Gli espianti retinici ottenuti da macachi selvatici sono stati coltivati in vitro. La degenerazione retinica e la via di segnalazione cGMP-PKG sono state indotte utilizzando l'inibitore della PDE6 zaprinast. L'accumulo di cGMP negli espianti a diverse concentrazioni di zaprinast è stato verificato utilizzando l'immunofluorescenza.
Articolo metodologico
Colture organotipiche di espianti retinici da scimmia macaco
In questo articolo
Sommario
Abstract
La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori. L'iperattivazione della via ciclica della proteina chinasi dipendente dalla guanosina monofosfato (cGMP) (PKG) nelle cellule dei fotorecettori causa la morte delle cellule dei fotorecettori, specialmente nei modelli che ospitano mutazioni della fosfodiesterasi 6b (PDE6b). Precedenti studi sulla RD hanno utilizzato principalmente modelli murini come topi rd1 o rd10 . Date le differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, è importante capire fino a che punto le retine di primati e roditori sono comparabili. I macachi condividono un alto livello di somiglianza genetica con gli esseri umani. Pertanto, i macachi selvatici (di età compresa tra 1-3 anni) sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici che includevano il complesso epitelio pigmentato retinico-retinico (RPE)-coroide. Questi espianti sono stati trattati con diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG e simulare la patogenesi RD. L'accumulo di cGMP e la morte cellulare negli espianti retinici dei primati sono stati successivamente verificati utilizzando l'immunofluorescenza e il saggio TUNEL. Il modello retinico dei primati stabilito in questo studio può servire per studi pertinenti ed efficaci sui meccanismi della RD cGMP-PKG-dipendente, nonché per lo sviluppo di futuri approcci terapeutici.
Introduzione
La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori ed è causata da mutazioni in un'ampia varietà di geni patogeni1. Il risultato finale della RD è la perdita della vista e nella stragrande maggioranza dei casi la malattia rimane incurabile fino ad oggi. Pertanto, è importante studiare i meccanismi cellulari che portano alla morte dei fotorecettori utilizzando modelli che rappresentino fedelmente la condizione della malattia umana. Qui, i modelli basati sui primati sono di particolare interesse a causa della loro vicinanza agli esseri umani. In particolare, tal....
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Protocollo
Lo studio sugli animali è stato esaminato e approvato dal Comitato di revisione etica dell'Istituto di zoologia, dall'Accademia cinese delle scienze (IACUC-PE-2022-06-002) e dalla revisione dell'etica animale e dal protocollo animale dell'Università dello Yunnan (YNU20220149).
1. Preparazione di espianti retinici
- Ottenere bulbi oculari di primati da macachi selvatici, di età compresa tra 1 e 3 anni, conservarli in una soluzione di conservazione dei tessuti e trasportarli su ghiaccio entro 3 ore dall'enucleazione dopo che le scimmie sono state sacrificate o dopo la morte naturale.
- Per la preparazione dell....
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Risultati
In questo studio, la coltura retinica di espianti di scimmia macaco è stata eseguita utilizzando espianti contenenti il complesso retina-RPE-coroide (Figura 1, Figura supplementare S1). Rispetto alla coltura in vitro di cellule retiniche che utilizzano la retina senza RPE e coroide collegati, la nostra coltura di espianti facilita una migliore sopravvivenza cellulare e, di conseguenza, prolunga la sopravvivenza delle cellule dei fotorecettori.
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Discussione
La fototrasduzione visiva si riferisce al processo biologico mediante il quale i segnali luminosi vengono convertiti in segnali elettrici dalle cellule dei fotorecettori all'interno della retina dell'occhio. Le cellule dei fotorecettori sono neuroni polarizzati capaci di fototrasduzione, e ci sono due diversi tipi di fotorecettori chiamati coni e bastoncelli dopo le forme dei loro segmenti esterni. I bastoncelli sono responsabili della visione scotopica e i coni sono responsabili della visione fotopica e ad alta acuità. .......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (n. 81960180), della Zinke Heritage Foundation e della Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Ringraziamo il Prof. Longbao Lv (Istituto di Zoologia, Accademia Cinese delle Scienze, Kunming, Cina) per aver condiviso i bulbi oculari delle scimmie utilizzati in questo studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | B2064 | Soluzione bloccante |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Integratori di Medium completo |
| DL-tocoferolo | Sigma | T1539 | Integratori di Medium completo |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Anticorpo secondario di cGMP |
| Soluzione di acido acetico etanolo | Shyuanye | R20492 | Liquido di fissaggio |
| Siero bovino fetale Gemini | 900-108 | Soluzione | |
| bloccante Microscopio a fluorescenza | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Imaging in immunofluorescenza |
| Glutammina | Sigma | G8540 | Integratori di |
| glutatione | Sigma | G6013 | Supplementi del kit completo per |
| il rilevamento della morte cellulare in situ del terreno, test TMR rosso | Roche | 12156792910 | TUNEL |
| Insulina | Sigma | 16634 | Integratori di |
| L-cisteina del terreno completo HCl | Sigma | C7477 | Integratori di |
| acido linoleico | Sigma | L1012 | Integratori di |
| MACS completo per la conservazione dei tessuti Soluzione | Miltenyi | 130-100-008 | Conservazione ottimizzata di campioni freschi di organi e tessuti |
| Siero d'asino normale | Solarbio | SL050 | Soluzione bloccante |
| Paraformaldeide (PFA) | Biosharp | BL539A | Agente fissante |
| PEN. / STREP. 100&volte; | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillina / Streptomicina antibiotici |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS) | Solarbio | P1010 | Soluzione tampone |
| Povidone-iodio | Shanghailikang | 310411 | Agente disinfettante |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Integratori di |
| proteinasi | Millpore | 539480 | Proteina di scomposizione |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Retinolo medio di base |
| Sigma | R7632 | Integratori di | |
| acetato di retinile | Sigma | R7882 | Integratori di |
| pecora media completa anti-cGMP | Jan de Vente, Università di Maastricht, Paesi Bassi | Anticorpo primario di saccarosio | |
| cGMPGHTECH | 57-50-1 | Agente disidratante | |
| T3 | Sigma | T6397 | Integratori di terreno completo |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Terreno di inclusione |
| Tocoferil acetato | Sigma | T1157 | Integratori di Medium completo |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Integratori di terreno completo |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Coltura cellulare / tissutale |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Tampone di blocco |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Tensioattivo |
| VECTASHIELD Medium con DAPI | Vector | H-1200 | Terreno di montaggio |
| Vitamina B1 | Sigma | T1270 | Integratori di terreno completo |
| Vitamina B12 | Sigma | V6629 | Integratori di Vitamina C Media Completa |
| Sigma | A4034 | Integratori di Media Completa | |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inibitore |
| Zeiss Imager M2 Microscopio | Zeiss, Oberkochen, Germania | microscopio dritto | |
| LSM 900 Airyscan | microscopio a scansione laser ad alta risoluzione | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen, Germania | fotocamera digitale | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Bulbi oculari di primati da macaco wildtype | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 | |
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche, Germania), |
Riferimenti
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).
- Paquet-Durand, F.,....
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