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Articolo metodologico

Trasferimento mitocondriale da cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa di topo in ovociti di topo invecchiati

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⸱

DOI:

10.3791/64217

⸱

6 gennaio 2023

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo l'isolamento dei mitocondri da cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa di topo, e quindi trasferiamo i mitocondri in ovociti di topo invecchiati per migliorare la qualità degli ovociti.

Abstract

A causa del calo della quantità e della qualità degli ovociti legati all'età, la fertilità delle donne di età superiore ai 35 anni è diminuita drasticamente. I meccanismi molecolari che mantengono la qualità degli ovociti rimangono poco chiari, quindi è difficile aumentare il tasso di natalità delle donne di età superiore ai 35 anni al momento. Gli ovociti contengono più mitocondri di qualsiasi tipo di cellula del corpo e qualsiasi disfunzione mitocondriale può portare a una riduzione della qualità degli ovociti. Negli anni '90, il trasferimento citoplasmatico degli ovociti ha avuto un grande successo nella riproduzione umana, ma è stato accompagnato da controversie etiche. Si prevede che il trapianto mitocondriale autologo sia una tecnica utile per aumentare la qualità degli ovociti che sono diminuiti a causa dell'età. Nel presente studio, abbiamo utilizzato cellule staminali di derivazione adiposa da topi anziani come donatore di mitocondri per aumentare la qualità degli ovociti di topi anziani. L'ulteriore sviluppo della tecnologia di trasferimento mitocondriale autologo fornirà un nuovo ed efficace trattamento per l'infertilità nelle donne anziane.

Introduzione

Uno dei fattori importanti che influenza la fertilità femminile è l'invecchiamento degli ovociti; Il declino della qualità degli ovociti è la principale causa di infertilità nelle donne anziane. Tuttavia, la causa principale dell'invecchiamento degli ovociti e il meccanismo molecolare che regola la qualità degli ovociti non sono ancora chiari. Studi precedenti hanno indicato che sia il numero che la qualità dei mitocondri sono coinvolti nel controllo della qualità degli ovociti e nello sviluppo embrionale 1,2,3. La diminuzione della quantità e della qualità dei mitocondri è strettamente correlata all'invecchiamento3.

Sono stati fatti molti tentativi per migliorare la funzione dei mitocondri negli ovociti invecchiati, tra cui l'integrazione nutrizionale dei mitocondri e il trasferimento dei mitocondri. Gli integratori alimentari ben noti ed efficaci dei mitocondri includono il coenzima Q10 (CoQ10), l'acido alfa-lipoico (α-LA) e il resveratrolo (RSV)4. Gli studi hanno dimostrato che l'integrazione di CoQ10 può non solo migliorare il declino della quantità e della qualità degli ovociti legato all'età, ma anche promuovere il normale sviluppo e l'ovulazione degli ovociti5. α-LA rallenta il declino della qualità degli ovociti correlato all'invecchiamento e al fenotipo metabolico delle pazienti con sindrome dell'ovaio policistico (PCOS)6,7. Il resveratrolo può ridurre il numero di ovociti con fusi anomali e allineamento cromosomico improprio aumentato nei topi anziani, influenzando lo sviluppo embrionale in modo dose-dipendente8. Tuttavia, poiché l'effetto clinico degli integratori alimentari dei mitocondri non ha raggiunto i livelli previsti, è necessario esplorare altri trattamenti efficaci.

Il primo tentativo di trasferimento dei mitocondri è stato effettuato nel 1997. Il trasferimento del citoplasma di ovociti di una giovane donatrice in ovociti riceventi anziani ha migliorato la qualità degli ovociti delle pazienti anziane, che hanno dato alla luce con successo neonati sani9, che è stato il razionale alla base dell'uso di questa tecnica. Tuttavia, il trasferimento citoplasmatico allogenico di ovociti non può essere applicato alla pratica clinica a causa di due motivi principali: il problema dell'eterogeneità genetica e i problemi regolatori causati dal trapianto di mitocondri da donatore. Uno studio precedente ha dimostrato che il trapianto di cellule mitocondriali autologhe potrebbe migliorare la qualità degli ovociti, lo sviluppo embrionale e la fertilità di topi anziani10, che non avevano problemi etici o problemi di eterogeneità genetica e hanno risolto alcuni problemi causati dal trasferimento del citoplasma degli ovociti donatori negli ovociti riceventi10,11.

