È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

1.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/64190

⸱

18 agosto 2022

 , 
1Department of Environmental Sciences, University of California, Riverside

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo per il monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni intatti di zebrafish.

Abstract

La metilazione della citosina è altamente conservata tra le specie di vertebrati e, come fattore chiave della programmazione epigenetica e dello stato della cromatina, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale precoce. Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina. La riprogrammazione epigenetica è un periodo critico durante lo sviluppo in utero e l'esposizione materna a sostanze chimiche ha il potenziale per riprogrammare l'epigenoma all'interno della prole. Ciò può potenzialmente causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari. Sebbene il sequenziamento basato sulla bisolfito consenta ai ricercatori di interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, come tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere utilizzati come modello fisiologicamente intatto per scoprire percorsi xenobiotici mediati che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi specifici per 5 mC disponibili in commercio, descriviamo una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero, l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica. Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a rilevare e quantificare con successo i livelli di 5-mC in situ all'interno degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo iniziale. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.

Introduzione

Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina 1,2. Il tris(1,3-dicloro-2-propil) fosfato (TDCIPP) è un ritardante di fiamma ampiamente utilizzato negli Stati Uniti che ha precedentemente dimostrato di alterare la traiettoria della metilazione della citosina dopo l'esposizione embrionale precoce da 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) fino alla gastrulazione precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . All'interno dei vertebrati, il 5-mC e i suoi derivati modificati sono fondamentali per regolare lo sviluppo embrionale precoce9. La fecondazione di un embrione innesca la demetilazione del DNA parentale, seguita dalla degradazione dell'mRNA materno, dall'attivazione del genoma zigotico e dalla rimetilazione del genoma zigotico9. I processi biologicamente rilevanti che utilizzano la metilazione della citosina includono la modificazione degli istoni, il reclutamento del macchinario trascrizionale, la metilazione dell'RNA, la riprogrammazione epigenetica e la determinazione della struttura della cromatina10,11. La metilazione della citosina è conservata anche tra le specie di vertebrati, sottolineando l'importanza di comprendere e studiare come la metilazione aberrante della citosina possa influenzare la traiettoria di sviluppo di un organismo11. Inoltre, lo sviluppo in utero è sensibile all'esposizione materna e ha il potenziale di causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari12,13,14.

Lunghi tratti di coppie citosina-guanina, o isole CpG, sono stati i principali focolai dei ricercatori che mirano a caratterizzare la dinamica della metilazione della citosina attraverso il genoma15,16,17. Le strategie basate sul bisolfito come il sequenziamento del bisolfito dell'intero genoma, il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta e il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito rappresentano il gold standard per interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi. Tuttavia, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, in quanto tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. Inoltre, gli approcci basati sul sequenziamento non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale, che è fondamentale per comprendere i tipi di cellule potenzialmente interessate e le aree all'interno di un embrione in via di sviluppo. Allo stesso modo, i saggi globali di metilazione del DNA come l'analisi di restrizione dipendente dalla metilazione, i saggi immunologici legati all'enzima 5-mC (ELISA) e la cromatografia-spettrometria di massa liquida (LC-MS) 5-metil-2'-deossicitidina (5-mC) si basano su omogenati cellulari o tissutali e, come tali, precludono la capacità di monitorare la localizzazione e l'entità della metilazione della citosina nello spazio e nel tempo all'interno di campioni intatti12,18.

A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere ampiamente utilizzati come modelli fisiologicamente intatti per scoprire percorsi mediati da xenobiotici che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi disponibili in commercio specifici per 5-mC, il protocollo seguente descrive una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero (IHC), l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica.

Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a monitorare 5-mC all'interno di embrioni di zebrafish intatti. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Gli allevatori adulti sono stati gestiti e trattati in conformità con un protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (# 20180063) presso l'Università della California, Riverside.

