Questo protocollo illustra un test di transcitosi delle cellule endoteliali in vitro come modello per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna misurando la capacità delle cellule endoteliali microvascolari retiniche umane di trasportare la perossidasi di rafano attraverso le cellule nei processi di trasporto transcellulare mediati da caveole.
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Articolo metodologico
Saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La disfunzione della barriera emato-retinica (BRB) contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell'occhio, spesso con conseguente edema retinico e conseguente perdita della vista. La barriera emato-retinica interna (iBRB) è composta principalmente da endotelio vascolare retinico con bassa permeabilità in condizioni fisiologiche. Questa caratteristica di bassa permeabilità è strettamente regolata e mantenuta da bassi tassi di trasporto paracellulare tra cellule endoteliali microvascolari retiniche adiacenti, nonché trasporto transcellulare (transcitosi) attraverso di esse. La valutazione della permeabilità della barriera transcellulare retinica può fornire informazioni fondamentali sull'integrità dell'iBRB in salute e malattia. In questo studio, descriviamo un test di transcitosi delle cellule endoteliali (EC), come modello in vitro per valutare la permeabilità all'iBRB, utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC). Questo test valuta la capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina e la perossidasi di rafano (HRP) nei processi di trasporto transcellulare mediati dal recettore e dalle caveole, rispettivamente. Gli HRMEC completamente confluenti coltivati su membrana porosa sono stati incubati con transferrina marcata con fluorescenza (transcitosi clatrin-dipendente) o HRP (transcitosi mediata da caveole) per misurare i livelli di transferrina o HRP trasferiti nella camera inferiore, indicativi dei livelli di transcitosi attraverso il monostrato EC. La segnalazione Wnt, una via nota che regola l'iBRB, è stata modulata per dimostrare il metodo di analisi della transcitosi basato su HRP mediato da caveolae. Il test di transcitosi EC qui descritto può fornire uno strumento utile per studiare i regolatori molecolari della permeabilità EC e dell'integrità di iBRB nelle patologie vascolari e per lo screening dei sistemi di somministrazione dei farmaci.
Introduzione
La retina umana è uno dei tessuti più esigenti in termini di energia nel corpo. Il corretto funzionamento della retina neurale richiede un efficiente apporto di ossigeno e sostanze nutritive insieme a un flusso limitato di altre molecole potenzialmente dannose per proteggere l'ambiente retinico, che è mediato attraverso la barriera emato-retinica (BRB)1. Simile alla barriera emato-encefalica (BBB) nel sistema nervoso centrale, il BRB agisce come una barriera selettiva nell'occhio, regolando il movimento di ioni, acqua, aminoacidi e zucchero dentro e fuori dalla retina. BRB mantiene anche l'omeostasi retinica e il suo privilegio immunitario prev....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Boston Children's Hospital per la generazione di microscopia ottica e immagini EM (Figura 3). I protocolli per gli studi in vivo possono essere ottenuti da Wang et al.24. Tutti gli esperimenti che coinvolgono cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Committee (IBC) del Boston Children's Hospital.
1. Preparazione dei reagenti
- Soluzione per il rivestimento di un pia....
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Risultati
Le immagini EM dell'endotelio vascolare retinico mostrano il trasporto vescicolare transcitotico e le vescicole caveolari nelle cellule endoteliali in vivo.
La transcitosi EC può essere visualizzata in vivo all'interno di sezioni trasversali retiniche con precipitato marrone scuro che riflette i vasi sanguigni contenenti HRP al microscopio ottico (Figura 3A) e come precipitato denso di elettroni indicativo di vescicole transcitotiche contenenti HRP (.......
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Discussione
BRB svolge un ruolo essenziale nella salute e nella malattia della retina. Le tecniche in vitro che valutano la permeabilità vascolare si sono dimostrate strumenti cruciali negli studi riguardanti lo sviluppo e la funzione della barriera (BRB/BBB). La procedura qui descritta potrebbe essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della transcitosi EC o valutare i relativi modulatori molecolari che influenzano la permeabilità BRB. In vitro I saggi di transcitosi EC presentano molteplici.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse o interessi finanziari da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH (R01 EY028100, EY024963 e EY031765) a JC. ZW è stato supportato da un Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Armadio di sicurezza biologica | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Petridish per colture cellulari | Nest Biotechnology | 704001 | |
| centrifuga | Eppendorf | 5702 | |
| Provette da centrifuga (15 mL) | Corning Inc. | ||
| Provette da centrifuga (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cianina 3-transferrina umana | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Emocitometro (2 chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Perossidasi di rafano (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) | Sistemi cellulari | ACBRI 181 | |
| Incubatore | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific Celle | 3110 | |
| L (per terreno condizionato con controllo) | Celle ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A (per terreno condizionato con Wnt3A) | ATCC | CRL-2647 | |
| Microscopio ottico | Lettore | DMi1 | |
| EnSight, PerkinElmer | |||
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tampone (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Kit substrato perossidasi fluorogenica | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Norrin (rhNorrin) umano ricombinanteR | & D Systems | 3014-NR | |
| Fattore di crescita dell'endotelio vascolare umano ricombinante (rhVEGF) | R& D Systems | 293-VE | |
| Filtro per siringa (0,22 & micro; m) | Inserti Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell (6,5 mm transwell, 0,4 &; micro; m pore inserto membrana in poliestere) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| d'acqua | Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060 | ||
| XAV939 (Wnt/β-catenina inibitore) | Selleckchem | S1180 |
Riferimenti
- Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
- Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. <....
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Ristampe e permessi