Nel frattempo, il trasferimento mitocondriale di cellule autologhe era superiore all'effetto dei precedenti integratori alimentari di mitocondri sul miglioramento della qualità degli ovociti11. Pertanto, il trapianto mitocondriale di cellule autologhe è la scelta appropriata per l'applicazione clinica di questa tecnologia12. Le cellule staminali di derivazione adiposa (ADSC) possono essere ottenute con una tecnologia minimamente invasiva, sono facili da isolare e coltivare e possono essere una cellula "seme" ideale per la medicina rigenerativa. I mitocondri sono ricchi di ADSC e la funzione dei mitocondri non diminuisce con l'età, il che suggerisce che le ADSC sono un'ottima fonte di mitocondri13,14. In questo protocollo, introduciamo un metodo per trasferire i mitocondri di cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa di topo in ovociti di topo invecchiati per migliorare la qualità dell'ovocita. Questo è un modello utile per la tecnologia di trasferimento mitocondriale autologo ADSC umano.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato Etico per la Ricerca Animale del Terzo Ospedale Affiliato dell'Università di Soochow. Tutte le operazioni seguono le linee guida nazionali e di cura degli animali. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli di tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Isolamento e caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa (ADSC) di topo invecchiato

  1. Sacrificare i topi anziani (10 mesi, una media di tre) mediante lussazione cervicale in anestesia con pentobarbital sodico e immergerli in alcol al 75% per 5 minuti prima dell'isolamento del tessuto adiposo.
    NOTA: L'immersione in alcol al 75% per 5 minuti può ridurre efficacemente la contaminazione delle cellule primarie.
  2. Praticare un'incisione di 2 cm nella pelle dell'inguinale bilaterale, esporre il grasso sottocutaneo e utilizzare una pinzetta per isolare il grasso sottocutaneo. Raccogliere il grasso inguinale bilaterale dai topi utilizzando forbici oftalmiche sterilizzate (evitare di tagliare il tessuto sottocutaneo). Posizionare il tessuto adiposo in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL su ghiaccio e trasportarlo immediatamente al laboratorio di coltura cellulare.
  3. Trasferire il tessuto adiposo in una piastra a 6 pozzetti, sciacquarla 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 100 U/mL di penicillina e streptomicina. Rimuovere i vasi sanguigni, la fascia adiposa e il tessuto connettivo sotto il tessuto adiposo e tagliarli in pezzi di ~0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm.
    NOTA: Quando si isolano le cellule staminali adipose, si verifica spesso una contaminazione delle cellule endoteliali vascolari. La rimozione dei vasi sanguigni dal tessuto adiposo può ridurre la contaminazione delle cellule endoteliali vascolari.
  4. Trasferire il tessuto adiposo triturato nello stesso volume di soluzione di collagenasi di tipo I (concentrazione finale di collagenasi di tipo I allo 0,1%) e digerire a 37 °C per 30 min.
  5. Aggiungere un volume uguale di terreno di coltura completo (terreno DMEM F-12 contenente il 10% di siero fetale bovino) per neutralizzare la collagenasi di tipo I, centrifugare a 600 × g per 10 minuti ed eliminare il surnatante e il tessuto adiposo.
  6. Risospendere il pellet cellulare nel terreno di coltura completo. Rimuovere il tessuto non digerito mediante filtrazione attraverso un colino cellulare da 40 μm, quindi centrifugare a 600 × g per 5 minuti.
  7. Risospendere la sospensione cellulare con 5 mL del terreno di coltura completo e utilizzare una pipetta da 1 mL per pipettare delicatamente su e giù per formare una sospensione a cellula singola. Controllare la sospensione cellulare al microscopio posizionando un'aliquota su un emocitometro per confermare che ci sono solo cellule singole, senza aggregati. Aggiungere la sospensione a cellula singola in un pallone di coltura cellulare da 25 cm2 e fermentare in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C.
  8. Cambiare il terreno di coltura 48 ore dopo. Continuare a cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.
  9. Dopo 7-10 giorni, staccare le cellule per il passaggio cellulare quando la loro confluenza raggiunge l'80%-90%. Rimuovere l'intero terreno di coltura e lavare le cellule con 2 mL di PBS. Quindi, aggiungere 2 mL di tripsina/EDTA allo 0,05% per eseguire la dissociazione cellulare15,16.
  10. Aggiungere un terreno di induzione adipogenico per 14 giorni per indurre la differenziazione degli ADSC in adipoti. Aggiungere un terreno di induzione osteogenico per 28 giorni alle ADSC piastrate su piastre a 24 pozzetti rivestite di gelatina al 2% per indurre la loro differenziazione in osteoblasti. Per la differenziazione neurale, coltivare le ADSC con un mezzo di induzione neurale, quindi rilevare l'enolasi neurone-specifica e il polipeptide mediatore dei neurofilamenti utilizzando l'immunofluorescenza15.
    1. Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,5% in PBS per 15 minuti.
    2. Dopo il blocco con BSA al 3% in PBS, incubare le cellule con anticorpi primari (vedere Tabella dei materiali) diluiti in soluzione bloccante a 4 °C per una notte.
    3. Incubare le cellule con anticorpi secondari per 45 minuti e poi colorarle con DAPI per 10 minuti. Quindi, esamina le cellule con un microscopio a fluorescenza.
  11. Raccogliere la sospensione ADSC a cellula singola utilizzando tripsina/EDTA allo 0,05%, centrifugare a 600 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e risospendere in PBS per regolare la densità cellulare a 1 × 106/mL. Aliquotare la sospensione cellulare in provette per microcentrifuga da 1,5 mL (100 μL/provetta) e aggiungere anticorpi monoclonali CD29, CD90, CD34 e HLA-DR di coniglio marcati con FITC, con una concentrazione di anticorpi di 0,5 μg/mL. Trattare il gruppo di controllo con lo stesso volume di IgG FITC di coniglio, incubare con ghiaccio per 30 minuti e risciacquare con PBS per rimuovere l'anticorpo non coniugato. Rilevare i marcatori di superficie ADSC mediante citometria a flusso13.

