Microscopia intravitale per studiare le interazioni piastrine-leucociti-endoteliali nel fegato di topo

Sommario

La microscopia intravitale è un potente strumento che fornisce informazioni sulle relazioni temporali e spaziali dei processi rapidi e/o sequenziali. In questo articolo, descriviamo un protocollo per valutare sia le interazioni proteina-proteina che le interazioni piastrine-neutrofili-endoteliali nei sinusoidi epatici in un modello murino di sepsi sperimentale (endotossiemia).

Abstract

L'infiammazione e la trombosi sono processi complessi che si verificano principalmente nel microcircolo. Sebbene l'istologia standard possa fornire informazioni sulla via terminale sia per l'infiammazione che per la trombosi, non è in grado di mostrare i cambiamenti temporali che si verificano nel corso del tempo di questi processi. La microscopia intravitale (IVM) è l'uso dell'imaging di animali vivi per ottenere informazioni temporali sui processi fisiologici in vivo. Questo metodo è particolarmente potente quando si valutano le interazioni cellulari e proteiche all'interno della circolazione a causa degli eventi rapidi e sequenziali che sono spesso necessari affinché queste interazioni si verifichino. Sebbene l'IVM sia una metodologia di imaging estremamente potente in grado di visualizzare processi complessi in vivo, ci sono una serie di fattori metodologici che sono importanti da considerare quando si pianifica uno studio IVM. Questo documento delinea il processo di conduzione dell'imaging intravitale del fegato, identificando considerazioni importanti e potenziali insidie che possono sorgere. Pertanto, questo articolo descrive l'uso dell'IVM per studiare le interazioni piastrine-leucociti-endoteliali nei sinusoidi epatici per studiare i contributi relativi di ciascuno in diversi modelli di danno epatico acuto.

Introduzione

L'infiammazione e la trombosi sono processi complessi che si verificano principalmente nel microcircolo. Questo protocollo delinea la preparazione chirurgica che consente l'imaging della microvascolarizzazione epatica in vivo. Sebbene l'istologia standard possa fornire informazioni sulle vie terminali sia per l'infiammazione che per la trombosi, non può mostrare i cambiamenti temporali che si verificano durante il processo. Inoltre, questo metodo è particolarmente potente nella valutazione delle interazioni cellulari e proteiche transitorie che si verificano all'interno della circolazione microvascolare grazie alla sua capacità di catturare, tramite videomicroscopia, le interazioni spesso rapide e sequenziali che si verificano all'interno dei sistemi biologici. Questo articolo descrive l'uso della microscopia intravitale per studiare le interazioni piastrine-leucociti-endoteliali nei sinusoidi epatici per studiare il contributo relativo di ciascuno in diversi modelli di danno epatico acuto.

Mentre questa preparazione chirurgica e la modalità di imaging hanno il potenziale per essere adattate a una serie di modelli infiammatori e patologici, qui vengono delineati due modelli di infiammazione vascolare: un modello di endotossiemia di sepsi murina e danno epatico indotto da paracetamolo (APAP). L'iniezione di endotossina (lipopolisaccaride; LPS) per indurre un modello sperimentale di sepsi murina è iniziato già negli anni '30 con il suo isolamento e la successiva esplorazione come molecola chiave nella progressione della sepsi¹. Sebbene questo modello sia limitato in quanto l'LPS è solo un singolo componente dei batteri Gram-negativi, questo è un metodo ampiamente accettato e utilizzato che è relativamente semplice e veloce da eseguire. Inoltre, replica rapidamente e accuratamente le manifestazioni fisiologiche della sepsi¹. Dato il ruolo che l'assorbimento intestinale delle endotossine svolge nello sviluppo della malattia epatica e dell'infiammazione², questo è un modello eccellente per studiare le interazioni piastrine-leucociti-endoteliali nel fegato del topo.

Oltre a un modello LPS di sepsi, il sovradosaggio di APAP fornisce un modello eccellente per lo studio delle interazioni patologiche cellula-cellula nel fegato. Il sovradosaggio di APAP può portare a insufficienza epatica acuta, caratterizzata da trombocitopenia e accumulo di piastrine nel fegato, bloccando successivamente il recupero epatico mediato dai leucociti³. Mentre la preparazione chirurgica e la metodologia di imaging per questo modello possono essere adattate per una serie di questioni biologiche e per studiare vari processi patologici, sia il modello LPS di sepsi che il danno epatico indotto da APAP sono modelli eccellenti per lo studio delle interazioni piastrine-leucociti-endoteliali in vivo.

