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Research Article
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Questo articolo propone una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottoinsiemi di vescicole extracellulari. Il metodo si basa su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica, accoppiata con spettroscopia Raman, per qualificare bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray.
Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole vescicole derivate dalla membrana prodotte da tutte le cellule che vanno da 50 a diverse centinaia di nanometri di diametro e sono utilizzate come mezzo di comunicazione intercellulare. Stanno emergendo come promettenti strumenti diagnostici e terapeutici per una varietà di malattie. Esistono due principali processi di biogenesi utilizzati dalle cellule per produrre EV con differenze di dimensioni, composizione e contenuto. A causa della loro elevata complessità in termini di dimensioni, composizione e origine cellulare, la loro caratterizzazione richiede una combinazione di tecniche analitiche. Questo progetto prevede lo sviluppo di una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottopopolazioni di EV. Per raggiungere questo obiettivo, il lavoro parte dalla piattaforma nanobioanalitica (NBA) stabilita dal gruppo, che consente un'indagine originale delle EV basata su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica (AFM) di bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray. L'obiettivo era quello di completare questa indagine EV con un'analisi fenotipica e molecolare mediante spettroscopia Raman. Questi sviluppi consentono la proposta di una soluzione analitica multimodale e di facile utilizzo per la discriminazione dei sottogruppi di EV nei fluidi biologici con potenziale clinico
Il crescente interesse per la ricerca EV nella diagnosi e nella terapia 1,2,3,4,5, combinato con le sfide che questo campo deve affrontare, ha portato allo sviluppo e all'implementazione di una grande varietà di approcci e tecniche per quantificare o caratterizzare queste vescicole. I metodi più utilizzati per l'identificazione delle EV sono l'immunoblotting e la proteomica specifici per confermare l'origine delle EV, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per confermare la loro struttura e l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per quantificare il loro numero e la distribuzione delle dimensioni in un volume di campione.
Nessuna di queste tecniche da sola, tuttavia, fornisce tutte le informazioni necessarie per caratterizzare i sottoinsiemi EV. L'eterogeneità intrinseca dei veicoli elettrici dovuta alla diversità delle loro proprietà biochimiche e fisiche impedisce analisi globali affidabili e riproducibili, in particolare per i veicoli elettrici contenuti in una miscela (campione grezzo). I metodi di rilevamento e caratterizzazione sono pertanto necessari per i veicoli elettrici, sia singolarmente che in generale per integrare altri metodi più rapidi ma non selettivi6.
L'imaging ad alta risoluzione mediante TEM (o cryoTEM) o AFM consente la determinazione della morfologia e della metrologia dei veicoli elettrici con una risoluzione nanometrica 7,8,9,10,11,12. Tuttavia, il principale limite dell'uso della microscopia elettronica per oggetti biologici, come i veicoli elettrici, è la necessità di un vuoto per eseguire lo studio che richiede la fissazione e la disidratazione del campione. Tale preparazione rende difficile la traduzione dalle strutture osservate alla morfologia EV in soluzione. Per evitare questa disidratazione del campione, la tecnica del cryoTEM è la più adatta per la caratterizzazione EV13. È ampiamente utilizzato per determinare l'ultrastruttura dei veicoli elettrici. L'immunomarcatura delle vescicole mediante nanoparticelle d'oro biofunzionalizzate consente inoltre di identificare specifiche sottopopolazioni di EV e distinguerle da altre particelle presenti in un campione biologico complesso. Tuttavia, a causa del basso numero di EV analizzate al microscopio elettronico, è spesso difficile eseguire una caratterizzazione rappresentativa di un campione complesso ed eterogeneo.
