Clearing ottico rapido per l'analisi semi-ad alto rendimento degli sferoidi tumorali

Le colture cellulari tridimensionali (3D), come gli sferoidi, forniscono modelli biologicamente realistici e riproducibili della crescita cellulare aggregata ^1,2. Questi modelli stanno rapidamente diventando comuni sia nella ricerca di base che nello sviluppo di farmaci, in cui le differenze nelle dimensioni e nella struttura degli sferoidi vengono esaminate tra i trattamenti per accertare l'efficacia del farmaco ^3,4. In questi contesti, la capacità di raccogliere informazioni dettagliate da un gran numero di sferoidi è altamente vantaggiosa, sia dal punto di vista del potere statistico che per consentire una rapida valutazione del comportamento cellulare attraverso diversi trattamenti.

Le tecniche comunemente utilizzate per ottenere immagini microscopiche dettagliate della struttura sferoide sono lunghe, costose o producono immagini di scarsa qualità che non mantengono caratteristiche quantitative chiave come la dimensione sferoide ^4,5. Ad esempio, le tecniche istologiche basate sulla criosezione possono fornire immagini di alta qualità ma spesso richiedono molto tempo, richiedono manodopera qualificata e spesso creano artefatti di sezionamento ^6,7, mentre tecnologie eleganti, come la microscopia a illuminazione a piano singolo (SPIM)⁸ e la microscopia multifotonica⁹ richiedono microscopi specializzati che non sono prontamente disponibili. Le moderne tecnologie di microscopia hanno recentemente permesso il cosiddetto sezionamento ottico, in cui gli sferoidi sono collocati all'interno di una soluzione di compensazione abbinata all'indice di rifrazione e le immagini sono ottenute utilizzando la microscopia confocale ^4,5. Mentre queste tecniche hanno il potenziale per produrre un alto rendimento, i problemi comuni includono il movimento sferoide durante l'imaging, la distorsione delle dimensioni durante la compensazione e l'elevata spesa delle soluzioni di compensazione proprietarie. Inoltre, molti protocolli esistenti si applicano solo a sferoidi relativamente piccoli di diametro inferiore a 300 μm o profondità fino a 100 μm, limitando la tecnologia alle prime fasi della crescita tumorale ^5,10,11.

Il presente protocollo consente la raccolta semi-ad alto rendimento e ad alto rendimento di immagini sferoidi dettagliate utilizzando una soluzione di compensazione a basso costo a indice di rifrazione derivata da procedure di compensazione di organi interi^12,13. Per prevenire il movimento sferoide durante l'imaging e fornire supporto strutturale per ridurre la distorsione dimensionale, gli sferoidi sono montati in gel agarosio-PBS in una lastra di vetro a 24 pozzetti #1,5. Poiché questa tecnica consente di montare più sferoidi in ciascun pozzetto in una piastra a 24 pozzetti, fino a 360 sferoidi (15 sferoidi / pozzetto) possono essere rapidamente montati e ripresi in varie condizioni sperimentali. Una soluzione di compensazione con indice di rifrazione costruita con materiali di consumo prontamente disponibili viene utilizzata per eliminare otticamente gli sferoidi montati e il gel circostante. Dopo un periodo di assestamento di 24 ore, questo protocollo fornisce immagini 2D e 3D di alta qualità della struttura sferoide, anche per sferoidi relativamente grandi (circa 700 μm di diametro), con una distorsione dimensionale inferiore al 2%.

Il protocollo descrive la preparazione di una quantità sufficiente di sferoidi tumorali per montare una piastra a 24 pozzetti (circa 240-360 sferoidi o 10-15 sferoidi/pozzetto) a 200 μL di gel di agarosio per pozzetto e 500 μL di soluzione di compensazione per pozzetto. La procedura completa è illustrata nella Figura 1.

1. Preparazione del gel di agarosio-PBS al 2%

1. Pesare 0,5 g di agarosio a bassa fusione (vedere Tabella dei materiali) in una bottiglia di vetro e aggiungere 25 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Sciogliere l'agarosio facendo bollire la soluzione in un forno a microonde per 30-60 s con il coperchio chiuso ma non sigillato e con un turbinio costante. Assicurarsi che l'agarosio sia completamente sciolto e che la soluzione non bolle.
   NOTA: Il gel può essere conservato a temperatura ambiente; controllare il volume prima dell'uso per tenere conto dell'evaporazione. Portare allo stato liquido (microonde; 20-60 s con vortice) prima dell'uso.

