Caratterizzazione dell'interattoma del lisosoma neuronale con proteomica di marcatura di prossimità

Ashley Frankenfield; Jiawei Ni; Ling Hao

doi:10.3791/64132

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Articolo metodologico

Caratterizzazione dell'interattoma del lisosoma neuronale con proteomica di marcatura di prossimità

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DOI:

10.3791/64132

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23 giugno 2022

Ashley Frankenfield^*¹ , Jiawei Ni^*¹ , Ling Hao¹

¹Department of Chemistry, The George Washington University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Un protocollo di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma neuronale è descritto qui per caratterizzare il microambiente lisosomiale dinamico nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le proteine lisosomiali di membrana e le proteine che interagiscono con i lisosomi (stabilmente o transitoriamente) possono essere quantificate con precisione in questo metodo con un'eccellente risoluzione spaziale intracellulare nei neuroni umani vivi.

Abstract

I lisosomi comunicano frequentemente con una varietà di biomolecole per ottenere la degradazione e altre diverse funzioni cellulari. I lisosomi sono fondamentali per la funzione cerebrale umana, poiché i neuroni sono postmitotici e dipendono fortemente dalla via autofagia-lisosoma per mantenere l'omeostasi cellulare. Nonostante i progressi nella comprensione delle varie funzioni lisosomiali, catturare le comunicazioni altamente dinamiche tra i lisosomi e altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per il metodo proteomico di marcatura di prossimità del lisosoma endogeno (knock-in) recentemente pubblicato nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC).

Sia le proteine della membrana lisosomiale che le proteine che circondano i lisosomi entro un raggio di 10-20 nm possono essere identificate con sicurezza e quantificate con precisione nei neuroni umani vivi. Ogni fase del protocollo è descritta in dettaglio, cioè coltura di neuroni hiPSC, etichettatura di prossimità, raccolta di neuroni, microscopia a fluorescenza, arricchimento proteico biotinilato, digestione proteica, analisi LC-MS e analisi dei dati. In sintesi, questo esclusivo metodo di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale endogena fornisce uno strumento analitico robusto e ad alto rendimento per studiare le attività lisosomiali altamente dinamiche nei neuroni umani vivi.

Introduzione

I lisosomi sono organelli catabolici che degradano le macromolecole attraverso la via lisosomiale-autofagica¹. Oltre alla degradazione, i lisosomi sono coinvolti in diverse funzioni cellulari come la trasduzione della segnalazione, il rilevamento dei nutrienti e la secrezione ^2,3,4. Perturbazioni nella funzione lisosomiale sono state implicate nei disturbi da accumulo lisosomiale, nel cancro, nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione 3,5,6,7.