2. Isolamento dei mitocondri dalle cellule staminali adipose

NOTA: Tutte le operazioni di isolamento dei mitocondri devono essere eseguite su ghiaccio.

  1. Quando le ADSC raggiungono una densità del 90%, digerire le cellule con 2 mL di tripsina/EDTA allo 0,05%, centrifugare a 600 × g per 5 minuti, raccogliere e contare le cellule e prelevare da 1 × 10a 7 cellule per ogni estrazione.
  2. Risospendere le cellule in 2 mL di tampone di estrazione dei mitocondri (per la preparazione del tampone: 10 mL di Tris-MOPS 0,1 M, 1 mL di 0,1 M EGTA/Tris e 20 mL di saccarosio 1 M; portare il volume a 100 mL con acqua distillata e regolare il pH a 7,4) con 1x cocktail di inibitori della proteasi dopo il lavaggio con 2 mL di PBS sterile, e poi incubare su ghiaccio per 5 minuti.
  3. Omogeneizzare le cellule 20x-30x con un omogeneizzatore in vetro (2,0 mL) e controllare il grado di omogeneizzazione mediante colorazione con blu di tripano.
    NOTA: La proporzione delle cellule colorate dovrebbe essere ~80%. Un'eccessiva omogeneizzazione danneggerà la struttura dei mitocondri.
  4. Centrifugare l'omogeneizzato di cellule a 600 × g per 15 minuti, assumere il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml preraffreddata e ripetere l'operazione una volta.
  5. Centrifugare il surnatante a 7.500 × g per 15 minuti ed eliminare il surnatante. Lavare il precipitato mitocondriale e risospenderlo aggiungendo ~100 μL di tampone per iniezione mitocondriale preraffreddato (225 mM di mannitolo, 75 mM di saccarosio, 10 mM di KCl, 10 mM di Tris-HCl e 5 mM di KH2PO4, pH 7,2), a una concentrazione di 1-5 mg/mL (concentrazione proteica totale). Trasportare la sospensione mitocondriale su ghiaccio.
  6. Analizzare la funzione e la purezza dei mitocondri isolati mediante analisi citofluorimetrica JC-1 e Western blot (VDAC1, β-actina e lamina B)13.
    1. Dividere i mitocondri isolati in tre gruppi: dimetilsolfossido (DMSO), JC-1 colorato e JC-1 colorato con 30 minuti di cianuro di carbonile 3-clorofenilidrazone (CCCP).
    2. Dopo la centrifugazione a 7.500 × g, scartare il surnatante e sospendere il tampone.
    3. Cattura l'intensità di fluorescenza dei monomeri JC-1 (canale FITC) e degli aggregati (canale PE) che sono stati catturati mediante citometria a flusso. Valutare i potenziali di membrana mitocondriale isolati misurando i rapporti tra l'intensità media di fluorescenza del canale PE e il canale FITC.
      NOTA: Eseguire i passaggi precedenti al buio.

