Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis

Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare embrioni di zecca. L'iniezione di embrioni è la tecnica preferita per la manipolazione genetica per generare linee transgeniche.

Abstract

Le zecche possono trasmettere vari patogeni virali, batterici e protozoari e sono quindi considerate vettori di importanza medica e veterinaria. Nonostante il crescente onere delle malattie trasmesse dalle zecche, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ai vettori di malattie degli insetti a causa delle sfide nell'applicazione di strumenti di trasformazione genetica per studi funzionali alla biologia unica delle zecche. Gli interventi genetici hanno guadagnato attenzione per ridurre le malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, lo sviluppo di tali interventi richiede una trasformazione germinale stabile mediante iniezione di embrioni. Tale tecnica di iniezione di embrioni è carente per i chelicerati, comprese le zecche. Diversi fattori, come uno spesso strato di cera esterno sugli embrioni di zecche, corion duro e alta pressione intraovale, sono alcuni ostacoli che in precedenza impedivano lo sviluppo del protocollo di iniezione embrionale nelle zecche. Il presente lavoro ha superato questi ostacoli e qui è descritta una tecnica di iniezione di embrioni per la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis.  Questa tecnica può essere utilizzata per fornire componenti, come CRISPR / Cas9, per trasformazioni germinali stabili.

Introduzione

Le zecche sono vettori di importanza medica e veterinaria, in grado di trasmettere una varietà di patogeni virali, batterici, protozoari e nematodi ^1,2. Negli Stati Uniti orientali, la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis, è un importante vettore del patogeno della malattia di Lyme (LD), la spirocheta Borrelia burgdorferi. Oltre 400.000 casi di LD sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti, rendendola la principale malattia infettiva trasmessa da vettori negli Stati Uniti¹. Oltre a B. burgdorferi, altri sei microrganismi sono trasmessi da I. scapularis, tra cui quattro batteri (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi e Ehrlichia muris eauclarensis), un protozoo parassita (Babesia microti) e un virus (Powassan virus), rendendo questa specie di zecche un importante problema di salute pubblica³ . Mentre le malattie trasmesse dalle zecche sono diventate più diffuse negli ultimi anni, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ad altri vettori di artropodi, come le zanzare, a causa della biologia unica delle zecche e delle sfide associate all'applicazione di strumenti genomici genetici e funzionali ^4,5.

Le tecniche di modifica genetica, in particolare CRISPR / Cas9, hanno ora reso fattibili studi di genomica funzionale in organismi non modello. Per creare mutazioni ereditabili in un organismo, l'iniezione di embrioni rimane il metodo preferito per fornire costrutti per alterare la linea germinale 6,7,8,9. Tuttavia, fino a poco tempo fa⁴, le uova di zecca erano considerate troppo difficili o addirittura impossibili da iniettare senza uccidere l'embrione^10,11. Uno spesso strato di cera sulle uova, corion duro e alta pressione intraovale erano alcuni dei principali ostacoli che impedivano l'iniezione di embrioni nelle zecche. Gli adulti, alimentati con sangue I. scapularis depositano una singola frizione fino a 2.000 uova¹² in 3-4 settimane (circa 100 uova / giorno). Le uova vengono deposte singolarmente e ogni uovo è ricoperto di cera secreta da sporgenze o "corna" dell'organo ghiandolare di Gené^13,14,15 della madre. Questa cera protegge le uova dall'essiccazione e contiene composti antimicrobici¹⁵. Per iniettare con successo le uova di zecca, è importante rimuovere lo strato di cera, ammorbidire il corion e asciugare le uova per ridurre la pressione intraovale in modo che l'iniezione non danneggi irreversibilmente l'uovo. Comprendendo l'importanza critica delle iniezioni embrionali per il successo della trasformazione germinale, viene sviluppato un protocollo per I. scapularis, che può essere utilizzato per fornire un costrutto CRISPR / Cas9 e generare mutazioni germinali stabili⁴. Oltre al suo contributo alla ricerca su I. scapularis, questo protocollo potrebbe anche essere ottimizzato per altre specie di zecche.