2. Preparazione della soluzione di compensazione

1. Pesare 9 g di N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Idrossipropil) etilendiammina, 22 g di urea, 44 g di saccarosio, 0,1 g di Triton X-100 e 24,9 g di acqua deionizzata (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: È più facile pesare la quantità approssimativa di N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine e regolare il peso di altri componenti per ottenere la concentrazione desiderata.
2. Riscaldare la soluzione a bagnomaria a 56 °C con miscelazione costante e continuare fino a quando tutti i cristalli si dissolvono.
3. Riposare la soluzione a temperatura ambiente per permettere alle bolle formatesi durante la miscelazione di salire in superficie. La soluzione è stabile a temperatura ambiente fino a 2 mesi.

3. Preparazione sferoide

1. Genera sferoidi usando il metodo di sovrapposizione di agarosio come descritto in precedenza ^1,3,14.
   NOTA: anche gli sferoidi generati da altri metodi sono compatibili con questo protocollo di imaging.
2. Tagliare la punta di una punta della pipetta da 1 mL usando un bisturi per ingrandire l'orifizio.
   NOTA: Tutti gli sferoidi sono stati maneggiati con pipette da 1 mL o 200 μL con punte tagliate.
3. Utilizzando la pipetta, aspirare gli sferoidi dai pozzetti e trasferirli in un tubo conico chiaro da 1,5 ml. Più sferoidi delle stesse condizioni possono essere combinati nello stesso tubo.
   NOTA: Lasciare sempre che gli sferoidi si depositino sul fondo del tubo per aspirare il mezzo.
4. Lavare due volte gli sferoidi in 1 mL di PBS, aggiungere una soluzione neutra di paraformaldeide (PFA) preriscaldata al 4% e incubare gli sferoidi a 37 °C per 20 minuti.
5. Rimuovere la soluzione di PFA e lavare gli sferoidi due volte con 1 mL di PBS.

4. Colorazione sferoide

1. Utilizzando una pipetta, trasferire fino a 15 sferoidi in un tubo PCR da 200 μL.
   NOTA: Per gli sferoidi fragili, montare gli sferoidi in gel (passaggi 5.1-5.4) prima di procedere.
2. Permeabilizzare le cellule utilizzando 200 μL dello 0,5% di Triton X-100 in PBS. Posizionare i tubi PCR all'interno di tubi a vite da 50 mL e incubare gli sferoidi per 2 ore a temperatura ambiente con lieve agitazione.
   NOTA: Tutte le incubazioni vengono eseguite con agitazione su rotore, rullo o agitatore (vedere Tabella dei materiali) se non diversamente specificato. Questo è importante per ottenere una colorazione uniforme. Gli sferoidi fissi in PBS a volte possono attaccarsi ai lati della punta della pipetta. Risciacquare la punta in 0,5% Triton X-100 riduce al minimo l'attaccamento degli sferoidi alle punte.
3. Sostituire la soluzione (fase 4.2) con 200 μL di tampone di diluizione anticorpale (ABDIL)¹⁵ e incubare durante la notte a temperatura ambiente.
4. Rimuovere ABDIL, aggiungere 75 μL di anticorpo primario in ABDIL e incubare a 4 °C per 2,5 giorni.
5. Rimuovere il surnatante e lavare con 200 μL di PBS con 0,1% Tween e 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) due volte e incubare con 200 μL di PBS-TT per 4 ore a temperatura ambiente.
6. Rimuovere PBS-TT, aggiungere 100 μL di anticorpo secondario in ABDIL e incubare a 4 °C per 2,5 giorni.
   NOTA: DAPI o altro colorante nucleare possono essere aggiunti in questa fase. La maggior parte dei coloranti richiede meno tempo di incubazione rispetto agli anticorpi.
7. Rimuovere il surnatante e lavare con 200 μL di PBS-TT due volte e incubare con 200 μL di PBS-TT per 4 ore. Gli sferoidi sono pronti per il montaggio.

5. Montaggio

1. Utilizzando una pipetta da 200 μL, trasferire sferoidi fissi e colorati in tubi PCR da 500 μL in un tubo per condizione (circa 10-15 sferoidi).
2. Sostituire la soluzione con 200 μL di gel di agarosio liquido al 2% (p/v) e centrifugare sulla centrifuga rapida (alla velocità massima fissa, vedere Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 30 s.
   NOTA: a meno che non si monti immediatamente, posizionare in un blocco riscaldante a 50 °C per evitare l'indurimento del gel.
3. Aspirare gli sferoidi in ~ 50 μL di gel di agarosio liquido ed erogare in pozzetto una piastra di vetro a 24 pozzetti.
4. Prima che il gel si indurisca, separare gli sferoidi usando una punta di pipetta nel gel circostante e assicurarsi che gli sferoidi siano coperti di gel. Facoltativamente, posizionare la piastra sul ghiaccio per impostare rapidamente il gel.
   NOTA: il numero di sferoidi per pozzetto dipende dalla dimensione degli sferoidi. Gli sferoidi sono posizionati lontano l'uno dall'altro in modo che solo uno sferoide entri nel campo visivo durante l'imaging. Questo è importante per l'elaborazione automatizzata delle immagini.
5. Aggiungere 500 μL di soluzione di compensazione (fase 2) per pozzetto, assicurandosi che il gel sia immerso. Incubare a RT per almeno 24 ore e visualizzare gli sferoidi nella soluzione di compensazione. Gli sferoidi sono stabili in questa soluzione fino a un mese a temperatura ambiente e quando sono protetti dall'evaporazione.

