Il presente protocollo descrive la bioingegneria delle vescicole della membrana esterna come una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display", compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.
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Articolo metodologico
Una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "plug-and-display" basata su vescicole di membrana esterne che mostrano il dominio di legame del recettore SARS-CoV-2
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le nanoparticelle biomimetiche ottenute da batteri o virus hanno suscitato un notevole interesse nella ricerca e nello sviluppo di vaccini. Le vescicole della membrana esterna (OMV) sono secrete principalmente da batteri gram-negativi durante la crescita media, con un diametro di dimensioni nanometriche e un'attività autoadiuvante, che può essere ideale per la somministrazione del vaccino. Gli OMV hanno funzionato come un sistema di consegna multiforme per proteine, acidi nucleici e piccole molecole. Per sfruttare appieno le caratteristiche biologiche degli OMV, gli OMV bioingegnerizzati derivati da Escherichia coli sono stati utilizzati come carrier e il dominio legante il recettore SARS-CoV-2 (RBD) come antigene per costruire una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display". I domini SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes sono stati applicati per coniugare OMV e RBD. Il gene della citolisina A (ClyA) è stato tradotto con il gene SC come proteina di fusione dopo trasfezione plasmidica, lasciando un sito reattivo sulla superficie delle OMV. Dopo aver miscelato RBD-ST in un sistema tampone convenzionale durante la notte, è stato formato un legame covalente tra OMV e RBD. Pertanto, è stato raggiunto un vaccino OMV polivalente. Sostituendo con antigeni diversi, la piattaforma vaccinale OMV può visualizzare in modo efficiente una varietà di antigeni eterogenei, prevenendo così potenzialmente rapidamente le epidemie di malattie infettive. Questo protocollo descrive un metodo preciso per costruire la piattaforma vaccinale OMV, compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.
Introduzione
Come potenziale piattaforma vaccinale, le vescicole della membrana esterna (OMV) hanno attirato sempre più attenzione negli ultimi anni 1,2. Gli OMV, principalmente secreti naturalmente dai batteri gram-negativi3, sono particelle sferiche su scala nanometrica composte da un doppio strato lipidico, di solito delle dimensioni di 20-300 nm4. Gli OMV contengono vari componenti batterici parentali, compresi gli antigeni batterici e i pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), che fungono da potenziatori immunitari solidi5. Beneficiando de....
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Protocollo
1. Costruzione plasmidica
- Inserire la sequenza di SpyCatcher codificante DNA (file supplementare 1) in un plasmide pThioHisA-ClyA resistente all'ampicillina (vedi Tabella dei materiali) tra i siti BamH I e Sal I per costruire il plasmide pThioHisA ClyA-SC seguendo un rapporto precedentemente pubblicato20.
- Collegare il gene di fusione sintetizzato SpyTag-RBD-Histag (File supplementare 1) in un plasmide pcDNA3.1 (vedere Tabella dei materiali) tra i siti BamH I ed EcoR I per costruire il plasmide pcDNA3.1 RBD-ST a seguito di un rapport....
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Risultati
Il diagramma di flusso per questo protocollo è illustrato nella Figura 1. Questo protocollo potrebbe essere un approccio generale all'utilizzo di OMV come piattaforma vaccinale; Basta scegliere i sistemi di espressione appropriati in base al tipo di antigeni.
La Figura 2 fornisce uno schema di progettazione plasmidica fattibile. Il gene SC è collegato con il gene ClyA tramite un linker flessibile, mentre ST si collega al terminale 5' .......
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Discussione
Per creare una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "Plug-and-Display", ClyA fuso SC è stato espresso in ceppi BL21 (DE3), che è uno dei modelli più utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti a causa dei suoi vantaggi nell'espressione proteica24, in modo che ci sarebbe abbastanza frammento SC visualizzato sulla superficie degli OMV durante il processo di proliferazione batterica. Allo stesso tempo, è stato preparato un antigene bersaglio fuso ST per l'accoppiamento chimico tra gli an.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e il progetto della Chinese National Natural Science Foundation (n. 31670936, 82041045).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ampicillina sodica | Sangon Biotech | A610028 | |
| Contatore cellulare automatizzato | Kit | ||
| cwbio | cw0014s | ||
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Apparecchio per elettroforesi | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| pAb di capra al topo IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| Centrifuga di congelamento ad alta velocità | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Tecnologia di segnalazione cellulare | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | ||
| Isopropyl beta-D-tiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Latte in polvere scremato | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 terreno di coltura cellulare | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST | plasmide Wuhan genecreat techenologia | ||
| Soluzione salina tampone fosfato | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polietilenimmina Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Scala proteica prestained | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmide | Wuhan genecreat techenologia | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | ||
| Sistemi da banco Quixstand (colonna a fibra cava da 100 kD) | Tampone di caricamento GE healthcare | ||
| SDS-PAGE (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Cloruro di sodio | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (soluzione di chemiluminescenza potenziata) | Thermo | 34577 | |
| Strumento di sospensione | Life Technology | Hula Mixer | |
| Trasmissione Microscopio Elettronico | Hitachi | HT7800 | |
| Triptone | Oxoid | ||
| Ultracentrifuga | Coltro Beckman | XPN-100 | |
| Spettrofotometro ultravioletto | Hitachi | U-3900 | |
| Estratto di lievito | Sangon Biotech | A610961 |
Riferimenti
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. ....
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Ristampe e permessi