1. Raccolta di embrioni di zebrafish ed esposizione chimica

  1. Aggiungi trappole da riproduzione in vasca alle vasche contenenti pesci zebra maschi e femmine adulti sessualmente maturi e riproduttivamente vitali. Aggiungere almeno tre trappole per serbatoio da 6 litri almeno 12 ore prima della raccolta a ~ 9:00 AM, che è il tempo approssimativo di fecondazione e deposizione delle uova all'interno dei serbatoi.
  2. Preparare una nuova soluzione di esposizione la mattina della raccolta. La soluzione di esposizione viene preparata utilizzando una pipetta da 5 ml e aggiungendo 5,0 ml di acqua di sistema priva di particelle a una capsula di Petri di vetro da 60 mm.
  3. Quindi, utilizzare una pipetta microcapillare di vetro da 10 μL per trasferire 10 μL di veicolo (dimetilsolfossido, o DMSO) o soluzione madre chimica all'acqua di sistema nel piatto di vetro.
  4. Ruotare la capsula di Petri di vetro per assicurarsi che la soluzione madre si dissolva. Aggiungere altri 5,0 ml di acqua di sistema alla capsula di Petri di vetro. Ruotare la capsula di Petri di vetro per omogeneizzare la soluzione di esposizione.
  5. Ripetere l'operazione per ciascun gruppo di trattamento in repliche di quattro per ottenere quattro repliche per trattamento.
  6. Dopo aver preparato le soluzioni di esposizione, tappare le stoviglie di vetro con coperchi di vetro per ridurre al minimo l'evaporazione.
  7. Durante la rimozione delle trappole di allevamento da ciascun serbatoio, lasciare con attenzione che l'acqua all'interno di ciascuna trappola defluisca nel serbatoio prima di rimuoverla dai serbatoi. Assicurati che le trappole rimangano sul lato destro verso l'alto.
  8. Trasferire le trappole di riproduzione nel lavandino del laboratorio e sciacquarle usando una bottiglia di spruzzo riempita con acqua di osmosi inversa (RO) in una rete da pesca precedentemente imbevuta di candeggina al 10% e risciacquata con acqua. Risciacquare gli embrioni fino a quando tutti i detriti sono stati eliminati e rimangono solo embrioni puliti.
  9. Trasferire gli embrioni dalla rete da pesca utilizzando una bottiglia di spruzzo riempita d'acqua RO in una capsula di Petri di plastica da 100 mm. Ordinare in modo casuale 50 embrioni vivi a 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) e rimuovere l'acqua RO in eccesso.
  10. Utilizzando una microspatola, inserire gli embrioni ordinati nella soluzione di trattamento. Tutti gli embrioni devono trovarsi all'interno del veicolo o della soluzione di trattamento non prima delle 9:45. Ruotare i piatti di vetro per assicurarsi che gli embrioni siano uniformemente rivestiti all'interno della soluzione di trattamento.
  11. Dopo aver impostato quattro piatti replicati (N = 50 per replica) per ciascun gruppo di trattamento, posizionare il coperchio di vetro sopra i piatti esposti e trasferire tutti i piatti in un incubatore a temperatura controllata impostato a 28 °C fino a 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf o 10 hpf.
  12. Preparare paraformaldeide fresca al 4% (PFA) almeno 4 ore prima della fine dell'esposizione e conservare a 4 °C.
    1. Accendere la piastra riscaldante a 115 °C, produrre 20 ml di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (2 ml di 10x PBS + 18 ml di acqua RO) in una provetta da centrifuga da 50 ml e pesare 800 mg di paraformaldeide.
    2. All'interno di una cappa chimica, trasferire 1x soluzione PBS in un matraccio Erlenmeyer da 250 ml, aggiungere 800 mg di paraformaldeide e quindi aggiungere 2 μL di NaOH 10 N. Posizionare un termometro all'interno del pallone, posizionare il pallone sulla piastra riscaldante e osservare la temperatura mentre si mescola.
    3. Quando la temperatura raggiunge 62-65 °Crimuovere il 4% di PFA dalla piastra riscaldante e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente (RT). Conservare il PFA al 4% a 4 °C.
  13. Una volta terminata la durata dell'esposizione, rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e trasferire tutti gli embrioni viventi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Aspirare la soluzione di esposizione residua utilizzando una pipetta da 1 ml. Non aspirare embrioni.
  14. Aggiungere 500 μL di PFA refrigerato al 4% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e mescolare gli embrioni in PFA al 4% capovolgendo più volte. Lasciare che gli embrioni si fissino in PFA al 4% durante la notte.
    NOTA: Non è consigliabile consentire agli embrioni di rimanere in PFA per più di 12 ore.

2. Dechorionazione degli embrioni

  1. Il giorno seguente, aspirare il PFA al 4%, risospendere gli embrioni in 1x PBS e pipettare delicatamente su e giù per 30 s. Se necessario, interrompere il protocollo in questa fase e conservare gli embrioni in 1x PBS a 4 °C per un massimo di 48 ore.
  2. Utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, trasferire con cura gli embrioni fissi in una piastra di vetro riempita d'acqua RO e ruotare delicatamente per 30 s. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
  3. Utilizzare aghi per siringhe con ingrandimento 5,0x utilizzando uno stereomicroscopio standard per dechorionare manualmente tutti gli embrioni. Fallo usando la punta dell'ago per perforare il corion e staccarlo delicatamente dal tuorlo e dalla massa cellulare4.
  4. Una volta che gli embrioni sono stati dechorionati, utilizzare una pipetta microcapillare di vetro per trasferire fino a 25 embrioni intatti in un cesto di immunochimica (IHC) e posizionare il cestello IHC in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare l'acqua RO da ciascun pozzetto.