Per rivelare questa eterogeneità di dimensioni, l'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) suggerisce di analizzare un numero sufficiente di immagini a campo ampio, accompagnate da immagini più piccole, per rivelare singoli EV ad alta risoluzione14. L'AFM è un'alternativa agli approcci ottici e alle tecniche di diffrazione elettronica per lo studio dei veicoli elettrici. Questa tecnica utilizza una punta affilata tenuta da un cantilever flessibile che scansiona il campione depositato su un supporto, linea per linea, e regola la distanza tra la punta e gli elementi presenti attraverso un anello di feedback. Ciò consente di caratterizzare la topografia del campione e raccogliere informazioni morfomeccaniche15,16,17,18. Le EV possono essere scansionate mediante AFM sia dopo essere state depositate su un substrato atomicamente piatto o dopo essere state catturate su un substrato specifico funzionalizzato da anticorpi, peptidi o aptameri per caratterizzare le varie sottopopolazioni18,19. Grazie alla sua capacità di quantificare e sondare simultaneamente la struttura, la biomeccanica e il contenuto biomolecolare membranoso delle EV all'interno di campioni biologici complessi senza la necessità di pretrattamento, etichettatura o disidratazione, l'AFM è ora sempre più utilizzato per caratterizzare le EV in modo fine e multiparametrico in condizioni fisiologiche di temperatura e mezzo.
Questo articolo propone una metodologia che utilizza un biochip d'oro in grado di essere (bio)funzionalizzato chimicamente in un formato multiplexato. Questo substrato è la pietra angolare di una potente piattaforma analitica che combina la biorilevazione di sottoinsiemi di EV mediante risonanza plasmonica di superficie e, una volta che gli EV sono adsorbiti / innestati o immunocatturati sul chip, AFM consente la caratterizzazione metrologica e morfomeccanica degli EV. Accoppiata con la firma Raman dei sottoinsiemi EV catturati sul chip, questa piattaforma analitica consente la qualificazione dei veicoli elettrici presenti nei campioni biologici in modo label-free e senza alcuna necessità di passaggi preanalitici. Questo documento mostra che la combinazione di potenti tecniche, assistite da una metodologia altamente rigorosa nella preparazione del substrato e nell'acquisizione dei dati, rende l'analisi EV profonda, definitiva e robusta.
Il principio dell'approccio proposto è quello di preparare un substrato d'oro, di assorbire/innestare o catturare i sottotipi EV e di scansionarli mediante AFM per stimare le dimensioni e la morfologia di ciascun sottoinsieme EV. Inoltre, questi EV adsorbiti vengono analizzati mediante spettroscopia Raman. Questo substrato può, infatti, presentare tre tipi di interfacce di crescente complessità: nudi, chimicamente funzionalizzati o microarray di ligando. Prima di descrivere le diverse fasi del protocollo, i lettori sono rimandati alla presentazione schematica dell'approccio della piattaforma nanobioanalitica (NBA) nella Figura 1, combinando la risonanza plasmonica di superficie (SPRi), AFM e spettroscopia.
Figura 1: La piattaforma NanoBioAnalitica. L'approccio combina (A) risonanza plasmonica di superficie, (B) microscopia a forza atomica e spettroscopia infrarossa / Raman (nano) spettroscopia, tutti impegnati sullo stesso substrato: un chip d'oro multiplexato. Abbreviazioni: NBA = piattaforma NanoBioAnalitica; SPRi = risonanza plasmonica di superficie; AFM = microscopia a forza atomica; EV = vescicola extracellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Il biochip d'oro costituisce il cuore della piattaforma poiché tutte le tecniche di caratterizzazione label-free sono condotte su questo biochip. In base alle esigenze della caratterizzazione dei veicoli elettrici (EV globali / totali o sottoinsiemi di EV) e ai limiti / richieste dei metodi utilizzati, sono stati sviluppati tre tipi di superfici di biochip d'oro: "nude", chimicamente funzionalizzate "C11 / C16" o biofunzionalizzate con ligando, chiamate superficie d'oro "ligando".
