Questo articolo descrive un protocollo per il monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni intatti di zebrafish.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti
In questo articolo
Sommario
Abstract
La metilazione della citosina è altamente conservata tra le specie di vertebrati e, come fattore chiave della programmazione epigenetica e dello stato della cromatina, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale precoce. Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina. La riprogrammazione epigenetica è un periodo critico durante lo sviluppo in utero e l'esposizione materna a sostanze chimiche ha il potenziale per riprogrammare l'epigenoma all'interno della prole. Ciò può potenzialmente causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari. Sebbene il sequenziamento basato sulla bisolfito consenta ai ricercatori di interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, come tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere utilizzati come modello fisiologicamente intatto per scoprire percorsi xenobiotici mediati che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi specifici per 5 mC disponibili in commercio, descriviamo una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero, l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica. Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a rilevare e quantificare con successo i livelli di 5-mC in situ all'interno degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo iniziale. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.
Introduzione
Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina 1,2. Il tris(1,3-dicloro-2-propil) fosfato (TDCIPP) è un ritardante di fiamma ampiamente utilizzato negli Stati Uniti che ha precedentemente dimostrato di alterare la traiettoria della metilazione della citosina dopo l'esposizione embrionale precoce da 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) fino alla gastrulazione precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 <....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Gli allevatori adulti sono stati gestiti e trattati in conformità con un protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (# 20180063) presso l'Università della California, Riverside.
1. Raccolta di embrioni di zebrafish ed esposizione chimica
- Aggiungi trappole da riproduzione in vasca alle vasche contenenti pesci zebra maschi e femmine adulti sessualmente maturi e riproduttivamente vitali. Aggiungere almeno tre trappole per serbatoio da 6 litri almeno 12 ore prima della raccolta a ~ 9:00 AM, che è il tempo approssimativo di fecondazione e deposizione delle uo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Lo scopo generale di questo protocollo è determinare se un trattamento influisce sull'abbondanza relativa di 5-mC valutando l'area totale e l'intensità relativa della fluorescenza all'interno di embrioni di zebrafish fissi ed etichettati. Dopo aver completato il protocollo, è possibile utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per determinare innanzitutto se l'IHC a montaggio completo ha avuto successo. Quando gli embrioni marcati sono osservati sotto un filtro FITC o GFP, un risultato positivo è indicato da un seg.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Durante questo protocollo, ci sono alcuni passaggi che sono critici. In primo luogo, quando si dechorionano gli embrioni, è importante puntare l'ago lontano dal tessuto dell'embrione / sacco vitellino / massa cellulare, poiché queste porzioni dell'embrione in via di sviluppo sono molto fragili e facili da perforare. In secondo luogo, quando si trasferiscono embrioni marcati a singoli pozzetti, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni in quanto aderiranno a una pipetta di plastica. In terzo luogo, quand.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.
Ringraziamenti
Il supporto alla ricerca è stato fornito da una UCR Graduate Division Fellowship a SAB, una NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) a SAB e una sovvenzione del National Institutes of Health (R01ES027576) e USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) a DCV.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µ Pipetta microcapillare in vetro L | Fisher Scientific | 211762B | |
| Piastra di Petri in plastica da 100 mm | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x soluzione salina tamponata con fosfato | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Pipetta da 1 ml | Fisher Scientific | 13690032 | |
| Pallone di Erlenmeyer da 250 ml | Fisher Scientific FB501250 | ||
| Pipetta da 5 ml | Fisher Scientific | 13690033 | |
| piastre di Petri in vetro da 60 mm con coperchi | Fisher Scientific | 08747A | |
| Piastra a 96 pozzetti | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488 IgG di capra coniugata anticorpo | Fisher Scientific | A21121 | |
| Albumina sierica bovina | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Piastra riscaldante | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| Trappole per riproduzione in vasca | Habitat acquatici | N/A | Questo prodotto non è più disponibile a seguito dell'acquisizione di Aquatic Habitats da parte di Pentair. Gli investigatori possono utilizzare vasche di riproduzione standard fuori sistema disponibili da più fornitori. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A Sarà | adatto qualsiasi sistema di screening ad alto contenuto dotato di luce trasmessa e filtro FITC. |
| Cestello per immunochimica (IHC) | N/A | N/A | Prodotto internamente utilizzando provette per microcentrifuga con parte conica rimossa e fondo dotato di rete, dimensionato per piastre da 24 o 48 pozzetti. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Dispositivi molecolari | N/A | Sarà adatto qualsiasi software in grado di quantificare l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza. |
| Microspatola | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Anticorpo monoclonale di topo anti-5-mC | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Agitatore orbitale | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldeide | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Pipetta per trasferimento in plastica | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio è un software open source e può essere scaricato all'indirizzo https://www.rstudio.com. |
| Siero di pecora | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscopio | Leica | 10450103 | |
| Incubatrice a temperatura controllata | Fisher Scientific PR505755L | ||
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
Riferimenti
- Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
