Isolamento di cellule endoteliali glomerulari di topo condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti

Summary

L'articolo descrive il metodo per isolare cellule endoteliali glomerulari condizionatamente immortalizzate dai reni di topi transgenici che esprimono il virus termolabile delle scimmie 40 e mitocondri fotoattivabili, PhAM^asportato. Descriviamo la procedura per l'isolamento dei glomeruli da reni interi usando perline, fasi di digestione, semina e coltura di GEC-CD31 positivi.

Abstract

La disfunzione delle cellule endoteliali glomerulari (GEC) può avviare e contribuire alla rottura della barriera di filtrazione glomerulare. L'aumento dello stress ossidativo mitocondriale è stato suggerito come meccanismo che provoca la disfunzione GEC nella patogenesi di alcune malattie glomerulari. Storicamente l'isolamento degli OG dai modelli in vivo è stato notoriamente impegnativo a causa delle difficoltà nell'isolare colture pure dai glomeruli. Gli OG hanno requisiti di crescita complessi in vitro e una durata di vita molto limitata. Qui, descriviamo la procedura per isolare e coltivare GEC condizionatamente immortalati con mitocondri fluorescenti, consentendo il monitoraggio degli eventi di fissione e fusione mitocondriale. I GEC sono stati isolati dai reni di un topo transgenico doppio che esprime il termolabile SV40 TAg (dall'Immortomouse), promuovendo condizionatamente la proliferazione e sopprimendo la differenziazione cellulare, e una proteina fluorescente fotoconvertibile (Dendra2) in tutti i mitocondri (dal topo mitocondriale fotoattivabile^). La linea cellulare stabile generata consente la differenziazione cellulare dopo l'inattivazione del gene immortalizzante SV40 TAg e la foto-attivazione di un sottogruppo di mitocondri causando un passaggio della fluorescenza dal verde al rosso. L'uso di mitoDendra2-GEC consente l'imaging dal vivo degli eventi di distribuzione, fusione e fissione dei mitocondri fluorescenti senza colorare le cellule.

Introduction

Il glomerulo è fondamentale per la filtrazione del sangue limitando il passaggio di grandi molecole attraverso la barriera di filtrazione glomerulare ^1,2. Il glomerulo contiene quattro tipi di cellule: cellule epiteliali parietali, podociti (cellule epiteliali viscerali), cellule endoteliali glomerulari (GEC) e cellule mesangiali³. L'endotelio glomerulare è caratterizzato da una struttura vascolare unica, come per la presenza di fenestrae richieste per grandi volumi di filtrazione⁴. La superficie apicale dell'endotelio glomerulare è ricoperta da uno strato di gli....

Protocol

Tutte le procedure animali qui descritte sono state approvate dalla IACUC presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai. Abbiamo usato tre topi maschi (topi transgenici H-2Kb-tsA58 con mitocondri fotoattivabili [PhAM]) acquistati dal laboratorio Jackson e tenuti su una normale dieta chow.

1. Condizioni di lavoro e preparativi

1. Pulire lo spazio di lavoro all'interno della cappa a flusso laminare utilizzando etanolo al 70% e luce UV-C.
2. Preparare i tamponi di lavaggio del tallone. Fare tampone-1 usando 0,1 M fosfato di sodio a pH 7,4-8,0, tampone-2 usando 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) senz....

Results

In questo articolo, viene descritto un protocollo dettagliato per l'isolamento di cellule endoteliali glomerulari condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti stabili (mitoDendra2-GECs) (Figura 1). L'uso di giovani topi di 6-10 settimane è essenziale per ottenere un numero considerevole di cellule sane. Dopo 3 giorni di coltura, le cellule iniziano a crescere lentamente dai glomeruli isolati, come mostrato in Figura 3G. Dopo 7 giorni, le cellule .......

Discussion

I mitocondri sono fondamentali per il metabolismo cellulare, l'omeostasi e le risposte allo stress e la loro disfunzione è legata a molte malattie, tra cui le malattie renali. I mitocondri hanno un ruolo nella generazione patologica di specie reattive eccessive dell'ossigeno (ROS), nella regolazione dei livelli intracellulari di calcio, nelle vie di morte cellulare e nella dinamica citoscheletrica^21,22,23.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µ filtro cellulare m	Fisher	22-363-549
Siringhe da insulina da 1 ml	BD	329424
25G farfalla	BD	367298
forbici taglienti da 3 mm	F.S.T	15000-00
siringa da 30 ml	BD Biooscience	309650
40 &; filtro per cellule m	Fisher	22-363-547
40 µ m rete
Bonn Forbici	F.S.T	14184-09
Albumina sierica bovina	Fisher	BP1600-100
CD31	abcam	ab7388
Collagenasi tipo I	Corning	354236
Collagenasi tipo II	SIGMA	C6885	125CDU/mg
Collagene tipo IV	SIGMA	C5533-5M
Dnase-I	Qiagen	79254
Dynabeads 450	Thermofisher Scientific	14013
terreno di crescita delle cellule endoteliali	Lonza	cc-3156
Pinza graefe extra fine	F.S.T	11150-10
FBS	Gemini	100-106	Fibronectina inattivata a caldo
	Thermofisher	33016015
Pinza fine	F.S.T Dumont	E6511
HBSS	GIBCO	14065-056
IFNg	Cell Science	CRI001B
Laboratorio Immortomouse	Jackson	32619	Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-Glutammina 100x	Thermofisher Scientific	25030081
Concentratore di particelle magnetiche	Thermofisher Scientific	12320D
mitotracker	Thermofisher Scientific	M7512
PBS 1X	Corning	46-013-CM
penecillina streptomicina 100x	Thermofisher Scientific	10378016
PhaM topi	Jackson laboratory	18397	B6; 129S-GT (ROSA) 26Sortm1.1 (CAG-COX8A / Dendra2) Dcc / J
Proteasi (10 mg / ml)	SIGMA	P6911
RPMI	GIBCO	3945
Piruvato di sodio 100mM	Thermofisher Scientific	11360070
Pinza modello standard	Forbici	11000-12
- Sharp-Blunt	FST	14008-14
sinaptopodina	Santa Cruz	sc-515842
tripsina 0,05%	Thermofisher	Scientific 25300054