3. Superstimolazione ovarica

  1. Iniettare topi femmina C57BL/6 di 10 mesi per via intraperitoneale con 10 UI di gonadotropina sierica (PMSG) di cavalla gravida per la superovulazione. Dopo 48 ore, iniettare 10 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) per via intraperitoneale.
  2. A 13 ore dall'iniezione di hCG, strappare le tube di Falloppio gonfie con una pinzetta microscopica. Rilascia i complessi cumuliformi dalle tube di Falloppio gonfie. Sciogliere le cellule del cumulo in terreno M2 con ialuronidasi (0,3 mg/mL) a 37 °C.
    NOTA: Il tempo di dissoluzione è inferiore a 5 minuti. Ridurre al minimo il tempo per il quale il complesso cumulo è esposto alla ialuronidasi, poiché l'esposizione prolungata può compromettere il potenziale di sviluppo degli ovociti.

4. Trasferimento mitocondriale con ICSI

  1. Metti lo spermatozoo senza coda nel liquido mitocondriale. Ottenere spermatozoi senza coda tagliando con gli ultrasuoni17. Metti lo spermatozoo senza coda nel liquido mitocondriale, in modo tale che ci siano 100 spermatozoi in 50 μL di liquido mitocondriale.
    NOTA: Poiché la sospensione mitocondriale è leggermente viscosa e non stabile in vitro, completare l'iniezione entro 30 minuti e sostituire immediatamente l'ago per microiniezione quando si ostruisce. Il diametro interno ottimale dell'ago per microiniezione è di 5 μm.
  2. Iniettare ~2 pL di tampone per la respirazione mitocondriale o di sospensione mitocondriale con spermatozoi negli ovociti utilizzando un microiniettore al microscopio invertito (200x; vedi Tabella dei materiali) entro 30 minuti secondo il protocollo di Hiramoto come descritto da Mehlmann e Kline10,18.
    NOTA: La sospensione mitocondriale iniettata rappresenta l'1%-3% del volume totale degli ovociti. Controllare il volume (1%-3%) della sospensione mitocondriale nel citoplasma per garantire la coerenza dell'iniezione.
  3. Dopo l'iniezione, posizionare gli ovociti fecondati in un terreno M2 per l'equilibrio per 15 minuti e trasferire gli ovuli fecondati sopravvissuti in un terreno di coltura M16.
  4. Esamina le uova fertili sopravvissute osservando la morfologia regolare, la formazione pronucleare e il rilascio del secondo corpo polare19. Osserva, fotografa e conta gli embrioni alle 09:00 e alle 18:00 tutti i giorni per 4 giorni. Infine, raccogliere e congelare le blastocisti e conservarle in frigorifero a -80 °C per la determinazione del numero di copie di ATP e mtDNA per valutare il numero e il miglioramento del trapianto mitocondriale.
    1. Preparare il plasmide standard (plasmide per la quantificazione assoluta, come descritto in precedenza13), per la determinazione del numero di copie mitocondriali in base al numero di copie di 1 × 107, 1 × 106, 1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102 e 1 × 101. Trasferire gli embrioni nella provetta di sterilizzazione e aggiungere 20 μL di tampone lisato per rilasciare il DNA mitocondriale. Quindi, inattivare la proteasi nel lisato a 55 °C per 20 minuti e a 95 °C per 10 minuti.
    2. Determinare il numero di copie del mtDNA mediante PCR quantitativa a fluorescenza utilizzando la seguente configurazione: 5 μL di miscela PCR, 0,5 μL di B6 primer-forward, 0,5 μL di B6 primer-rev, 2 μL di prodotto di pirolisi e 2 μL di ddH2O. Seguire le condizioni della PCR: fase 1, 95 °C per 3 min; stadio 2, 95 °C per 30 s, 58 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; Ripetere il ciclo 40 volte.

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Risultati

In questo protocollo, abbiamo isolato e caratterizzato le ADSC dal grasso di topo (Figura 1). Per ottenere mitocondri isolati, la membrana cellulare deve essere disgregata utilizzando un omogeneizzatore di vetro. (Figura 2A). È importante ottenere una frazione mitocondriale uniforme senza grossi grumi in modo che la provetta per microiniezione non sia ostruita. Per risospendere delicatamente gli omogeneizzati devono essere utilizzati prima 200 μl e poi 10 μl di ...