L'IVM presenta alcuni vantaggi intrinseci rispetto alle tecniche istologiche standard. Sebbene i metodi istologici standard consentano lo studio di campioni di tessuto interi o sezionati e l'apprezzamento delle proteine e dell'architettura dei tessuti, queste metodologie presentano dei limiti. In base alla progettazione, questi processi richiedono l'elaborazione dei tessuti, che ha il potenziale di distorcere o mascherare ciò che si trova nel sistema vivente. Il tessuto deve essere fissato durante la preparazione istologica, introducendo il potenziale di artefatti di fissazione o di una maggiore autofluorescenza. La fissazione può anche portare a cambiamenti intracellulari nei tessuti e il potenziale di fissazione impropria può portare alla degradazione dei tessuti. Inoltre, i metodi istologici non hanno il potenziale per studiare direttamente gli aspetti temporali delle interazioni proteiche o cellulari e hanno il potenziale di perdere interazioni effimere o poco frequenti.

Al contrario, la microscopia intravitale a fluorescenza consente di evitare molte delle complicanze e delle limitazioni inerenti all'istologia standard. L'IVM evita la fissazione e, quindi, gli artefatti o la degradazione dei tessuti che possono verificarsi durante la preparazione istologica. In base alla progettazione, consente anche l'imaging dei tessuti all'interno del sistema biologico vivente e, in quanto tale, l'isolamento e il sezionamento dei tessuti non sono necessari. Inoltre, consente l'imaging e lo studio di processi transitori o poco frequenti, che possono essere difficili o impossibili da catturare utilizzando l'istologia. Questo metodo IVM può essere utilizzato anche per catturare e identificare processi sequenziali (ad esempio, interazioni avviate da piastrine o leucociti che si traducono in aggregati piastrine-leucociti legati all'endotelio vascolare). Infine, questo metodo può essere adattato a una serie di sistemi di imaging. A seconda delle esigenze dello studio e del set di dati desiderato, dopo la preparazione chirurgica, il fegato esternalizzato può essere posizionato su quasi tutti i sistemi di imaging desiderati. Abbiamo applicato con successo questo protocollo all'imaging utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo, la microscopia a disco rotante, la microscopia confocale a scansione laser utilizzando uno scanner a testina di risonanza e la microscopia a due fotoni. Tuttavia, non c'è motivo di credere che questo metodo debba essere limitato ai suddetti sistemi di microscopia.

Questo documento delinea un protocollo per l'IVM, che è stato utilizzato in precedenza per studiare le interazioni piastrine-leucociti-endoteliali nel fegato del topo. Questo protocollo è stato utilizzato per confrontare l'adesione temporale piastrinica-endoteliale delle piastrine, marcate con anticorpi coniugati fluorescenti o geneticamente modificate per la fluorescenza endogena⁴. Questo protocollo è stato utilizzato per valutare le interazioni transitorie piastrine-leucociti-endoteliali nelle sinusoidi epatiche in un modello endotossico di infiammazione epatica e per co-localizzare la P-selectina e la proteina ricombinante. Inoltre, questo protocollo ha permesso di determinare se le differenze osservate nella densità dei neutrofili utilizzando l'istologia standard fossero il risultato di differenze nelle velocità dei globuli rossi (come surrogato della velocità di flusso volumetrico)⁵. Infine, questo metodo è stato utilizzato per valutare il reclutamento piastrinico da parte delle cellule di Kupffer nei sinusoidi epatici in un modello acuto di danno epatico indotto da APAP⁶. Questo corpus di lavori non sarebbe stato possibile con i metodi istologici standard. Come affermato, questo protocollo può essere adattato per una varietà di sistemi di imaging e, con un'adeguata preparazione chirurgica, la scelta degli anticorpi fluorescenti e le impostazioni di imaging, questo protocollo è altamente affidabile e riproducibile per lo studio della patologia epatica.

Protocollo

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Baylor College of Medicine e dal Comitato per la Ricerca e lo Sviluppo del Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center. Tutti gli esperimenti sono terminali, con l'eutanasia eseguita alla fine sotto un piano chirurgico di anestesia. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo.