Protocollo

Gli adulti di Ixodes scapularis sono stati acquistati dalla Oklahoma State University (OSU) o allevati presso l'Università del Nevada, Reno (UNR) (protocollo IACUC # 21-001-1118).

1. Preparazione di zecche femminili per la raccolta di embrioni

NOTA: Per raccogliere le uova di età appropriata, è importante sincronizzare la deposizione delle uova. Sebbene i segnali di deposizione delle uova nelle zecche rimangano poco chiari, nelle condizioni settarie standard (temperatura di 27 ° C e umidità relativa del >90% (RH)), le femmine di I. scapularis iniziano a deporre le uova circa 8 giorni dopo il distacco dell'ospite. Questa linea temporale può essere allungata immagazzinando femmine piene a 4 °C. Abbiamo conservato femmine alimentate con sangue a 4 °C fino a 8 settimane senza alcun effetto negativo sulla deposizione delle uova. Queste condizioni potrebbero dover essere modificate per ogni insettario.

1. Conservare tutte le femmine piene a 4 °C con >90% di umidità relativa in una scatola di plastica da 6 litri rivestita con carta da filtro umida fino a quando non vengono utilizzate per microiniezioni.
2. Una settimana prima delle iniezioni, trasferire le femmine da 4 °C a un'incubatrice a 27 °C per l'inizio della deposizione delle uova.
3. Quando le femmine iniziano a deporre le uova (3-4 giorni dopo averle spostate a 27 °C), rimuovere le uova con un pennello a punta fine e preparare le femmine per l'ablazione dell'organo di Gené (ghiandola di cera).
   NOTA: L'organo del Gené si estende dall'area tra lo scudo e il capitulum (base dorsale dell'apparato boccale), l'apparato boccale si piega sulla superficie ventrale del corpo (parallelo alla superficie) e l'organo esteso del gene ricopre le uova non appena le uova vengono deposte (Figura 1). Le uova deposte prima dell'asportazione dell'organo di Gené o dello svuotamento della cera avranno un rivestimento di cera e non sono adatte per le iniezioni e devono essere scartate.
4. Per rimuovere o svuotare l'organo del Gené, utilizzare l'argilla per posizionare la femmina ingorgata su un vetrino al microscopio orientato in modo che l'apparato boccale sia visibile su entrambi i lati ventrale e dorsale (Figura 1B,C).
   1. Colpire con attenzione l'area esattamente tra lo scudo e l'apparato boccale usando pinze sottili e aghi di tungsteno realizzati in laboratorio utilizzando filo di tungsteno seguendo un protocollo¹⁶ precedentemente pubblicato (gli aghi possono anche essere acquistati in commercio e attaccati a una sonda di micro dissezione, vedi Tabella dei materiali).
   2. Lavorando all'interno con l'ago di tungsteno, estrarre la ghiandola di cera (Figura 1D,E). Potrebbero essere necessari alcuni minuti per rimuovere la ghiandola. Pulire via la secrezione di cera liquida usando salviette da laboratorio.
      NOTA: La ghiandola può anche essere rimossa dal lato ventrale proprio sotto l'apparato boccale; raggiungendo nella parte posteriore verso lo scudo con ago e una pinza. L'applicazione di colla siliconica intorno all'apparato boccale blocca anche l'eversione dell'organo di Gene e può essere utilizzata al posto di rimuovere o svuotare la cera (comunicazione personale con il Dr. Ladislav Simo, INRAE, Francia). Le zecche ingorgate non rimarranno sul nastro biadesivo. L'uso dell'argilla per "fasciare" il segno di spunta aiuta a mantenerli in posizione durante la manipolazione. Utilizzare una pinza per tenere la zecca e l'ago di tungsteno per la dissezione. La parte ventrale è più facile da perforare con un ago e preferita dagli autori.
5. Per svuotare la ghiandola, disporre il segno di spunta gravido come indicato nel passaggio 1.4. Forare con cura l'area dietro l'apparato boccale sul lato dorsale e applicare pressione sul lato ventrale usando una pinza.
   NOTA: In alternativa, non è necessario rimuovere la ghiandola di cera; Svuotare la ghiandola di cera durerà per diversi giorni. Le femmine che depongono le uova hanno un'area bianca intorno alle parti della bocca che indica la posizione della ghiandola di cera e può essere utilizzata come riferimento.
   1. Posizionare il bordo di una salvietta da laboratorio priva di lanugine e rimuovere la cera liquida che fuoriesce dal sito di puntura. Assicurarsi di evitare la secrezione di emolinfa, che è un liquido chiaro rispetto alla cera viscosa leggermente giallastra. Potrebbero essere necessari 5-10 minuti prima che la maggior parte della cera venga rimossa.
6. Dopo la manipolazione, mettere le femmine in un'incubatrice a 27 ° C (>90% RH) e consentire loro di recuperare per 1-2 giorni.
   NOTA: Le femmine trattate di solito impiegano 1-2 giorni per recuperare e ricominciare a deporre le uova.
7. Quando le femmine ricominciano a deporre le uova, usate un pennello fine per raccogliere le uova appena depositate (0-18 ore dopo la deposizione delle uova) e mettetele in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
   NOTA: Se si utilizzano uova della stessa femmina nel tempo, questa procedura deve essere ripetuta dopo 4-5 giorni di deposizione delle uova se le ghiandole non sono state rimosse.

