Selezione in vitro di aptameri per differenziare i virus infettivi da quelli non infettivi

Summary

Forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato a selezionare aptameri che si legano solo a virus infettivi e non a virus che sono stati resi non infettivi da un metodo di disinfezione o ad altri virus simili. Ciò apre la possibilità di determinare lo stato di infettività nei test portatili e rapidi.

Abstract

Le infezioni virali hanno un impatto importante sulla società; La maggior parte dei metodi di rilevamento ha difficoltà a determinare se un virus rilevato è infettivo, causando ritardi nel trattamento e ulteriore diffusione del virus. Lo sviluppo di nuovi sensori in grado di informare sull'infettività dei campioni clinici o ambientali soddisferà questa sfida insoddisfatta. Tuttavia, pochissimi metodi possono ottenere molecole sensibili in grado di riconoscere un virus infettivo intatto e differenziarlo dallo stesso virus che è stato reso non infettivo dai metodi di disinfezione. Qui, descriviamo un protocollo per selezionare gli aptameri in grado di distinguere i virus infettivi dai virus non infettivi utilizzando l'evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX). Sfruttiamo due caratteristiche di SELEX. In primo luogo, SELEX può essere personalizzato per rimuovere bersagli concorrenti, come virus non infettivi o altri virus simili, utilizzando la selezione dei contatori. Inoltre, l'intero virus può essere utilizzato come bersaglio per SELEX, anziché, ad esempio, di una proteina virale di superficie. L'intero virus SELEX consente la selezione di aptameri che si legano specificamente allo stato nativo del virus, senza la necessità di interrompere il virus. Questo metodo consente quindi di ottenere agenti di riconoscimento sulla base di differenze funzionali nella superficie dei patogeni, che non devono essere conosciute in anticipo.

Introduction

Le infezioni da virus hanno enormi impatti economici e sociali in tutto il mondo, come è diventato sempre più evidente dalla recente pandemia di COVID-19. Una diagnosi tempestiva e accurata è fondamentale nel trattamento delle infezioni virali e nella prevenzione della diffusione di virus a persone sane. Mentre sono stati sviluppati molti metodi di rilevamento dei virus, come i test PCR^1,2 e i saggi inmunoassays^3, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non sono in grado di determinare se il virus rilevato è effettivamente infettivo o meno. Questo perché la presenza di compon....

Protocol

1. Preparazione di reagenti e tamponi

1. Preparare 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) aggiungendo 0,9 M Tris-base, 0,9 M acido borico, 20 mM EDTA (sale disodico) e acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L. Mescolare fino a quando tutti i componenti sono sciolti.
2. Preparare una soluzione madre di poliacrilammide denaturante al 10% come segue. In una bottiglia di vetro da 250 ml, aggiungere 120 g di urea (8 M), 25 ml di 10x TBE, 62,5 ml di soluzione al 40% di acrilammide/bisacrilammide (29:1) e abbastanza acqua distillata per raggiungere il volume finale di 250 ml. Mescolare fino a quando tutti i componenti sono sciolti.
3. Prepar....

Results

Poiché gli aptameri del DNA possono essere ottenuti utilizzando SELEX in una provetta¹⁵, questa strategia SELEX è stata attentamente progettata per includere sia le fasi di selezione positiva verso il virus infettivo intatto e intero (cioè, mantenere le molecole di DNA che si legano al virus infettivo), sia le fasi di controselezione per lo stesso virus che è stato reso non infettivo da un particolare metodo di disinfezione, in particolare il trattamento UV, scartando le sequenze di DNA che posso.......

Discussion

SELEX permette non solo l'identificazione di aptameri ad alta affinità, nell'intervallo pM-nM 22,43,44,45^, ma anche con selettività elevata e sintonizzabile. Sfruttando la controselezione, è possibile ottenere aptameri con selettività impegnativa. Ad esempio, il gruppo Li ha dimostrato la capacità di ottenere sequenze in grado di differenziare i ceppi batterici patogeni dai ceppi non patogeni<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% persolfato di ammonio (APS)	BioRad	1610700
100% etanolo	Sigma-Aldrich	E7023
1x PBS senza calcio e magnesio	Corning	21-040-CM
40% acrilammide/bisacrilammide (29:1) soluzione	BioRad	1610146
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA perline di pulizia - Sezione 7.2.2
Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-0.5	Merck		UFC501024 cut-off 10 kDa Unità
di filtro centrifugo Amicon Ultra-0.5	Merck		UFC510024 cut-off 100 kDa
Acido borico	Sigma-Aldrich	100165
C1000 Touch Thermal Cycler con doppio modulo di reazione rapida 48/48 BioRad		1851148
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C4901
CFX Connect Sistema di rilevamento PCR in tempo reale	BioRad	1855201
Bagni secchi digitali/riscaldatori a blocchi Thermo	Scientific	88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Thermo Fisher	65001	Perle magnetiche modificate con streptavidina - Sezione 4.9
EDTA sale disodico	Sigma-Aldrich
Eppendorf Provette per microcentrifuga Safe-Lock	Sigma-Aldrich	T9661	1,5 mL
Lenti-X p24 Kit per titolo rapido	Takara Bio USA, Inc.	632200	Kit di quantificazione del lentivirus - Sezione 3.3.2.1
Rack di separazione MagJET, 12 provette da 1,5 mL	Thermo Scientific	MR02
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adesivo, ottico	BioRad	MSB1001	non assorbente UV
Tetra Cell per gel prefabbricati Ready Gel	BioRad	1658004EDU
Piastre corte Mini-PROTEAN	Piastre distanziatrici BioRad	1653308
Mini-PROTEAN con distanziatori integrati da 0,75 mm	Piastre per
molecolare	Lonza	51200
BioRad	MLP9611		Nanodrop One ad alto profilo, senza bordatura, trasparenti
	Thermo Scientific	ND-ONE-W
OneTaq DNA polimerasi	New England BioLab	M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI	Tecan	0344NB-A01	Kit di preparazione della libreria di sequenziamento ad alto rendimento - Sezione 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µ L, 20-200 & micro; L, 2-20 & micro; L e 0,2-2 µ L)	Gilson	F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Classe II, Cappe di biosicurezza di tipo A2	Labconco	4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	basato sulla fluorescenza  dsDNA quantification  - Sezione 7.2.3
Punte per pipette a bassa ritenzione SHARP Classic (10 uL, 200 uL, 1000 uL)	Thomas Scientific	1158U43, 1159M44, 1158U40
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S2889
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuga	Thermo Scientific	75002440
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	1725201	mastermix qPCR - Sezione 6.2.
Tris(idrossimetil)amminometano	Sigma-Aldrich	T1503
Provette e tappi ultra trasparenti, strisce di 8	provette per PCR	AB1183	scientifiche USA
Urea	Sigma-Aldrich	U5128