Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo

Summary

Utilizzando l'elettroporazione in ovo , abbiamo ideato un metodo per trasfettare selettivamente l'orecchio interno uditivo e il nucleo cocleare negli embrioni di pollo per ottenere un knockdown specifico del gruppo cellulare della proteina di ritardo mentale X fragile durante periodi discreti di assemblaggio del circuito.

Abstract

La proteina del ritardo mentale dell'X fragile (FMRP) è una proteina legante l'mRNA che regola la traduzione proteica locale. La perdita o la disfunzione della FMRP porta ad attività neuronali e sinaptiche aberranti nella sindrome dell'X fragile (FXS), che è caratterizzata da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e problemi di comunicazione sociale. Studi sulla funzione FMRP e sulla patogenesi FXS sono stati condotti principalmente con knockout Fmr1 (il gene che codifica per FMRP) in animali transgenici. Qui riportiamo un metodo in vivo per determinare la funzione autonoma cellulare di FMRP durante il periodo di assemblaggio del circuito e formazione sinaptica utilizzando embrioni di pollo. Questo metodo impiega l'elettroporazione specifica per stadio, sito e direzione di un sistema vettoriale inducibile da farmaci contenente Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e un reporter EGFP. Con questo metodo, abbiamo ottenuto il knockdown selettivo FMRP nel ganglio uditivo (AG) e in uno dei suoi bersagli del tronco cerebrale, il nucleo magnocellularis (NM), fornendo così una manipolazione specifica del componente all'interno del circuito AG-NM. Inoltre, il modello a mosaico della trasfezione consente controlli all'interno degli animali e confronti neurone/fibra vicini per una maggiore affidabilità e sensibilità nell'analisi dei dati. Il sistema vettoriale inducibile fornisce il controllo temporale dell'insorgenza dell'editing genico per ridurre al minimo gli effetti accumulati sullo sviluppo. La combinazione di queste strategie fornisce uno strumento innovativo per analizzare la funzione autonoma cellulare di FMRP nello sviluppo sinaptico e circuitale.

Introduction

La sindrome dell'X fragile (FXS) è un disturbo dello sviluppo neurologico caratterizzato da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e comportamenti autistici. Nella maggior parte dei casi, la FXS è causata da una perdita globale della proteina di ritardo mentale dell'X fragile (FMRP; codificata dal gene Fmr1) a partire dalle prime fasi embrionali¹. FMRP è una proteina legante l'RNA che è normalmente espressa nella maggior parte dei neuroni e delle cellule gliali nel cervello, così come negli organi sensoriali ^2,3,4. Nel cervello dei mammi....

Protocol

Le uova e gli embrioni di pollo sono stati trattati con cura e rispetto in conformità con i protocolli animali approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Jinan.

1. Preparazione di uova e plasmidi

1. Preparazione delle uova
   1. Procurarsi uova di gallina fresche fecondate (Gallus gallus) dalla South China Agricultural University e conservare a 16 °C prima dell'incubazione. Per una vitalità ottimale, impostare tutte le uova per l'incubazione entro una settimana dall'arrivo.
   2. Mettere le uova orizzontalmente e incubare a 38 °C per 46-48 ore fino allo stadio 12

Results

Eseguendo l'elettroporazione ovo in diversi siti e in diversi stadi di sviluppo, abbiamo ottenuto il knockdown selettivo FMRP sia nella periferia uditiva che nel tronco cerebrale uditivo.

FMRP knockdown in NM
L'RNA a forcina piccola (shRNA) contro il pollo Fmr1 è stato progettato e clonato nel sistema vettoriale Tet-On come descritto in precedenza²⁰. La configurazione per l'elettroporazione in ovo è mostrata nella

Discussion

Per determinare la funzione autonoma della cellula di FMRP, è necessario manipolare la sua espressione in singoli gruppi cellulari o tipi di cellule. Poiché una delle principali funzioni di FMRP è quella di regolare la formazione sinaptica e la plasticità, manipolare selettivamente ogni componente sinaptica di un determinato circuito è un prerequisito per una piena comprensione del meccanismo FMRP nella comunicazione sinaptica. Utilizzando l'elettroporazione in ovo di embrioni di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubazione delle uova
16 ° C frigorifero	MAGAT		Utilizzato per la conservazione delle uova fecondate.
Incubatrice per uova	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Uova fecondate	Farm of South China Agricultural University		Le uova devono essere utilizzate in una settimana per una vitalità ottimale.
Preparazione del plasmide
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Produce una soluzione di lavoro allo 0,1% in acqua distillata e autoclave.
Kit di preparazione Maxi-Plasmid	QIAGEN	12162	Dissolvere il DNA plasmidico in tampone Tris-EDTA (TE); kit di preparazione privo di endotossine
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S2889	Realizzare una soluzione di lavoro 7,5M in acqua priva di nuclasi.
Elettroporazione e somministrazione di doxiciclina
Elettroporatore	BTX	ECM399
Siringa da 1 mL / 5 mL	GUANGZHOU KANGFULAI
Microscopio da dissezione	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Utilizzare aliquote fresche per ogni dose e conservare a -20 & gradi; C.
Capillare in vetro	BEIBOBOMEI	RD0910	0,9-1,1 mm * 100 mm
Parafilm da laboratorio	PARAFILM	PM996	film trasparente
Estrattore per pipette	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Stato di trazione: 500 ... C per 15 s
Elettrodi in platino	Fatto		0,5 mm di diametro, intervallo 1,5 mm.
Tubo di gomma	Sigma-Aldrich	A5177
Dissezione e fissazione dei tessuti
Pinze	RWD	F11020-11	Dimensione della punta: 0,05*0,01 mm
Altri strumenti chirurgici	RWD
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127	La soluzione di PFA al 4% appena preparata in soluzione salina tamponata con fosfato può essere conservata in 4 gradi; C per un massimo di 1 settimana.
SYLGARD 184 Kit elastomero siliconico	DOW	01673921	Per piastre di sfondo nere, viene applicata polvere di carbonio alimentare.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	Da pelle bovina.
Microtomo scorrevole	LEICA	SM2010
Immunocoloring
Alexa Fluor 488 capra anti-topo	Abcam	ab150113	diluizione 1:500, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 capra anti-coniglio	Abcam	ab150078	diluizione 1:500, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 diluizione
Fluoromount-G mezzo di montaggio	Meridionale  Biotech	Sb-0100-01
Anticorpo FMRP	Y. Wang, Florida State University	#8263	Diluizione 1:1000, RRID: AB_2861242
Anticorpo Islet-1	DSHB	39.3F7	Diluizione 1:100, RRID: Piastra Netwell AB_1157901
	Corning	3478
Anticorpo del neurofilamento	Sigma-Aldrich	N4142	Diluizione 1:1000, RRID: AB_477272
Anticorpo parvalbumina	Sigma-Aldrich	P3088	diluizione 1:10000, RRID: AB_477329
anticorpo SNAP25	Abcam	ab66066	diluizione 1:1000, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	Software di	elaborazione immagini
Microscopio confocale	LEICA	SP8
Stereomicroscopio fluorescente	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	Pacchetto software commerciale per l'elaborazione delle immagini	OlYMPUS