2. Trattamento embrionale per microiniezioni

1. Aggiungere ~200 μL (o volume sufficiente per coprire le uova, a seconda del numero di uova) del 5% (peso/volume) di benzalconio cloruro/acqua (vedi tabella dei materiali) nel tubo contenente uova vecchie 0-18 ore. Ruotare delicatamente le uova con il pennello per 5 minuti per evitare che le uova si depositino sul fondo del tubo (per i dettagli, vedere Sharma et ^al.4). Rimuovere il surnatante usando una micropipetta, lasciando le uova nel tubo.
   ATTENZIONE: Il benzalconio cloruro è corrosivo per la pelle e gli occhi, indossare guanti e protezione per gli occhi.
2. Aggiungere ~ 200 μL di acqua distillata (DI) al tubo contenente le uova, ruotare con un pennello e rimuovere l'acqua dal tubo della microcentrifuga usando una micropipetta. Ripetere il lavaggio con acqua DI ancora una volta.
3. Dopo il lavaggio con acqua DI, aggiungere ~ 200 μL di cloruro di sodio (NaCl) al 5% (p/v) e agitare delicatamente con un pennello per 5 minuti. Rimuovere la soluzione dal tubo dopo 5 minuti e lavare le uova due volte con acqua DI.
4. Aggiungere ~100 μL di soluzione di NaCl all'1% (p/v) nella provetta della microcentrifuga contenente le uova. Conservare le uova in una soluzione di NaCl all'1% (p/v) fino a quando non vengono utilizzate per le iniezioni.
5. Inizia le microiniezioni dopo circa un'ora. Questa linea temporale aiuta nella corretta essiccazione delle uova e impedisce loro di scoppiare.
   NOTA: Le uova possono essere conservate in soluzione di NaCl all'1% (p/v) per 7-8 ore senza influire significativamente sulla sopravvivenza. Se le uova sono difficili da iniettare o scoppiare, le uova non sono abbastanza essiccate e possono essere ulteriormente trattate con NaCl al 5% (p/v) per altri 5 minuti.

