Il protocollo presenta un modello di immunoterapia del cancro che utilizza la vaccinazione tumorale basata su cellule con melanoma B16-F10 che esprime Flt3L. Questo protocollo dimostra le procedure, compresa la preparazione di cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione della crescita tumorale, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Modello sperimentale di immunoterapia del melanoma utilizzando la vaccinazione tumorale con una citochina ematopoietica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il ligando tirosin-chinas-simile 3 (Flt3L) è una citochina ematopoietica che promuove la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule dendritiche (DC). È stato utilizzato nei vaccini tumorali per attivare l'immunità innata e migliorare le risposte antitumorali. Questo protocollo dimostra un modello terapeutico che utilizza un vaccino tumorale basato su cellule costituito da cellule di melanoma B16-F10 che esprimono Flt3L insieme all'analisi fenotipica e funzionale delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale (TME). Vengono descritte le procedure per la preparazione delle cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione delle dimensioni del tumore, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un modello preclinico di immunoterapia dei tumori solidi e una piattaforma di ricerca per studiare la relazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie infiltranti. Il protocollo di immunoterapia qui descritto può essere combinato con altre modalità terapeutiche, come il blocco del checkpoint immunitario (anticorpi anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) o la chemioterapia al fine di migliorare l'effetto terapeutico del melanoma sul cancro.
Introduzione
L'immunoterapia del cancro è stata riconosciuta come una strategia terapeutica promettente basata sui suoi effetti collaterali meno tossici e risposte più durature. Sono stati sviluppati diversi tipi di immunoterapie, tra cui terapie con virus oncolitici, vaccini contro il cancro, terapie con citochine, anticorpi monoclonali, trasferimento cellulare adottivo (cellule CAR-T o CAR-NK) e blocco del checkpoint immunitario1.
Per i vaccini contro il cancro, ci sono diverse forme di vaccini terapeutici, come vaccini a base di cellule intere, vaccini proteici o peptidici e vaccini a RNA o DNA. La vaccinazione si basa sulla c....
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Protocollo
Tutti i topi utilizzati nello studio sono stati mantenuti e ospitati nel vivaio dell'Istituto di immunologia La Jolla (LJI) in specifiche condizioni prive di agenti patogeni con temperatura e umidità controllate. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con topi femmina C57BL / 6 di 8-14 settimane secondo le linee guida e i protocolli approvati dal LJI Animal Care Committee.
1. Preparazione di cellule tumorali in coltura per l'impianto
- Cellule di melanoma B16-F10 di coltura nel terreno di Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove contenenti il 10% di FBS inattivato dal calore, 2 mM di glutammina, 1 mM di piruv....
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Risultati
Un punto nero visibile delle cellule B16-F10 impiantate viene solitamente osservato sulla superficie della pelle ~ 3 giorni dopo l'impianto del tumore. I topi vengono trattati con il vaccino tumorale 3, 6 e 9 giorni dopo che il nodulo tumorale ha raggiunto una dimensione di ≥2 mm. Abbiamo osservato una significativa riduzione della crescita tumorale nel gruppo di topi vaccinati ~ 2 settimane dopo l'impianto del tumore (Figura 1). Alla fine dell'esperimento, abbiamo isolato le cellule immunit.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto si basa sullo studio del gruppo di Allison. Hanno dimostrato che la combinazione del vaccino B16-Flt3L con il blocco CTLA-4 ha mostrato un effetto sinergico sul tasso di sopravvivenza e sulla crescita del tumore, mentre nessuna riduzione della crescita tumorale è stata osservata nei topi che hanno ricevuto il vaccino B16-Flt3L o il trattamento con anticorpi anti-CTLA-4 da solo7. Studi recenti hanno rivelato una nuova via di segnalazione CTLA4-PKCη intrinseca Treg-intrin.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Stephen Schoenberger per aver fornito cellule B16-Flt3L e il personale delle strutture di citometria animale e a flusso LJI per l'eccellente supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% inattivato a caldo FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lotto# 209018 |
| Ago 30G | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 pozzetti V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| Linea cellulare B16 che esprime il ligando Fms-like tyrosine chinasi 3 (B16-Flt3L) | Dono del Dr. Stephen Schoenberger, LJI | I cDNA Flt3L sono stati clonati nel vettore retrovirale pMG-Lyt2, come nel riferimento 5, Figura 1 Supplementare | |
| Linee cellulari B16-F10 | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Tampone di fissazione cellulare (4,2% PFA) |
| Kit Cytofix/Cytoperm | di soluzioni di fissazione/permeabilizzazione | 554714 | BD Biosciences |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Pinza digitale elettronica | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | dei dati del citometro a flusso | Tree Star | |
| GolgiStop (inibitore del trasporto delle proteine) | BD Biosciences | 554724 | diluizione 1:1500 |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomicina | Sigma | I0634 | |
| Iscove' s modificato Dulbecco' s medium (IMDM) | Citometri Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II | BD Biosciences | Citometro a flusso | |
| MEM aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140-050 | |
| penicillina e streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | Medium specifico per gradiente di densità |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Tampone per lisi di globuli rossi Hybri-Max liquido | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medio | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 Irradiatore a raggi X | Rad Source Technologies piruvato | ||
| di sodioGibco | 11360-070 | ||
| Filtro cellulare sterile 40 μ m | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Filtro cellulare sterile 70 μ m | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Kit di vitalità fissabile Zombie Aqua | BioLegend | 423101 | |
| Anticorpi Anti-mCD45 | |||
| BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluoroforo: BV570 Diluizione: 1:200 | |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluoroforo: PerCP-Cy5.5 Diluizione: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 | Clone: 53-6.7 Fluoroforo: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Diluizione: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluoroforo: APC-Cy7 Diluizione: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific 11577382 | Clone: FJK-16s Fluoroforo: FITC Diluizione: 1:100 | |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluoroforo: PE Diluizione: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluoroforo: PE-Cy7 Diluizione: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluoroforo: BV785 Diluizione: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 Clone: RB6-8C5 Fluoroforo: APC/Cy7 Diluizione: 1:200 | |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluoroforo: Blu del Pacifico Diluizione: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluoroforo: PECy7 Diluizione: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 Clone: N418 Fluoroforo: PerCP Cy5.5 Diluizione: 1:100 | |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluoroforo: AF700 Diluizione: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluoroforo: Alexa Fluor 647 Diluizione: 1:200 |
| Clone di 105007 BioLegend anti-mCD86 | : GL-1 Fluoroforo: PE Diluizione: 1:200 | ||
| FC-blocker (Topo anti-topo CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Diluizione: 1:200 |
Riferimenti
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M.
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Ristampe e permessi
