Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare embrioni di zecca. L'iniezione di embrioni è la tecnica preferita per la manipolazione genetica per generare linee transgeniche.
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Articolo metodologico
Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le zecche possono trasmettere vari patogeni virali, batterici e protozoari e sono quindi considerate vettori di importanza medica e veterinaria. Nonostante il crescente onere delle malattie trasmesse dalle zecche, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ai vettori di malattie degli insetti a causa delle sfide nell'applicazione di strumenti di trasformazione genetica per studi funzionali alla biologia unica delle zecche. Gli interventi genetici hanno guadagnato attenzione per ridurre le malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, lo sviluppo di tali interventi richiede una trasformazione germinale stabile mediante iniezione di embrioni. Tale tecnica di iniezione di embrioni è carente per i chelicerati, comprese le zecche. Diversi fattori, come uno spesso strato di cera esterno sugli embrioni di zecche, corion duro e alta pressione intraovale, sono alcuni ostacoli che in precedenza impedivano lo sviluppo del protocollo di iniezione embrionale nelle zecche. Il presente lavoro ha superato questi ostacoli e qui è descritta una tecnica di iniezione di embrioni per la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis. Questa tecnica può essere utilizzata per fornire componenti, come CRISPR / Cas9, per trasformazioni germinali stabili.
Introduzione
Le zecche sono vettori di importanza medica e veterinaria, in grado di trasmettere una varietà di patogeni virali, batterici, protozoari e nematodi 1,2. Negli Stati Uniti orientali, la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis, è un importante vettore del patogeno della malattia di Lyme (LD), la spirocheta Borrelia burgdorferi. Oltre 400.000 casi di LD sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti, rendendola la principale malattia infettiva trasmessa da vettori negli Stati Uniti1. Oltre a B. burgdorferi, altri sei microrganismi sono trasmessi da I. scapulari....
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Protocollo
Gli adulti di Ixodes scapularis sono stati acquistati dalla Oklahoma State University (OSU) o allevati presso l'Università del Nevada, Reno (UNR) (protocollo IACUC # 21-001-1118).
1. Preparazione di zecche femminili per la raccolta di embrioni
NOTA: Per raccogliere le uova di età appropriata, è importante sincronizzare la deposizione delle uova. Sebbene i segnali di deposizione delle uova nelle zecche rimangano poco chiari, nelle condizioni settarie standard (temperatura di 27 ° C e umidità relativa del >90% (RH)), le femmine di I. scapularis iniziano a deporre le uova circa 8 gio....
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Risultati
Un protocollo di iniezione embrionale di successo per I. scapularis è descritto in questo articolo. Le femmine che depongono le uova sono state mantenute ad alta umidità per evitare l'essiccazione delle uova parzialmente cerate. Lo strato di cera è stato rimosso per iniettare embrioni di zecca ablando l'organo del gene (ghiandola di cera) della femmina gravida (Figura 1A-E). Abbiamo usato aghi di vetro alluminosilicati con un collo più corto (
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Discussione
Questo è il primo protocollo sviluppato per iniettare con successo embrioni di zecca precoci. È stato raggiunto un tasso di sopravvivenza di ~ 4% -8%, che è paragonabile all'iniezione di embrioni in altri modelli di insetti ben consolidati5.
Poiché questo è il protocollo iniziale, si prevede che questo protocollo sarà ulteriormente perfezionato e specializzato per le singole specie di zecche. In particolare, i tempi di iniezione varieranno da specie a specie, a seconda .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Channa Aluvihare e Yonus Gebermicale, ITF, UMD, per la comprensione e il supporto durante la fase iniziale dello sviluppo del protocollo. Gli aghi di tungsteno sono stati un dono generoso di David O'Brochta, ITF, UMD. Siamo grati al Dr. Ladislav Simo per aver testato questo protocollo in I. ricinus e per le discussioni approfondite. Questo progetto è stato finanziato da NIH-NIAID R21AI128393 e Plymouth Hill Foundation, NY a MG-N, fondi di avvio dall'Università del Nevada ad AN, il National Science Foundation Grant No. 2019609 a MG-N e AN e una sovvenzione peer-to-peer da IGTRCN a AS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Capillari in silicato di alluminio, con filamento | Strumenti Sutter | AF100-64-10 | Iniezione di embrioni |
| Cloruro di benzalconio 50% in acqua, 25 g | TCI-America | B0414 | Trattamento embrionale, 25 g è circa 25 mL |
| Carta da filtro | Whatman | 1001-090 | Cura post-iniezione |
| Pinze | Thomas Scientific | 300-101 | Organo del gene manipolazione |
| Salviette da laboratorio | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Punte per microloader | Eppendorf | 930001007 | Caricamento degli aghi tirati |
| Micromanipolatore | Strumenti Sutter | ROE-200 | Iniezione di embrioni |
| Vetrini microscopici - bordi lisci e rettificati | Genesee Scientific | 29-100 | Allineamento dell'embrione, i bordi rettificati sono preferibili, i bordi smussati potrebbero oscurare le uova dalla vista |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Trattamento degli embrioni |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Nastro biadesivo permanente | Scotch | 34-8716-3417-5 | Allineamento degli embrioni |
| Piastre di Petri | Genesee Scientific | 32-107G | Cura post-iniezione |
| Tegaderm/ Trasparente rivestimento in pellicola | 3M Healthcare | 1628 | Allineamento degli embrioni Aghi |
| di tungsteno | Strumenti di scienza fine | 10130-10 | Manipolazione degli organi dei geni |
| Filo di tungsteno | Amazon | B08DNT7ZK3 | Manipolazione degli organi dei geni |
| Microiniettore digitale XenoWorks | Sutter | MPC-200 | Iniezione di embrioni |
Riferimenti
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection....
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Ristampe e permessi