3. Immunoistochimica con anticorpi specifici per 5-mC

  1. Risospendere gli embrioni in 500 μL di tampone bloccante (1x PBST + 2% siero di pecora + 2 mg/ml di albumina sierica bovina) per pozzetto e avvolgere la piastra con parafilm e foglio di alluminio per proteggerli dalla luce. Incubare a 4 °C per 4 ore su uno shaker orbitale (100 rpm).
  2. Rimuovere l'involucro del parafilm e l'alluminio e utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare il tampone di blocco da ciascun pozzetto. Sostituirlo con 500 μL di una diluizione 1:100 di anticorpo monoclonale di topo anti-5-mC nel tampone di blocco. Incubare tutti gli embrioni con anticorpi primari ad eccezione di un sottogruppo di embrioni di controllo del veicolo che saranno incubati con il tampone di blocco per tenere conto del rumore di fondo. Fare attenzione a non interrompere l'integrità degli embrioni, né ad aspirare gli embrioni durante questa fase.
  3. Riavvolgere la piastra in parafilm e foglio di alluminio e lasciare che la piastra incubi a 4 °C durante la notte su uno shaker orbitale (100 rpm).
  4. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione anticorpale primaria da ciascun pozzetto e sostituirla con 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Lavare ogni pozzetto tre volte con 1x PBST per 15 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale (100 rpm).
  5. Sostituire 1x PBST con una diluizione 1:500 di anticorpo IgG anti-topo di capra nel tampone bloccante e incubare tutti gli embrioni con l'anticorpo secondario. Lasciare incubare la piastra a 4 °C durante la notte su uno shaker orbitale (100 rpm).
  6. Il giorno seguente, rimuovere l'anticorpo secondario e lavare la soluzione residua tre volte con 1x PBST per 15 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale (100 rpm).
    NOTA: Il protocollo può essere interrotto qui per un massimo di 48 ore se i cestelli IHC sono conservati in pozzi puliti riempiti con 1x PBS.
  7. Utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare 1x PBST da ciascun pozzetto e posizionare il cestello IHC in una capsula di Petri di vetro riempita con acqua RO. Sotto uno stereomicroscopio standard, ordinare casualmente embrioni intatti in una piastra da 96 pozzetti, ottenendo un embrione per pozzetto.
  8. Utilizzando una pipetta da 1 ml, rimuovere tutta l'acqua RO dai singoli pozzetti e sostituirla con 200 μL di 1x PBS. Centrifugare la piastra per 3 minuti a 1 x g.

4. Imaging automatizzato di embrioni all'interno di piastre a 96 pozzetti

  1. Immagina gli embrioni con un obiettivo 2x sotto luce trasmessa e FITC utilizzando un sistema di screening ad alto contenuto (Table of Materials).
    NOTA: Un'immagine fluorescente di ciascun embrione è stata catturata automaticamente utilizzando l'ingrandimento sopra menzionato e un filtro FITC19.
    1. Selezionare Autofocus per assicurarsi che la messa a fuoco della fotocamera sia sul fondo della piastra e sfalsata dallo spessore inferiore.
    2. Selezionare una lunghezza d'onda FITC con una durata di esposizione di 100 ms e impostare l'autofocus su laser con offset Z. Osservare e confermare la corretta acquisizione dell'immagine in diversi pozzetti prima di iniziare l'acquisizione della piastra.
      NOTA: Lo strumento acquisisce automaticamente le immagini da tutti i pozzetti selezionati contenenti embrioni. Una piastra da 96 pozzetti richiedeva circa 30 minuti per l'acquisizione delle immagini e l'archiviazione dei dati. Per tutta la durata del periodo di acquisizione, la temperatura interna all'interno del sistema di imaging è stata mantenuta a RT.
  2. Dopo l'acquisizione delle immagini, eseguire l'analisi dei dati utilizzando il sistema di screening ad alto contenuto e una procedura di analisi delle immagini automatizzata personalizzata. Selezionare ogni embrione sulla piastra a 96 pozzetti da analizzare per l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza.
    NOTA: l'analisi includeva la fornitura di immagini contenenti sovrapposizioni di punti dati dell'analisi.
  3. Quindi, tabulare i punti dati ed esportarli dal sistema di screening ad alto contenuto andando sotto Misura e selezionando Apri registro dati in un foglio di calcolo. Le parti di acquisizione delle lastre e di analisi dei dati sono illustrate nella Figura 1.