6. Imaging

1. Scegli un obiettivo con una distanza di lavoro abbastanza lunga da comprendere l'intero sferoide, inclusa l'altezza di montaggio dello sferoide nella nave.
   NOTA: gli obiettivi con una distanza di lavoro di 3 mm o più sono necessari per visualizzare il piano equatoriale degli sferoidi. Obiettivi di ingrandimento più elevati con NA più elevato possono consentire una migliore risoluzione, ma limiteranno la profondità massima alla quale gli sferoidi possono essere ripresi.
2. Per identificare il piano equatoriale, regolare la messa a fuoco fino a raggiungere la superficie più ampia nel piano XY e nell'immagine con la percentuale di potenza laser richiesta, la tensione del rilevatore, il guadagno e le impostazioni di offset.
   NOTA: la percentuale di potenza del laser, la tensione del rilevatore, il guadagno e l'offset variano notevolmente a seconda del fluoroforo, dell'intensità della colorazione, dell'intensità del laser, della sensibilità del rilevatore, ecc.
3. Per le immagini 3D, impostare l'inizio e la fine degli sferoidi e scegliere l'intensità del segnale appropriata a varie profondità z utilizzando le impostazioni di correzione dell'intensità z prima dell'imaging.
   NOTA: per una migliore risoluzione dell'immagine, utilizzare la frequenza di campionamento Nyquist per x, y e z (per i dettagli, vedere il riferimento¹⁶).

Per dimostrare la capacità di questo metodo di compensazione di fornire immagini bidimensionali e tridimensionali di alta qualità, gli sferoidi con diametri di 300-600 μm sono stati coltivati da linee cellulari di melanoma trasdotte da Cell Cycle Indicator (FUCCI) trasdotte da Fluorescent ubiquitinazione (FUCCI)9,17 , che esprimono la proteina monomerica Kusabira Orange2 (mKO2) e la proteina monomerica Azami Green (mAG) quando si trovano in Gap1, e la fase iniziale S/Gap2/mitosi del ciclo cellulare, rispettivamente secondo le procedure fornite nella fase 3 1,3,14. Gli sferoidi sono stati quindi fissati con una soluzione di formaldeide al 4% a 37 °C, permeabilizzati e colorati con anti-p27kip1/anti-coniglio Alexa Fluor 647 anti-pimonidazolo/anti-mouse Alexa Fluor 647, DAPI o DRAQ7 (vedi Tabella dei materiali) (Figura 2). Tutti i file di microscopia vengono caricati nel repository GitHub (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). Rispetto agli sferoidi montati su PBS, la soluzione di compensazione fornisce immagini ad alta chiarezza con una distorsione di dimensioni minime (Figura 2A). Il protocollo consente l'imaging ad alta risoluzione di dettagli a livello cellulare più in profondità negli sferoidi senza sezionamento istologico e l'immagine della sezione trasversale è stata ottenuta da un obiettivo aereo 20x (0,7 NA) con una risoluzione di 4096 x 4096 px senza cuciture (Figura 2B). Utilizzando un obiettivo a ingrandimento inferiore e ad apertura numerica inferiore con una distanza di lavoro più lunga, è possibile ottenere immagini confocali 3D che forniscono dettagli a livello cellulare a una profondità di almeno 200 μm (Figura 2C). Gli sferoidi sono stati anche criosezionati e colorati secondo il protocollo di Spoerri et al.4 e confrontati con la colorazione sferoide intera (Figura 2D, E). La Figura 2D mostra la regione ipossica dello sferoide colorato dal pimonidazolo e la Figura 2E mostra la colorazione p27kip1 che segna l'arresto del ciclo cellulare (giallo) e la colorazione nucleare DAPI (grigio). La localizzazione delle proteine e il modello di colorazione sono simili tra criosezione e compensazione e quindi non sono influenzati da questo metodo di compensazione.