Il biochip nudo, chiamato "naked", consente il semplice adsorbimento di veicoli elettrici sull'oro. E' possibile selezionare il tampone utilizzato e realizzare questo adsorbimento sia in modo passivo (fasi di incubazione e poi risciacquo) sia monitorarlo sotto flusso (in SPRi). Inoltre, questo adsorbimento passivo può essere realizzato sia sull'intero chip (come macroarray) che localizzato in microarray utilizzando un micropipette spotter. La "procedura under flow" consente agli investigatori di seguire la cinetica e il livello di adsorbimento EV. Questo approccio sul substrato d'oro nudo viene adottato quando l'interfaccia dello strato chimico può interferire con il metodo analitico (ad esempio, per la spettroscopia Raman).
Il biochip funzionalizzato chimicamente, chiamato "C11/C16", viene utilizzato per creare un "tappeto" denso e robusto di EV legati covalentemente sulla superficie dell'oro formando legami ammidici primari con i tiolati quando l'obiettivo è quello di avere una visione globale del campione EV. Infatti, in questo caso, l'oro è funzionalizzato da una miscela tiolata di mercapto-1-undecanolo (11-MUOH: "C11") e acido mercapto-1-esadecanoico (16-MHA: "C16"), e una frazione dei tiolati viene attivata chimicamente per stabilire un legame covalente con i bersagli. Ancora una volta, questa strategia può essere realizzata passivamente (fasi di incubazione e poi risciacquo, sia in "macroarray" che in microarray multipli utilizzando uno spotter di micropipette) o sotto portate (in SPRi) per seguire la cinetica e il livello di innesto EV sulla superficie dell'oro.
Il biochip biofunzionalizzato del ligando, chiamato "ligandi", è attivato chimicamente per innestare covalentemente diversi ligandi (ad esempio, anticorpi, recettori) per catturare selettivamente (con affinità) diversi sottoinsiemi di EV che coesistono nel campione biologico.
1. Preparazione del substrato d'oro
NOTA: Tre tipi di superfici sono prodotte su trucioli d'oro: 1) superficie nuda, 2) funzionalizzata chimicamente e 3) biofunzionalizzata (ligandi innestati sullo strato C11C16). Saranno chiamati rispettivamente "nudi", "C11C16" e "ligandi", da questo punto in poi.
Figura 2: Biochip e spotter manuale. Biochip d'oro (a sinistra), spotter di micropipette (al centro) e il biochip dopo l'individuazione con goccioline di ligando di 300 nL ciascuna (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Test di preconcentrazione per determinare il pH ottimale per l'innesto di ligando. Il sensorgramma presenta il livello di interazione in funzione del tempo per un ligando iniettato casualmente (a diversi valori di pH) alla stessa concentrazione su 2 minuti sulla superficie. OG è il detergente, che consente di recuperare la linea di base tra ogni iniezione. Qui, il sensorgramma indica che il pH 6 ha permesso il maggior numero di innesti di ligando, con un segnale SPRi di 1091 RU. Abbreviazioni: OG = octyl glucoside; UR = unità di risposta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Risonanza plasmonica superficiale
Figura 4: Immagine CCD SPRi del biochip. (A,B) Biochip multiplexed dopo passivazione dell'albumina. (A) Un chip senza default; (B) alcuni difetti che sono apparsi sul chip: fusione di macchie (i), innesto debole (ii), o polvere o "contaminanti" (iii). I ROI, a colori nelle macchie (un colore per famiglia di ligando), sono stati scelti per evitare quei "contaminanti". Quando le macchie si sono unite, sono state notate e ignorate o denominate come "miscela di ligandi 1 e 2". (C) Chip d'oro nudo senza microarray per l'esperimento che esamina l'adsorbimento dei veicoli elettrici sull'oro. La freccia blu indica la direzione del flusso. Questo chip non presentava macchie e i ROI sono stati scelti per registrare il segnale di riflettività dalla linea 1 (L1, cerchi rossi) alla linea 4 (L4, cerchi viola) durante l'iniezione del campione. Barra della scala = 1 mm per tutte e tre le immagini. Abbreviazioni: SPRi = surface plasmon resonance imaging; CCD = dispositivo ad accoppiamento di carica; ROI = regioni di