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Discussione

Gli ovociti contengono più mitocondri di qualsiasi tipo di cellula del corpo, con ~1-5 × 105 numeri di copie del mtDNA. I mitocondri sono essenziali per la maturazione degli ovociti, la fecondazione e lo sviluppo embrionale, quindi qualsiasi disfunzione mitocondriale può portare a una diminuzione della qualità degli ovociti. La diminuzione della quantità e della qualità mitocondriale è strettamente correlata all'invecchiamento fisiologico. In questo protocollo, è stato introdo...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della National Nature Science Foundation of China (da 82001629 a X.Q.S.), del Progetto di ricerca di base dell'Ufficio per la scienza e la tecnologia di Changzhou con il numero di sovvenzione CJ20200110 (a Y.J.Y.), del Programma giovanile della Fondazione per le scienze naturali della provincia di Jiangsu (da BK20200116 a X.Q.S.) e del finanziamento per la ricerca post-dottorato della provincia di Jiangsu (2021K277B a X, Q.S.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% tripsina/EDTAGibco25300054coltura cellulare
  4% paraformaldeidebeyotimeP0099immunofluorescenza
40 μ filtro cellulare mCorning352340Isolamento ADSC
induzione adipogenicaCyagenHUXXC-90031Differenziazione multidirezionale
Soluzione di colorazione rossa di alizarinaSigmaA5533Differenziazione multidirezionale
Anticorpo contro CD29BD Biosciencesflussodi 558741
Anticorpo contro CD34BD BiosciencesAnalisidel flusso
Anticorpo contro CD90BD Biosciences553016analisi del flusso
Anticorpo contro HLA-DRBD Biosciences555560analisi del flusso
β-actinaAbcamab-8226Test di funzionalità mitocondriale
BSASigmaV900933immunofluorescenza
CCCPSolarbioMitocondri C6700JC-1 analisi del flusso
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711qPCR
collagenasi tipo ISigmaSCR103Isolamento ADSC
DAPI InvitrogenD1306immunofluorescenza
DMEM-F12Gibco11320033Colture cellulari
DMSOSigma276855mitocondri JC-1 Analisi del flusso
EGTASigma324626Isolamento dei mitocondri
FBSGibco10100147
Citometria a flussoBD BiosciencesFACSCanto& commercio; IICaratteristiche delle ADSC
microscopio a fluorescenzaleicaDM2500immunofluorescenza
Sigma48722di differenziazione multidirezionale
SangonF519062Isolamento dei mitocondri
hCGAibeiM2520Superstimolazione ovarica
ialuronidasiSigmaH1115000Superstimolazione ovarica
  Microscopio invertitoOlympusIMT-2Microiniezione
Kit di colorazione dei mitocondri isolatiSigmaCS0760Mitocondri JC-1 Analisi del flusso
JC-1SigmaT4069Test di funzionalità mitocondriale
KClSigmaP5405Trasferimento dei mitocondri
KH2PO4SigmaP5655Trasferimento
dei mitocondriLaminBAbcamab-16048Test di funzionalità mitocondriale
M16 MediumSigmaM7292coltura cellulare embrionale
M2 MediumSigmaM7167coltura cellulare embrionale
mannitoloSigmaM9546Trasferimento mitocondriale
MicroiniettoreOlympus+ eppendorfIX73Trasferimento mitocondriale
MitoTracker rossoInvitrogenM22425Colorazione dei mitocondri
MOPSSigmaM1442neurofilamenti di isolamento dei mitocondri
(NFM)Santa Cruz Biotechnologysc-16143Differenziazione multidirezionale
Induzione neurogenaGibcoA1647801Differenziazione multidirezionale
Enolasi neurone-specifica (NSE)Santa Cruz Biotechnologysc-292097Differenziazione multidirezionale
Olio rosso OSangonE607319Differenziazione adipogenica
olio rosso O soluzioneSigma O1516Differenziazione multidirezionale
induzione osteogenicaCyagenHUXXC-90021Differenziazione multidirezionale
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)HycloneSH30256.LSColture cellulari
penicillina e streptomicinaCloneSV30010Colture cellulari
PMSGAibeiM2620di superstimolazione ovarica
SigmaP8340Isolamento dei mitocondri
saccarosioSigmaV900116Isolamento dei mitocondri
TrisSigma648314Isolamento dei mitocondri
Tris-HClSigma108319Trasferimento dei mitocondri
Triton X-100beyotimeP0096immunofluorescenza
VDACAbcamab-14734Test di funzionalità mitocondriale
Analisi del 560942 gelatina di Tubo di omogeneizzazione in vetro Polipeptide mediatore dei Cocktail di inibitori della proteasi

Riferimenti

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Cellule staminali derivate dal tessuto adiposoQualità degli ovocitiDisfunzione mitocondrialeTrapianto mitocondriale autologoTrasferimento citoplasmatico di ovocitiInfertilità femminileInvecchiamento degli ovociti

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