusione personalizzato.

La decellularizzazione tissutale di successo è caratterizzata da un aspetto bianco-opaco dei lembi macroscopicamente. I lembi acellulari mostrano l'assenza di nuclei sulla colorazione istologica e una significativa riduzione del contenuto di DNA. Questo protocollo può essere utilizzato in modo efficiente per generare scaffold di tessuti molli decellularizzati con ECM conservata e microarchitettura vascolare. Tali scaffold possono essere utilizzati in successivi studi di ricellularizzazione e hanno il potenziale per la traduzione clinica in chirurgia ricostruttiva.

Introduzione

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La lesione traumatica e la rimozione del tumore possono portare a difetti dei tessuti molli grandi e complessi. Questi difetti possono compromettere la qualità della vita del paziente, causare perdita di funzione e causare disabilità permanente. Mentre tecniche come il trasferimento del lembo di tessuto autologo sono state comunemente praticate, i problemi con la disponibilità del lembo e la morbilità del sito donatore sono le principali limitazioni 1,2,3. L'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) è un'alternativa promettente che trasferisce i tessuti compositi, ad esemp....

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Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della rete sanitaria universitaria (IACUC) e vengono eseguite in conformità con il protocollo e le procedure del Centro risorse animali della rete sanitaria universitaria e le linee guida del Consiglio canadese per la cura degli animali. Cinque maiali dello Yorkshire (35-50 kg; età circa 12 settimane) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti.

1. Fabbricazione di bioreattori di perfusione

  1. Vedere la Figura 1 per tutti i componenti utilizzati nel bioreattore a perfusion....

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Risultati

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Questo protocollo per decellularizzare i lembi suini vascolarizzati si basa sulla perfusione di un detergente a base ionica, SDS, attraverso la vascolarizzazione del lembo in un bioreattore di perfusione personalizzato. Prima della decellularizzazione, tre lembi vascolarizzati in un modello suino sono stati acquistati e incannulati in base ai loro principali vasi di alimentazione. I lembi sono stati immediatamente lavati dopo l'approvvigionamento al fine di mantenere una vascolarizzazione brevettata e perfusibile per con.......

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Discussione

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Il protocollo proposto utilizza la perfusione di SDS a bassa concentrazione per decellularizzare una gamma di lembi derivati dal maiale. Con questa procedura, l'omento acellulare, la fascia tensoriale lata e i lembi radiali dell'avambraccio possono essere decellularizzati con successo utilizzando un protocollo che favorisce la SDS a bassa concentrazione. Esperimenti preliminari di ottimizzazione hanno determinato che la SDS a bassa concentrazione (0,05%) tra 2 giorni e 5 giorni è in grado di rimuovere materiale cellulare.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 µ m pore Acrodisk FiltroVWRCA28143-310
0,9 % Soluzione di cloruro di sodio (soluzione salina normale)BaxterJF7123
20 L Polipropilene DamigianaCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Sofsilk Cravatta chirurgica non assorbibileCovidien  LS639
Rubinetto a 3 vieCole-ParmerUZ-30600-04
Adson ForcipeFine Science Tools11027-12
Soluzione antibiotico-antimicotica, 100XWisent450-115-EL
Solfato di atropina 15 mg / 30 mlTrave 8 prodotti238481
BD Angiocath 20-GaugeVWRBD381134
BD Angiocath VWR calibro 22BD381123
BD Angiocath VWR calibro 24BD381112
cloruro di calcioSigma-AldrichC4901Cofattore DNAsi
DNasi I da pancreas bovinodel DNA Sigma-AldrichDN25
(kit di analisi Quant-iT PicoGreen dsDNA)InvitrogenP7589
DPBS, 10XBisonte311-415-CL  senza Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Eparina, 1000 U.I./mLLeo Pharma A/S453811
Ketamina cloridrato  5000 mg/50 mlBimeda-MTC Animal Health Inc.
Ismatec Pump Tygon Tubo a 3 scaviCole-ParmerRK-96450-40Diametro interno: 1,85 mm
Ismatec REGLO Pompa a 4 canaliCole-Parmer78001-78
Ismatec Cassette per tubiCole-ParmerRK-78016-98
Isoflurano 99,9%, 250 mlPartner farmaceutici del Canada Inc.
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Test di sterilità piastre di agar
Solfato di magnesioSigma-AldrichM7506DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 TubiCole-ParmerRK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
Matita per Cauterizzazione MonopolareValleylabE2100
Formalina Tamponata Normale, 10%Sigma-AldrichHT501128
N° 11 lama per bisturiSwann Morton303
Papaina da lattice di papayaSigma-AldrichP3125
Acido peraceticoSigma-Aldrich269336
Connettore spinato in plastica per tubo da 1/4" a 1/8" IDMcMaster-Carr5117K61
Tubo spinato in plastica 90 ° grado; Connettori a gomitoMcMaster-Carr5117K76
Tappi per tubi a rotazione rapida in plasticaMcMaster-Carr51525K143Prese per
tubi a rotazione rapida in plasticaMcMaster-Carr51525K293Luer Punch femmina
Integra Miltex3332
Cloruro di potassio 40 mEq/20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Povidone-Iodio, 10%Rougier833133
Pipetta sierologica, 2mLFisher Science13-678-27D
Contenitori ermetici con coperchio a scattoSnapLock142-3941-4
Polvere di solfato di sodio dodecilSigma-AldrichL4509
Clip di legatura in metallo chirurgico, piccoloTeleflex001200
Forbici per tenotomia Stevens, 115 mm, diritteB. BraunBC004R
Set per il monitoraggio della pressione TruWaveEdwards LifesciencesPX260
Saggio 61231622319292242905 Luer maschio Strumento per biopsia

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
  2. Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M.

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