Preparazione e valutazione strutturale di monostrati di cellule epiteliali in un dispositivo di coltura microfluidica di dimensioni fisiologiche

Eshan  B. Damle; Eiichiro Yamaguchi; Joshua E. Yao; Donald P. Gaver III

doi:10.3791/64148

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Articolo metodologico

Preparazione e valutazione strutturale di monostrati di cellule epiteliali in un dispositivo di coltura microfluidica di dimensioni fisiologiche

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DOI:

10.3791/64148

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1 luglio 2022

Eshan B. Damle¹ , Eiichiro Yamaguchi¹ , Joshua E. Yao¹ , Donald P. Gaver III¹

¹Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In questo articolo

Sommario

Il protocollo presentato descrive lo sviluppo e l'uso di una tecnica di colorazione filamentosa-actina a base di falloidina con microscopia a scansione laser confocale (CLSM) per visualizzare la struttura dello strato cellulare aderente nei canali di coltura dinamica microfluidica e nelle tradizionali camere di coltura statica a pozzo fisso. Questo approccio aiuta a valutare la confluenza dello strato cellulare, la formazione del monostrato e l'uniformità dello spessore dello strato.

Abstract

La sperimentazione microfluidica in vitro ha un grande potenziale per rivelare molte informazioni sui fenomeni microfisiologici che si verificano in condizioni come la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e il danno polmonare indotto da ventilatore (VILI). Tuttavia, gli studi su canali microfluidici con dimensioni fisiologicamente rilevanti per i bronchioli terminali del polmone umano affrontano attualmente diverse sfide, soprattutto a causa delle difficoltà nello stabilire condizioni di coltura cellulare appropriate, comprese le velocità di flusso dei media, all'interno di un determinato ambiente di coltura. Il protocollo presentato descrive un approccio basato su immagini per valutare la struttura di cellule epiteliali polmonari umane NCI-H441 coltivate in un canale microfluidico impermeabile all'ossigeno con dimensioni fisiologicamente rilevanti per i bronchioli terminali del polmone umano. Utilizzando la colorazione filamentosa-actina a base di falloidina, le strutture citoscheletriche delle cellule vengono rivelate dalla microscopia a scansione laser confocale, consentendo la visualizzazione di cellule individuali e stratificate. La quantificazione successiva determina se le condizioni di coltura cellulare impiegate producono monostrati uniformi adatti per ulteriori sperimentazioni. Il protocollo descrive i metodi di coltura cellulare e di valutazione degli strati nei canali microfluidici e nei tradizionali ambienti a pozzetti fissi. Ciò include la costruzione del canale, la coltura cellulare e le condizioni richieste, la fissazione, la permeabilizzazione e la colorazione, l'imaging microscopico confocale, l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

Introduzione

La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è una condizione acuta derivante dalla beffa e dalla propagazione di lesioni nel parenchima polmonare, con conseguente edema polmonare degli alveoli, scambio gassoso inadeguato e successiva ipossiemia¹. Questo avvia un ciclo di rilascio di citochine pro-infiammatorie, reclutamento di neutrofili, rilascio di mediatori tossici e danno tissutale, che a sua volta comporta un'ulteriore risposta infiammatoria². Inoltre, il tensioattivo polmonare, che stabilizza le vie aeree e previene i danni causati dal reclutamento / dereclutamento ripetitivo (R / D), può essere inattivato o ....