interesse; EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esperimenti SPRi di iniezione EV su un biochip. (A) Esperimento di cattura su un biochip multiplex che mostra i segnali di riflettività di diversi ligandi. Qui, il rapporto segnale-rumore per i diversi ligandi era molto buono (e specialmente sui punti antiCD41) poiché la risposta del controllo negativo era trascurabile. (B) Esperimento di adsorbimento di veicoli elettrici su un biochip nudo. Sensorgramma che presenta il condizionamento del chip con due lavaggi di tampone e pulizia OG (1), con l'iniezione del campione EV (2) e il segnale di riflettività dopo l'interazione EV (3). Su questo biochip, non c'era alcun controllo negativo, ma il segnale di riflettività (la sua cinetica, la sua stabilità dopo l'iniezione) era alto, il che significa che quei veicoli elettrici erano in grado di assorbire e rimanere stabili sul chip d'oro. Abbreviazioni: EV = vescicola extracellulare; OG = ottile glucoside. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Microscopia a forza atomica
(1)
(2)
(3)
Figura 6: Caratterizzazione dei biochip mediante AFM. Dopo l'esperimento SPRi, il chip è stato fissato ed essiccato o mantenuto in liquido per la caratterizzazione AFM. (A) Il vetrino lavorato (con due cunei di posizionamento perpendicolari, indicati con una "w" sull'immagine) che presenta una maschera che si adatta alla localizzazione dei 16 microarray di biochip. Grazie all'esposizione alla luce e alla trasparenza, una volta installato per la caratterizzazione AFM, il vetrino consente di posizionare la punta AFM nel punto desiderato per caratterizzarla. (B) Il biochip installato sul vetrino "maschera" e sotto una goccia di tampone per scansionare in condizioni liquide. (C) Immagine SPRi dei 16 microarray. (D) Un microarray ripreso mediante microscopia ottica dopo l'immunocattura di nanoparticelle di calibrazione biofunzionalizzate di 920 nm di diametro. I quadrati bianchi indicano il campionamento delle diverse aree scansionate dall'AFM in ogni punto di interesse per rendere robusta la caratterizzazione dell'AFM. Barre della scala = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; SPRi = risonanza plasmonica di superficie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
4. Spettroscopia Raman
NOTA: Per la spettroscopia Raman, sostituire il vetrino usato come substrato con un vetrino di CaF2, che ha una firma Raman trascurabile.
Determinazione delle condizioni di pH ottimali per l'innesto di ligando
I diversi ligandi utilizzati per preparare i biochip sono testati in funzione del pH e della loro disponibilità ad interagire con lo strato chimico tiolato (Figura 3). I ligandi vengono diluiti in tampone acetato a diversi valori di pH e iniettati sul biochip chimicamente funzionalizzato con uno strato di C11C16. Le soluzioni vengono iniettate in modo casuale sulla superficie e un detergente (OG a 40 mM) viene iniettato dopo ogni iniezione di ligando per recuperare la linea di base. Questo test di preconcentrazione consente di determinare il pH ottimale per ogni innesto di ligando. Nell'esempio presentato in Figura 3, un pH di 6 è stato selezionato come il miglior pH in termini di pendenza e livello di innesto di ligando.
Immagini CCD SPRi
Le immagini CCD SPRi registrate sul biochip (nudo, chimicamente funzionalizzato o presentando microarray) dopo l'inserimento nella macchina SPRi sono presentate in Figura 4. Nel caso del biochip che presenta microarray, l'immagine è stata presa dopo la passivazione dell'albumina della superficie. Duplicati o triplicati di macchie sono stati sistematicamente realizzati sul chip e un controllo negativo è stato automaticamente presente anche sul chip. Il controllo negativo consisteva principalmente in un anticorpo irrilevante. In SPRi, quando il biochip è stato utilizzato senza spotting, per l'adsorbimento su oro nudo o per l'innesto diretto di EV su un biochip chimicamente funzionalizzato, i ROI sono stati scelti arbitrariamente nell'area di rilevamento. Ad esempio, la Figura 4C mostra i ROI scelti su un chip d'oro nudo prima dell'iniezione di EV.