3. Preparazione degli aghi per iniezione

1. Inserire un vetro capillare alluminosilicato (con filamento, vedere Tabella dei materiali) nell'estrattore di aghi seguendo le istruzioni del produttore.
2. Regolare l'estrattore dell'ago sulle seguenti impostazioni: Calore: 575, Tiro: 20, Velocità: 50, Tempo: 200 e Pressione: 700.
3. Attivare la funzione di trazione dell'estrattore di aghi e ripetere il processo per altri aghi.
4. Conservare gli aghi tirati infilandoli in linee di argilla del modellatore in una capsula di Petri pulita.
5. Caricare l'ago con la miscela per iniezione utilizzando una punta di micro caricatore (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Il confronto degli aghi utilizzati per l'iniezione di embrioni di zecche e zanzare è mostrato nella Figura 2.

4. Configurazione del vetrino per le microiniezioni

1. Utilizzando del nastro biadesivo, far aderire due vetrini per microscopio di vetro insieme, lasciando uno spazio di circa 0,5 cm per sostenere l'allineamento delle uova e impedire loro di rotolare durante le iniezioni (Figura 3A).
2. Applicare un pezzo di pellicola trasparente (vedi Tabella dei materiali) sul nastro biadesivo nello spazio tra le diapositive. Assicurarsi di allineare perfettamente la pellicola con lo spazio.

5. Microiniezioni embrionali

1. Allineare 8-10 uova alla volta sulla configurazione della diapositiva (sopra) usando un pennello a pelo singolo.
   NOTA: Le uova allineate con l'asse perpendicolare più lungo (Figura 3B) al bordo di scorrimento sono più facili da iniettare rispetto alle uova il cui asse longitudinale è allineato parallelamente al bordo (Figura 3C). Le uova con orientamento perpendicolare (Figura 3B) possono resistere meglio all'iniezione, con conseguente maggiore sopravvivenza.
2. Posizionare il vetrino con le uova allineate sul palco di un microscopio composto. Utilizzare un pezzo di salvietta priva di lanugine per rimuovere la soluzione di NaCl all'1% in cui sono conservati.
3. Collegare l'ago per iniezione riempito a un microiniettore collegato a un micromanipolatore (vedere Tabella dei materiali).
4. Aprire l'ago strofinando delicatamente contro la superficie dell'uovo utilizzando un'impostazione ad alta pressione sul microiniettore (>5.000 hPa).
5. Dopo l'apertura dell'ago, ridurre la pressione (1.000-2.500 hPa) del microiniettore a seconda dell'apertura dell'ago.
   NOTA: un'apertura piccola richiederà una pressione relativamente più elevata, mentre un'apertura più grande richiederà una pressione inferiore. Questo per controllare il volume del costrutto iniettato. A seconda delle dimensioni dell'apertura dell'ago, il volume di iniezione varierà da 1 a 5 pL.
6. Iniettare tutte le uova sul vetrino con un angolo di 10°-15° il più rapidamente possibile e spostare immediatamente il vetrino in condizioni di elevata umidità in una capsula di Petri rivestita con carta umida. Non appena le uova vengono iniettate, iniziano a essiccare.
   NOTA: L'iniezione di un piccolo numero di uova alla volta aumenta il successo dell'iniezione e la probabilità di sopravvivenza. Gli aghi si ostruiscono a causa del reflusso embrionale. Se la punta è ancora affilata, per eliminare gli aghi ostruiti, spostare l'ago in una piccola goccia di NaCl all'1% aggiunta al bordo del vetrino. L'azione capillare rimuoverà il piccolo intasamento. Se l'ago è già smussato, cambialo.

