L'infezione da virus dell'influenza A (IAV) attiva le caspasi che scindono le proteine dell'ospite e virali, che, a loro volta, hanno funzioni pro e antivirali. Utilizzando inibitori, interferenza dell'RNA, mutagenesi sito-diretta e tecniche di western blotting e RT-qPCR, sono state identificate caspasi in cellule di mammifero infette che scindono la cortactina ospite e le deacetilasi istoniche.
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Articolo metodologico
Identificare le caspasi e i loro motivi che scindono le proteine durante l'infezione da virus dell'influenza A
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le caspasi, una famiglia di proteasi della cisteina, orchestrano la morte cellulare programmata in risposta a vari stimoli, comprese le infezioni microbiche. Inizialmente descritta per verificarsi per apoptosi, la morte cellulare programmata è ora nota per comprendere tre percorsi interconnessi: piroptosi, apoptosi e necroptosi, insieme coniati come un unico processo, PANoptosis. L'infezione da virus Influenza A (IAV) induce la PANoptosi nelle cellule di mammifero inducendo l'attivazione di diverse caspasi, che, a loro volta, scindono varie proteine dell'ospite e virali, portando a processi come l'attivazione della risposta antivirale innata dell'ospite o la degradazione delle proteine antagoniste dell'ospite. A questo proposito, la scissione mediata dalla caspasi 3 della cortactina ospite, dell'istone deacetilasi 4 (HDAC4) e dell'istone deacetilasi 6 (HDAC6) è stata scoperta in cellule epiteliali sia animali che umane in risposta all'infezione da IAV. Per dimostrare ciò, sono stati impiegati inibitori, interferenze dell'RNA e mutagenesi diretta al sito e, successivamente, la scissione o resistenza alla scissione e il recupero dei polipeptidi cortactina, HDAC4 e HDAC6 sono stati misurati mediante western blotting. Questi metodi, in combinazione con RT-qPCR, formano una strategia semplice ma efficace per identificare l'ospite e le proteine virali che subiscono la scissione mediata dalla caspasi durante un'infezione di IAV o altri virus umani e animali. Il presente protocollo elabora i risultati rappresentativi di questa strategia e vengono anche discussi i modi per renderla più efficace.
Introduzione
Il virus dell'influenza A (IAV) è il membro prototipo della famiglia Orthomyxoviridae ed è noto per causare epidemie globali e pandemie imprevedibili. IAV causa malattie respiratorie umane, influenza, comunemente noto come "influenza". L'influenza è una malattia acuta che provoca l'induzione di risposte immunitarie innate pro- e anti-infiammatorie dell'ospite e la morte delle cellule epiteliali nel tratto respiratorio umano. Entrambi i processi sono governati da un fenomeno chiamato morte cellulare programmata1. La segnalazione per la morte cellulare programmata viene indotta non appena vari recettori di riconoscimento dei patogeni ril....
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Protocollo
Le approvazioni normative sono state ottenute dal Comitato istituzionale per la sicurezza biologica dell'Università di Otago per lavorare con IAV e cellule di mammifero. Per il presente studio sono state utilizzate cellule A549 del rene canino Madin-Darby (MDCK) o epitelio alveolare polmonare umano e sottotipi IAV H1N1. IAV è stato coltivato in uova di gallina, come descritto altrove17. Le condizioni sterili e asettiche sono state utilizzate per lavorare con cellule di mammifero e sono state utilizzate una struttura di biosicurezza di livello 2 (o contenimento fisico 2) e un armadio di biosicurezza di classe II per lavorare con i sottotipi IAV.....
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Risultati
Trattamento con inibitore della caspasi 3
È stato scoperto che i polipeptidi di cortactina ospite, HDAC4 e HDAC6 subiscono degradazione in risposta all'infezione da IAV sia nelle cellule canine (MDCK) che umane (A549, NHBE) 7,8,9. Utilizzando gli approcci di cui sopra, è stato scoperto che le caspasi ospiti indotte da IAV, in particolare la caspasi 3, causano la loro degradazione
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Discussione
È stabilito che i virus adattano i fattori e i percorsi dell'ospite a loro vantaggio. A loro volta, le cellule ospiti resistono a ciò impiegando varie strategie. Una di queste strategie è la PANoptosis, che le cellule ospiti usano come strategia antivirale contro le infezioni virali. Tuttavia, virus come IAV hanno evoluto le proprie strategie per contrastare la PANoptosi e sfruttarla a loro vantaggio 1,3,6. Questa interazione co.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
L'autore riconosce Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nuova Zelanda), H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), Dipartimento di Microbiologia e Immunologia e Scuola di Scienze Biomediche (Università di Otago).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| A549 cellule | ATCC | CRM-CCL-185 | Umano, epiteliale, polmonare |
| Cloruro di ammonio | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Inibitore della caspasi 3 | Sigma-Aldrich | 264156-M | Conosciuto anche come 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'cOmplete |
| , Mini Inibitore della proteasi Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Capra anti-NP anticorpi | Dono di Richard Webby (St Jude Children' s Research Hospital, Memphis, USA) a MH | ||
| Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamina RNAiMAX Reagente di trasfezione | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| cellule MDCK | ATCC | CCL-34 | Cane, epiteliale, rene |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimo essenziale Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Aggiungere L-glutammina, antibiotici o altri integratori secondo necessità |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager con software Image Studio Lite 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc è stato sostituito con Odyssey XF e il software Image Studio Lite è stato sostituito con il software Empiria Studio. | |
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Fusione plasmide che esprime cortactina-GFP umana | Addgene | 50728 | Dono di Kenneth Yamada a Addgene |
| Piccolo RNA interferente (siRNA) pre-progettato per caspasi 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Piccolo RNA interferente pre-progettato per caspasi 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Piccolo RNA interferente pre-progettato per caspasi 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | ID siRNA: SASI_Hs01_00128361 |
| Coppie di primer SYBR Green RT-qPCR pre-progettate | di primer Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | : H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium membrana nitrocellulosica | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Anticorpo anti-actina di coniglio | Abcam | ab8227 | |
| Anticorpo anti-cortactina di coniglio | Cell Signaling | 3502 | |
| Anticorpo anti-GFP di coniglio | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Proteina pre-colorata Standard | ThermoFisher Terreno | LC5625 | |
| , Opti-MEM | ThermoFisher Scientific 11668019 | ||
| Tris-HCl, NaCl, SDS, desossicolato di sodio, Triton X-100 | Merck | ||
| Tripsina, | Sigma-Aldrich | 4370285 |
Riferimenti
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in....
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Ristampe e permessi