Grazie a questa immagine CCD SPRi, è possibile ignorare alcuni punti se tali problemi compaiono durante l'innesto. L'immagine CCD SPRi consente inoltre di stimare l'omogeneità dell'innesto all'interno dello spot, garantisce la riproducibilità dell'innesto tra diversi punti dello stesso ligando e, infine, assicura che la biorilevazione EV proceda su array equivalenti in termini di densità superficiale.
Risultati SPRi
Quando vengono selezionati i ROI, la linea di base è stabile, il che significa che il campione può essere iniettato. La Figura 5 mostra diversi risultati ottenuti su un biochip multiplexato, rivelando un elevato rapporto segnale-rumore per alcuni immunoarray (il segnale di riflettività è dell'1,4% sull'antiCD41 rispetto alla risposta sul controllo negativo dello 0,02%). La figura 5B presenta i risultati per l'adsorbimento EV ottenuti dopo l'iniezione del campione EV su un chip d'oro nudo. Il campione di N-PEV proveniva da piastrine. La soluzione è stata centrifugata a 3.000 × g per 15 minuti a 22 °C; il surnatante è stato quindi nuovamente centrifugato a 20.000 × g per 15 minuti a 22 °C. Il pellet risultante è stato risospeso nel tampone. I risultati SPRi ottenuti su N-PEV immunocatturati sono stati confrontati con i risultati del western blot (WB). La WB ha rivelato una forte espressione di CD41, CD62P e CD9 in quei campioni, evidenziando una buona correlazione con i risultati SPRi (Figura supplementare S1).
La figura 5B presenta i risultati per l'adsorbimento EV ottenuti dopo l'iniezione del campione EV da cellule epiteliali mammarie primarie umane (HMEC) su un chip d'oro nudo. La coltura cellulare HMEC è stata centrifugata a 3.650 × g per 10 minuti, quindi il surnatante è stato nuovamente centrifugato a 10.000 × g per 30 minuti a 4 °C. Il pellet risultante è stato risospeso in 1x tampone PBS per lavarlo e la centrifugazione è stata eseguita nuovamente a 10.000 × g per 30 minuti a 4 °C. Infine, il pellet è stato sospeso in 1x tampone PBS.
Caratterizzazione AFM
Dopo gli esperimenti SPRi e il caricamento EV sui biochip (tramite adsorbimento, innesto o cattura di affinità), l'AFM è stato eseguito seguendo la metodologia per scansionare scansioni di grandi dimensioni (10 x 10 μm²) e poi (~ 10 almeno) più piccole (pochi μm²). La Figura 7 mostra esempi di immagini AFM su larga e piccola scala di veicoli elettrici su biochip.
