La tecnica peel-blot è un metodo di preparazione della griglia crio-EM che consente la separazione di campioni biologici multistrato e concentrati in singoli strati per ridurre lo spessore, aumentare la concentrazione del campione e facilitare l'elaborazione delle immagini.
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Articolo metodologico
La tecnica peel-blot: un metodo di preparazione dei campioni crio-EM per separare singoli strati da campioni biologici multistrato o concentrati
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnica di preparazione della griglia crio-EM peel-blot è un metodo di back-injection significativamente modificato con l'obiettivo di ottenere una riduzione degli strati di campioni multistrato. Questa rimozione degli strati prima del congelamento a tuffo può aiutare a ridurre lo spessore del campione a un livello adatto alla raccolta di dati crio-EM, migliorando la planarità del campione e facilitando l'elaborazione delle immagini. La tecnica peel-blot consente la separazione di membrane multilamellari in singoli strati, di cristalli 2D stratificati in singoli cristalli e di strutture impilate simili a fogli di proteine solubili da separare allo stesso modo in singoli strati. L'elevato spessore del campione di questi tipi di campioni pone spesso problemi insormontabili per la raccolta di dati crio-EM e l'elaborazione di immagini crio-EM, specialmente quando lo stadio del microscopio deve essere inclinato per la raccolta dei dati. Inoltre, le griglie di alte concentrazioni di uno qualsiasi di questi campioni possono essere preparate per una raccolta efficiente dei dati poiché la concentrazione del campione prima della preparazione della griglia può essere aumentata e la tecnica peel-blot regolata per ottenere una distribuzione densa di campione a strato singolo.
Introduzione
La tecnica peel-blot è stata sviluppata per separare cristalli bidimensionali impilati di proteine di membrana in singoli strati per ottenere campioni adeguatamente sottili per la raccolta di dati crio-EM 2D e 3D e facilitare l'elaborazione delle immagini1. Il protocollo è adatto allo stesso modo per altri tipi di campioni multilamellari e per ottenere elevate concentrazioni di campioni di entrambi i tipi di campioni sulla griglia senza aumentare lo spessore in Z.
La riduzione degli strati di campione a uno strato si ottiene applicando una combinazione di pressione capillare e forze di taglio in un protocollo che est....
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Protocollo
1. Fasi di preparazione per la tecnica peel-blot
Nota : la preparazione richiede che i seguenti elementi siano posizionati adiacenti l'uno all'altro.
- Impilare due pezzi di carta da filtro da 20-25 μm (vedi Tabella dei materiali).
- Posizionare un film di paraffina lungo ~ 8 cm x 10 cm adiacente alla carta da filtro con la carta rivolta verso l'alto.
- Posizionare un pezzo di carta da filtro submicron sopra altri due pezzi di carta da filtro #4 (Figura 1-1).
- Posizionare la pinza anti-capillare con la gamba piegata rivolta vers....
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Risultati
Un esperimento di successo peel-blot si tradurrà in singoli strati di campioni a concentrazioni spesso elevate. È prevedibile che alcune regioni nella maggior parte dei quadrati della griglia conterranno ancora più livelli, specialmente a un numero inferiore di iterazioni delle fasi peel-blot. La maggior parte dei quadrati della griglia, tuttavia, conterrà estese regioni di singoli strati come osservato per i cristalli 2D di leucotriene C4 sintasi umana (Figura 2) e liposomi (aggiunti nel passaggio
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Discussione
Il peel-blot è un metodo potente per superare l'impilamento e lo spessore di cristalli 2D multistrato e campioni simili per la raccolta di dati crio-EM e l'elaborazione delle immagini. Una decisione sull'uso del peel-blot sarà basata sui parametri biologici del campione e richiederà anche una valutazione una volta che sarà disponibile un modello crio-EM 3D. L'importanza biologica dei contatti e la potenziale flessibilità delle regioni di contatto saranno particolarmente importanti in questa valutazione.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Parte di questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH HL090630 (ISK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Griglie da 600 maglie | SPI | 2060-C-XA | |
| Pinza anticapillare | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbonio per rivestire la mica | |||
| Cryo-EM | Le griglie Cryo-EM possono essere schermate a 120 kV o 200 kV. I dati ad alta risoluzione vengono raccolti a 300 kV. | ||
| Dumpont #5 pinze | Ted Pella | 5622 | |
| Scatola a griglia per lo stoccaggio cryo-EM | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Azoto | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | La mica è rivestita di carbonio e tagliata in quadrati leggermente più grandi di una griglia TEM. Lo spessore del carbonio può richiedere un'ottimizzazione per evitare che il carbonio sottile si rompa facilmente dopo più peel blot. |
| L'acetato | adatto per molti campioni. Altri coloranti come l'acido fosfotungstico possono essere sostituiti. | ||
| Parafilm | |||
| A questo scopo, un contenitore di polistirolo può essere riciclato e rivestito con un foglio di alluminio. | |||
| Carta da filtro submicronica | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Microscopio elettronico a trasmissione | JEOL | JEM-1400 | Qualsiasi TEM azionato a una tensione di accelerazione di 80-120 kV sarà adatto per lo screening di griglie colorate negativamente. |
| Trealosio | Preparare una soluzione di trealosio al 4%. | ||
| Carta da filtro Whatman #4 | MilliporeSigma | WHA1004150 | Questo corrisponde al 20-25 μ m carta da filtro per pori nel protocollo. |
Riferimenti
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., ....
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Ristampe e permessi