6. Cura post-iniezione degli embrioni

1. Posizionare il vetrino contenente gli embrioni iniettati in una grande capsula di Petri rivestita con carta da filtro umida.
   NOTA: È fondamentale non disturbare le uova per almeno 5-6 ore. Ciò consente alla ferita da iniezione di sigillarsi correttamente. La ferita da iniezione può aprirsi quando agitata e il citoplasma può iniziare a trasudare, con conseguente mortalità delle uova.
2. Dopo 5-6 ore, aggiungere una piccola goccia di acqua DI alla medicazione trasparente con embrioni iniettati attaccati. Usando un pennello, spostare delicatamente le uova. Trasferire le uova in una piccola capsula di Petri (10 cm) e immergerle in acqua DI.
   NOTA: La medicazione del film consente una facile rimozione delle uova dopo le iniezioni. Nel momento in cui una goccia d'acqua viene aggiunta alla medicazione del film, le uova inizieranno a muoversi insieme all'acqua.
3. Tenere le uova immerse in acqua e mettere la capsula di Petri in una scatola di plastica da 6 litri in un'incubatrice a 27 °C e >90% RH.
4. Controlla le uova regolarmente, ogni giorno per i primi giorni, e poi ogni 3-4 giorni fino a quando le larve iniziano a schiudersi.
   NOTA: Se un gran numero di uova viene danneggiato durante le microiniezioni, drenare delicatamente l'acqua DI dopo una settimana impedirà la crescita fungina sulle uova morte.
5. Quando le larve iniziano a schiudersi dagli embrioni iniettati (21-25 giorni dopo l'iniezione per l'attuale configurazione di laboratorio), controllarle quotidianamente e trasferire eventuali larve tratteggiate in fiale di vetro con uno schermo in cima. Le larve possono schiudersi sott'acqua e sopravvivere per ~ 1-2 settimane.
6. Schermare le larve⁴ se le uova sono state iniettate con un costrutto che può risultare in un fenotipo visibile.

Risultati

Un protocollo di iniezione embrionale di successo per I. scapularis è descritto in questo articolo. Le femmine che depongono le uova sono state mantenute ad alta umidità per evitare l'essiccazione delle uova parzialmente cerate. Lo strato di cera è stato rimosso per iniettare embrioni di zecca ablando l'organo del gene (ghiandola di cera) della femmina gravida (Figura 1A-E). Abbiamo usato aghi di vetro alluminosilicati con un collo più corto (

Discussione

Questo è il primo protocollo sviluppato per iniettare con successo embrioni di zecca precoci. È stato raggiunto un tasso di sopravvivenza di ~ 4% -8%, che è paragonabile all'iniezione di embrioni in altri modelli di insetti ben consolidati⁵.

Poiché questo è il protocollo iniziale, si prevede che questo protocollo sarà ulteriormente perfezionato e specializzato per le singole specie di zecche. In particolare, i tempi di iniezione varieranno da specie a specie, a seconda ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Capillari in silicato di alluminio, con filamento	Strumenti Sutter	AF100-64-10	Iniezione di embrioni
Cloruro di benzalconio 50% in acqua, 25 g	TCI-America	B0414	Trattamento embrionale, 25 g è circa 25 mL
Carta da filtro	Whatman	1001-090	Cura post-iniezione
Pinze	Thomas Scientific	300-101	Organo del gene manipolazione
Salviette da laboratorio	Genesee Scientific	88-115
Punte per microloader	Eppendorf	930001007	Caricamento degli aghi tirati
Micromanipolatore	Strumenti Sutter	ROE-200	Iniezione di embrioni
Vetrini microscopici - bordi lisci e rettificati	Genesee Scientific	29-100	Allineamento dell'embrione, i bordi rettificati sono preferibili, i bordi smussati potrebbero oscurare le uova dalla vista
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Trattamento degli embrioni
Needle Puller	Sutter Instruments	P-1000
Nastro biadesivo permanente	Scotch	34-8716-3417-5	Allineamento degli embrioni
Piastre di Petri	Genesee Scientific	32-107G	Cura post-iniezione
Tegaderm/ Trasparente rivestimento in pellicola	3M Healthcare	1628	Allineamento degli embrioni Aghi
di tungsteno	Strumenti di scienza fine	10130-10	Manipolazione degli organi dei geni
Filo di tungsteno	Amazon	B08DNT7ZK3	Manipolazione degli organi dei geni
Microiniettore digitale XenoWorks	Sutter	MPC-200	Iniezione di embrioni