Figura 7: Caratterizzazione AFM dei veicoli elettrici su un biochip. Immagini ottenute in modalità di contatto di un campione essiccato. (A) Un esempio di un'ampia area di scansione per fornire una visione rappresentativa del ROI in mm² sul chip. Questo risultato è stato ottenuto dopo l'innesto covalente di EV su una superficie chimicamente modificata. (B) Un altro esempio di un'ampia area di scansione ottenuta dopo la cattura di EV su immunoarray. (C) Una visione più ravvicinata degli oggetti per ottenere un'alta risoluzione e consentire la metrologia (in altezza e diametro) dei veicoli elettrici. (D) Una vista più ravvicinata del biochip nell'immagine in (A) con un'immagine inclinata 3D. (E) Una vista ingrandita di un grande EV adsorbito su un biochip d'oro nudo in un'immagine 3D inclinata. La scala Z è (A, B) 30 nm e (C) 20 nm. Barre di scala = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Abbreviazioni: AFM = Microscopia a forza atomica; EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Analisi di Gwyddion
Il software Gwyddion è stato utilizzato per elaborare i dati per ogni vescicola visualizzata su ogni lotto di immagini AFM. In primo luogo, è stata scansionata un'ampia area (nell'intervallo 10 x 10 μm²) che mostra una vista rappresentativa del ROI in mm² sul chip. L'immagine in Figura 7A mostra che la superficie era densamente coperta di oggetti. In questo caso, gli EV (dal latte bovino) sono stati iniettati a 2,5 × 1010 / ml su un chip tiolo-funzionalizzato attivato. Dopo aver eliminato la caseina dal campione, i surnatanti del siero di latte sono stati concentrati mediante centrifugazione a 4.000 × g e 20 °C utilizzando unità filtranti centrifughe Amicon da 100 kDa e gli EV sono stati isolati utilizzando l'approccio di ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Questo risultato corrisponde a EV innestati covalentemente su una superficie chimicamente modificata. La Figura 7B mostra un altro esempio di un'ampia area di scansione ottenuta dopo la cattura di EV su immunoarray. Anche in questo caso, gli oggetti erano presenti sulla superficie ma mostravano una copertura meno densa rispetto a quando gli EV erano innestati covalentemente sul chip. Una visione più ravvicinata, nella Figura 7C, in diversi punti del ROI consente un'alta risoluzione e la metrologia (in altezza e diametro) dei veicoli elettrici. Un'altra vista più ravvicinata (Figura 7D) del biochip mostrato in Figura 7A, con un'immagine inclinata 3D, rivela oggetti che sono vescicole ma anche filamentosi (in alto a sinistra). Infatti, mentre gli immunochip consentono la cattura selettiva e differenziale di sottoinsiemi EV, l'innesto covalente innesta tutti gli oggetti con gruppi amminici liberi presenti nel campione. Nella Figura 7E, AFM rivela un singolo grande EV della cultura HMEC adsorbito su oro nudo. Pertanto, AFM è in grado di rivelare veicoli elettrici da piccoli a grandi e misurarli e aiuta a contare il numero di oggetti per mm² consentendo la visualizzazione di ciascun EV.
Sono stati determinati l'altezza e il diametro misurati di ciascun EV, da cui è stato ottenuto il diametro effettivo. Le altezze EV coprivano un intervallo da 10 nm a 50 nm, con una media di 15 nm; i diametri EV misurati coprivano un intervallo da 50 nm a 300 nm, con una media di 100 nm. Abbiamo osservato che il diametro effettivo dei veicoli elettrici variava da 30 nm a 300 nm, con una grande maggioranza intorno ai 60 nm (Figura 8A). Tali misurazioni sono state effettuate in liquido o dopo fissazione ed essiccazione. La figura 8B rivela che i risultati ottenuti in queste due condizioni erano comparabili.
Figura 8: Risultati generati dalla caratterizzazione AFM di EV su un biochip. (A) Metrologia delle EV su un punto (immunoarray antiCD41), determinata con una soglia di 8,5 nm e dopo l'iniezione di un campione EV a 2,5 × 1010/ml. Viene presentato il "diametro effettivo calcolato", con ogni punto corrispondente a una particella visualizzata sulle immagini AFM. (B) Istogramma generato dai dati di cui al punto (A), che mostra la distribuzione del diametro effettivo dei veicoli elettrici. Risultati ottenuti in aria (in rosso: campione fissato ed essiccato) e in liquido (in blu: non fissato). Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; EVs = vescicole extracellulari . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'analisi N-PEV di AFM è stata confrontata con i risultati NTA. Questi ultimi risultati "in soluzione", da parte di NTA, hanno mostrato una distribuzione dei diametri EV da 32 nm a 650 nm, con una grande maggioranza tra 90 nm e 250 nm di diametro. Pertanto, tenendo conto del fatto che NTA non è sensibile per piccole dimensioni (vicino a 50 nm), queste misurazioni AFM mostrano una buona correlazione con tali risultati (Figura supplementare S2).
