Questo articolo propone una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottoinsiemi di vescicole extracellulari. Il metodo si basa su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica, accoppiata con spettroscopia Raman, per qualificare bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray.
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Articolo metodologico
Piattaforma analitica multimodale su un chip di imaging a risonanza plasmonica di superficie multiplexed per l'analisi di sottoinsiemi di vescicole extracellulari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole vescicole derivate dalla membrana prodotte da tutte le cellule che vanno da 50 a diverse centinaia di nanometri di diametro e sono utilizzate come mezzo di comunicazione intercellulare. Stanno emergendo come promettenti strumenti diagnostici e terapeutici per una varietà di malattie. Esistono due principali processi di biogenesi utilizzati dalle cellule per produrre EV con differenze di dimensioni, composizione e contenuto. A causa della loro elevata complessità in termini di dimensioni, composizione e origine cellulare, la loro caratterizzazione richiede una combinazione di tecniche analitiche. Questo progetto prevede lo sviluppo di una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottopopolazioni di EV. Per raggiungere questo obiettivo, il lavoro parte dalla piattaforma nanobioanalitica (NBA) stabilita dal gruppo, che consente un'indagine originale delle EV basata su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica (AFM) di bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray. L'obiettivo era quello di completare questa indagine EV con un'analisi fenotipica e molecolare mediante spettroscopia Raman. Questi sviluppi consentono la proposta di una soluzione analitica multimodale e di facile utilizzo per la discriminazione dei sottogruppi di EV nei fluidi biologici con potenziale clinico
Introduzione
Il crescente interesse per la ricerca EV nella diagnosi e nella terapia 1,2,3,4,5, combinato con le sfide che questo campo deve affrontare, ha portato allo sviluppo e all'implementazione di una grande varietà di approcci e tecniche per quantificare o caratterizzare queste vescicole. I metodi più utilizzati per l'identificazione delle EV sono l'immunoblotting e la proteomica specifici per confermare l'origine delle EV, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per confermare la loro struttura e l'anal....
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Protocollo
1. Preparazione del substrato d'oro
NOTA: Tre tipi di superfici sono prodotte su trucioli d'oro: 1) superficie nuda, 2) funzionalizzata chimicamente e 3) biofunzionalizzata (ligandi innestati sullo strato C11C16). Saranno chiamati rispettivamente "nudi", "C11C16" e "ligandi", da questo punto in poi.
- Preparazione del substrato d'oro:
NOTA: Per questo protocollo, i biochip d'oro sono stati fabbricati internamente nella camera bianca. I biochip fatti in casa erano composti da vetrini (SF11) con un rivestimento di cromo (2 nm Cr) e oro (48 nm Au). La lunghezza del ....
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Risultati
Determinazione delle condizioni di pH ottimali per l'innesto di ligando
I diversi ligandi utilizzati per preparare i biochip sono testati in funzione del pH e della loro disponibilità ad interagire con lo strato chimico tiolato (Figura 3). I ligandi vengono diluiti in tampone acetato a diversi valori di pH e iniettati sul biochip chimicamente funzionalizzato con uno strato di C11C16. Le soluzioni vengono iniettate in modo casuale sulla superficie e un detergente (OG a 40 .......
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Discussione
I metodi recenti per l'identificazione delle EV che sono i più utilizzati sono l'immunoblotting protein-specific per confermare l'origine delle EV, TEM per confermare la loro struttura e NTA per quantificare il loro numero e la distribuzione delle dimensioni in un volume campione3. Tuttavia, l'elevato interesse per i veicoli elettrici nella ricerca (bio)medica e i limiti degli strumenti analitici esistenti hanno spinto la comunità scientifica a sviluppare nuovi metodi per la caratterizzazione, la .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Kelly Aubertin e Fabien Picot della struttura centrale IVETh (Parigi) sono riconosciuti per gli esperimenti di imaging Raman. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) e Zuzana Krupova (di Helincourt, Francia) sono riconosciuti per aver fornito i campioni EV derivati rispettivamente da campioni di piastrine nel sangue e latte bovino. Il lavoro è stato sostenuto dalla regione Bourgogne Franche-Comté e dalla scuola di specializzazione EUR EIPHI (progetto NOVICE, 2021-2024). Parte di questo lavoro è stato svolto utilizzando la piattaforma CLIPP e nelle camere bianche RENATECH in FEMTO-ENGINEERING, per le quali ringraziamo Rabah Zeggari.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo CD41a | Diaclone SAS (Francia) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germania | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Etanolammina | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derivato da concentrati piastrinici | Collaborazione : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs da latte bovino | Collaborazione : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - Francia) | 3450 | |
| Glutaraldeide | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| acido mercapto-1-esadecanoico | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanolo | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP quelli | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Ottil glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumina | Sigma | ||
| Tampone fosfato Soluzione salina (PBS) | Siero di | ||
| (RSA) | Tampone acetato di | ||
| Piattaforma tecnologica Sigma | |||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO | I biochip sono stati prodotti internamente nella camera bianca, Besancon | |
| Sulfo-NHS | Sigma |
Riferimenti
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R.
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Ristampe e permessi