La correzione dell'intensità del segnale in z consente l'imaging dell'intero sferoide. Tuttavia, la diffusione della luce dovuta al nucleo necrotico limita la capacità di visualizzare il lato opposto dello sferoide. Una penetrazione più profonda e una minore dispersione di un fluoroforo rosso lontano, come la macchia nucleare DRAQ7, consentono una rappresentazione della struttura sferoidale 3D ancora più migliorata (Figura 3). Il filmato 1 mostra il rendering 3D degli sferoidi FUCCI macchiati con DRAQ7. Una z-slice più sottile può consentire una migliore risoluzione z, ma questo aumenta significativamente il tempo di imaging e il fotosbiancamento dei fluorofori.

Per determinare se la soluzione di compensazione causa la distorsione delle dimensioni, dodici sferoidi in gel di agarosio-PBS al 2% sono stati ripresi a 6 h, 12 h, 24 h, 72 h e 168 h dopo l'introduzione della soluzione di compensazione. Le immagini sono state riassunte determinando il diametro dello sferoide, definito in base a una sfera con la stessa area di sezione trasversale dello sferoide (Figura 4A). Mentre si osserva che gli sferoidi aumentano leggermente di dimensioni nelle prime 6 ore, indicato da un cambio di piega del diametro compreso tra il 2% e il 6% (Figura 4B), dopo 24 ore a 72 ore, gli sferoidi ritornano a una dimensione approssimativamente uguale alla dimensione corrispondente nella fissazione PBS post PFA (Figura 4C).

Figura 1: Illustrazione del protocollo di montaggio e cancellazione dello sferoide. Gli sferoidi fissi e colorati vengono trasferiti in un tubo da 500 μL; il liquido in eccesso viene sostituito da 200 μL di gel di agarosio-PBS e centrifugato. Gli sferoidi vengono quindi trasferiti in un pozzo di fondo di vetro in una piastra a 24 pozzetti. Dopo che il gel è stato lasciato solidificare, viene aggiunta una soluzione di compensazione da 500 μL e gli sferoidi vengono lasciati equilibrare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Confronto tra sferoidi del melanoma umano FUCCI cancellati e non chiariti. La colorazione indica nuclei cellulari positivi per mKO2 (rosso), che indica le cellule nel gap 1; e nuclei cellulari positivi per mAG (verde), che indica le cellule nel gap 2. (A) Sferoidi cresciuti da 5000 cellule FUCCI-WM983b, raccolti al giorno 10 e ripresi in gel di agarosio-PBS e 24 ore dopo l'aggiunta della soluzione di compensazione. Il confronto tra immagini a campo luminoso e confocali prima e dopo la soluzione di compensazione mostra una distorsione delle dimensioni minime e un grande guadagno in chiarezza. Le immagini sono ottenute utilizzando un obiettivo 10x. (B) Sferoidi cresciuti da cellule FUCCI-WM164 permeabilizzate usando Triton X-100 e colorate con DRAQ7, colorando tutti i nuclei cellulari. L'immagine è ottenuta utilizzando un obiettivo 20x (0,75 NA), dimostrando che la soluzione di clearing consente l'imaging ad alta risoluzione di dettagli a livello cellulare. (C) sono state ottenute immagini 3D (10x, 0,4 NA) di sferoidi FUCCI-WM164 in PBS e 24 ore dopo l'aggiunta della soluzione di clearing. La regolazione della potenza, della tensione e dell'offset del laser su diversi piani z consente di acquisire immagini più profonde all'interno dello sferoide. (D,E) Confronto tra criosezione e sferoide intero eliminato colorato per pimonidazolo e p27kip1. (D) La colorazione del pimonidazolo in magenta mostra la regione ipossica negli sferoidi. Rosso e verde indicano FUCCI. (E) Criosezioni e sferoidi cancellati che mostrano DAPI (grigio) e p27kip1 (giallo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La compensazione consente di acquisire immagini più profonde nello sferoide con una perdita di luce minima. Immagini al microscopio confocale di uno sferoide di melanoma umano FUCCI con ingrandimento 10x e NA inferiore (0,4), consentendo l'imaging a profondità z più elevata con perdita di segnale minima. (A) fette di 3,88 μm di nuclei sferoidi colorati con DRAQ7. (B-D) risoluzione y / z nei canali 488 (mAG), 568 (mKO2) e 647 nm (DRAQ7), rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: La soluzione di compensazione ha un impatto minimo sulle dimensioni dello sferoide. (A) Distribuzione della dimensione iniziale dello sferoide (diametro equivalente) in gel PBS (n = 12 sferoidi). (B) Variazione della piega del diametro nel tempo dall'aggiunta della soluzione di compensazione. A 0 h, gli sferoidi sono solo in gel PBS. (C) Distribuzione del diametro delle pieghe cambia a 12 h, 24 h e 72 h. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmato 1: Rendering 3D di uno sferoide FUCCI macchiato con DRAQ7. Clicca qui per scaricare questo film.

Olympus ha contribuito ai costi di pubblicazione.