Gli esperimenti Raman, che sono stati realizzati su EV adsorbiti su un chip nudo, hanno rivelato risultati incoraggianti; in particolare, è stato ottenuto uno spettro chiaro dei veicoli elettrici (Figura 9). Gli spettri Raman possono essere separati in tre diversi intervalli: la regione "impronta digitale" (inferiore a 1.800 cm-1), che contiene picchi che formano modelli molecolari specifici ed è, quindi, la parte più importante ai fini dell'identificazione; la regione "bio-silente" (1.800-2.800 cm−1), che di solito viene scartata quando si studiano campioni biologici in quanto non contiene picchi; e la regione "alte frequenze", che contiene principalmente informazioni sui lipidi ed è spesso la parte più intensa dello spettro ma è meno specifica. Lo spettro mostra picchi corrispondenti principalmente alle vibrazioni CH 2 (2.853 cm-1, 1.444 cm-1 e 130 cm-1), che sono associate ai lipidi della membrana dell'EV e un picco corrispondente all'amminoacido fenilalanina21. Una tabella di assegnazione del picco Raman delle molecole comuni presenti nelle EV può essere trovata nell'articolo di Penders et al.22.
Figura 9: Caratterizzazione spettroscopica Raman di EV su un biochip. Qui, il campione EV è stato derivato da una coltura HMEC e recuperato mediante centrifugazione a 20.000 × g. (A) Esempio di un'immagine Raman di EV adsorbiti su un biochip nudo (intensità media), sovrapposta a un'immagine in campo chiaro. (B) Esempio di spettri Raman misurati di veicoli elettrici. Le linee tratteggiate corrispondono alle vibrazioni identificate. α, forbice; τ, torsione; υ, allungamento (s, simmetrico; as, asimmetrico). Barra della scala = (A) 50 μm. Abbreviazioni: EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Misurazioni dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) degli N-PAV. I veicoli elettrici sono stati diluiti in PBS; gli esperimenti sono stati fatti in triplice copia utilizzando uno strumento MALVERN NS300. Diametro medio = 137,5 nm ± 1,3 nm; Diametro modale = 104,9 nm ± 13,3 nm. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Saggi Western blot di N-PAV. Gli N-PEV (1) e (2) corrispondono a due lotti di N-PEV preparati da due tasche di concentrato piastrinico. Clicca qui per scaricare questo file.
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Questo articolo propone una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottoinsiemi di vescicole extracellulari. Il metodo si basa su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica, accoppiata con spettroscopia Raman, per qualificare bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray.
Kelly Aubertin e Fabien Picot della struttura centrale IVETh (Parigi) sono riconosciuti per gli esperimenti di imaging Raman. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) e Zuzana Krupova (di Helincourt, Francia) sono riconosciuti per aver fornito i campioni EV derivati rispettivamente da campioni di piastrine nel sangue e latte bovino. Il lavoro è stato sostenuto dalla regione Bourgogne Franche-Comté e dalla scuola di specializzazione EUR EIPHI (progetto NOVICE, 2021-2024). Parte di questo lavoro è stato svolto utilizzando la piattaforma CLIPP e nelle camere bianche RENATECH in FEMTO-ENGINEERING, per le quali ringraziamo Rabah Zeggari.
| Anticorpo CD41a | Diaclone SAS (Francia) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germania | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Etanolammina | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derivato da concentrati piastrinici | Collaborazione : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs da latte bovino | Collaborazione : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - Francia) | 3450 | |
| Glutaraldeide | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| acido mercapto-1-esadecanoico | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanolo | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP quelli | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Ottil glucoside (OG) | AnticorpoSigma | ||
| Ovalbumina | Sigma | ||
| Tampone fosfato Soluzione salina (PBS) | Siero di | albumina di ratto Sigma||
| (RSA) | Tampone acetato di | sodio Sigma||
| Piattaforma tecnologica Sigma | |||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO | I biochip sono stati prodotti internamente nella camera bianca, Besancon | SPRi Plex II Horiba Scientific.|
| Sulfo-NHS | Sigma |