5. Analisi dei dati

  1. Caricare il foglio di calcolo esportato in un programma per computer in cui il pacchetto deployer (dplyr) viene utilizzato per ordinare, sommare i dati per ciascun pozzetto e filtrare in base al numero di pozzo. Il pacchetto writexl viene quindi utilizzato per esportare i dati riepilogati in un foglio di calcolo. Il codice del programma 5mC è mostrato nel file supplementare 1.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Lo scopo generale di questo protocollo è determinare se un trattamento influisce sull'abbondanza relativa di 5-mC valutando l'area totale e l'intensità relativa della fluorescenza all'interno di embrioni di zebrafish fissi ed etichettati. Dopo aver completato il protocollo, è possibile utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per determinare innanzitutto se l'IHC a montaggio completo ha avuto successo. Quando gli embrioni marcati sono osservati sotto un filtro FITC o GFP, un risultato positivo è indicato da un seg...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Durante questo protocollo, ci sono alcuni passaggi che sono critici. In primo luogo, quando si dechorionano gli embrioni, è importante puntare l'ago lontano dal tessuto dell'embrione / sacco vitellino / massa cellulare, poiché queste porzioni dell'embrione in via di sviluppo sono molto fragili e facili da perforare. In secondo luogo, quando si trasferiscono embrioni marcati a singoli pozzetti, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni in quanto aderiranno a una pipetta di plastica. In terzo luogo, quand...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Il supporto alla ricerca è stato fornito da una UCR Graduate Division Fellowship a SAB, una NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) a SAB e una sovvenzione del National Institutes of Health (R01ES027576) e USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) a DCV.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 mLFisher Scientific540225
10-µ Pipetta microcapillare in vetro LFisher Scientific211762B
Piastra di Petri in plastica da 100 mmFisher Scientific08757100D
10x soluzione salina tamponata con fosfato Fisher ScientificBP399500
Pipetta da 1 ml Fisher Scientific13690032
Pallone di Erlenmeyer da 250 mlFisher Scientific FB501250
Pipetta da 5 mlFisher Scientific13690033
piastre di Petri in vetro da 60 mm con coperchiFisher Scientific08747A
Piastra a 96 pozzettiFisher Scientific720089
AlexaFluor 488 IgG di capra coniugata anticorpo Fisher ScientificA21121
Albumina sierica bovinaFisher ScientificBP67110
DMSOFisher ScientificBP2311
Piastra riscaldante Fisher Scientific1110016SH
Trappole per riproduzione in vascaHabitat acquaticiN/AQuesto prodotto non è più disponibile a seguito dell'acquisizione di Aquatic Habitats da parte di Pentair. Gli investigatori possono utilizzare vasche di riproduzione standard fuori sistema disponibili da più fornitori.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening SystemMolecular DevicesN/A Saràadatto qualsiasi sistema di screening ad alto contenuto dotato di luce trasmessa e filtro FITC.
Cestello per immunochimica (IHC)N/AN/AProdotto internamente utilizzando provette per microcentrifuga con parte conica rimossa e fondo dotato di rete, dimensionato per piastre da 24 o 48 pozzetti.
MetaXpress 6.0.3.1658 Dispositivi molecolariN/ASarà adatto qualsiasi software in grado di quantificare l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza.
MicrospatolaFisher Scientific2140115
Anticorpo monoclonale di topo anti-5-mCMillipore SigmaMABE146
NaOHFisher ScientificBP359-500
Agitatore orbitale Fisher Scientific50998290
Parafilm Fisher Scientific1337412
Paraformaldeide Fisher Scientific18612139
Pipetta per trasferimento in plasticaFisher Scientific1368050
RstudioRStudioN/ARStudio è un software open source e può essere scaricato all'indirizzo https://www.rstudio.com.
Siero di pecoraMillipore SigmaS3772-5ML
StereomicroscopioLeica10450103
Incubatrice a temperatura controllata Fisher Scientific PR505755L
Tween-20 Fisher ScientificP7949-500ML

Riferimenti

  1. Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
  2. Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
  3. Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078(2022).
  4. Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179(2021).
  5. Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699(2019).
  6. Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
  7. Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
  8. McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
  9. Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
  10. Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
  11. Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
  13. Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
  14. Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
  15. Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
  16. Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
  17. Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  18. Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
  19. Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Rilevazione della 5-metilcitosinariprogrammazione epigeneticaimmunoistochimica su campioni interiimaging ad alto contenutoeffetti epigenetici materniscreening dell'esposizione chimicaanalisi automatizzata delle immaginiquantificazione della metilazione del DNA
Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.