1. Preparazione di anticorpi e coloranti

1. Selezione di anticorpi e coloranti
   NOTA: Il numero di colori simultanei osservati dipenderà dalla configurazione specifica del microscopio. Nel sistema qui utilizzato, è possibile visualizzare contemporaneamente quattro diverse lunghezze d'onda.
   1. Visualizzazione delle imbarcazioni:
      1. Sulla base del disegno sperimentale, etichettare il sistema vascolare con un anticorpo specifico per l'endotelio (ad es. CD31) e/o una molecola uniformemente distribuita nel plasma (ad es. destrano o albumina).
         NOTA: Questo articolo descrive l'uso del destrano marcato con Texas Red (150 kDa; 250 μg/mouse). Il vantaggio di questa proteina ad alto peso molecolare sta nella sua capacità di rimanere all'interno del sistema vascolare durante l'infiammazione acuta. È necessario prestare attenzione quando si utilizza la marcatura degli anticorpi per evitare anticorpi che hanno il potenziale di interferire con la funzione endoteliale.
   2. Visualizzazione delle piastrine:
      1. Per identificare le piastrine, utilizzare topi geneticamente modificati (ad es. R26R-EYFP^f/f/PF4-Cre) o anticorpi piastrinici specifici (ad es. anti-GPIbβ) per IVM. Per informazioni approfondite sull'uso della marcatura fluorescente delle piastrine, fare riferimento a una precedente pubblicazione⁴.
         NOTA: In questo caso vengono utilizzati anticorpi anti-GPIbβ marcati con DyLight488 (X488; 6 μg/topo). È necessario prestare attenzione quando si utilizza la marcatura degli anticorpi per evitare interferenze con la funzione piastrinica o l'adesione.
   3. Visualizzazione dei leucociti:
      1. Analogamente all'imaging piastrinico, visualizza i leucociti di interesse con topi geneticamente modificati (ad esempio, LysM-EGFP per i granulociti) o anticorpi specifici per i leucociti (ad esempio, Ly6G per i neutrofili murini). Per seguire questo protocollo, utilizzare gli anticorpi anti-Ly6G marcati con Brilliant Violet 421 (BV421) (3 μg/topo). In esperimenti acuti (<6 ore), marcare i neutrofili con 3 μg di anti-Ly6G (clone 1A8) per animale.
         NOTA: Quando si utilizza l'anticorpo anti-Ly6G (clone 1A8), si noti che questo anticorpo è stato utilizzato per esaurire i neutrofili (0,05-1 mg di anticorpo/topo)^7-9 dopo almeno 24 ore e/o con iniezioni ripetute. È stato anche riportato che gli anticorpi anti-Ly6G (1A8) influenzano l'adesione e la trasmigrazione dei neutrofili ad alto (ma non basso) stress di taglio in alcune, ma non tutte, situazioni ^9,10. Pertanto, il dosaggio degli anticorpi deve essere scelto con cura per ogni caso.
   4. Proteine aggiuntive:
      1. A seconda del numero di laser e di set/rilevatori di filtri disponibili su un particolare sistema di imaging, è possibile aggiungere più lunghezze d'onda per identificare più oggetti contemporaneamente, facendo attenzione a evitare la sovrapposizione spettrale.
         NOTA: Questo protocollo descrive l'imaging di un 4° oggetto, P-selectina (clone Psel.KO2.3), utilizzando un anticorpo anti-P-selectina marcato con PerCP-eFluor 710 (4 μg/topo). Sebbene la maggior parte delle descrizioni e delle immagini in questo articolo siano per danno epatico acuto indotto da LPS, altri modelli di lesione possono essere interessanti e possono richiedere etichette alternative. Vedere la discussione per una descrizione degli anticorpi utilizzati per il danno indotto da APAP⁶.
2. Rimozione dei conservanti e sterilizzazione
   NOTA: Sebbene siano disponibili in commercio anticorpi e coloranti pronti per l'iniezione negli animali, la maggior parte di essi avrà vettori o conservanti (ad esempio, sodio azide) che possono essere dannosi per gli animali o aggiungere variabili confondenti. Gli anticorpi e i coloranti contenenti vettori o conservanti devono essere dializzati contro la soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio o magnesio (DPBS^-/-; o altri tamponi fisiologici).
   1. Versare 500 mL di DPBS^-/- (~1.000 volte il volume dell'anticorpo/colorante da dializzare) in un becher con un'ancoretta magnetica. Collegare una cassetta da 7.000 MWCO a una boa galleggiante e posizionarla nel tampone di dialisi per almeno 5 minuti per precondizionare la membrana. Rimuovere la cassetta e asciugare i bordi in plastica con un fazzoletto privo di lanugine. Evitare di toccare la membrana di dialisi.
   2. Iniettare l'anticorpo/colorante nella cassetta attraverso una delle quattro porte utilizzando un ago da 18-20 G. Posizionare la cassetta con l'anticorpo/colorante nel tampone per dialisi. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e dializzare per almeno 1 ora a 4 °C. Sostituire il tampone per dialisi.
   3. Ripetere la dialisi e la sostituzione del tampone per dialisi al punto 1.2.2 per almeno altre due volte (almeno tre scambi).
   4. Rimuovere la cassetta e asciugare i bordi in plastica con un fazzoletto privo di lanugine. Evitare di toccare la membrana di dialisi. Aspirare l'anticorpo/colorante dalla cassetta attraverso una porta inutilizzata utilizzando un ago da 18-20 G.
   5. In una cappa di coltura tissutale, sterilizzare le preparazioni utilizzando un filtro da 0,2 μm prima dell'uso sugli animali. Conservare le parti non utilizzate in provette sterili a 4 °C.
3. Controlli
   1. Sebbene i controlli esatti necessari per ogni esperimento varino a seconda del disegno dello studio, assicurarsi di includere coorti fittizie adeguate, gruppi trattati con veicolo e non trattati con veicolo, nonché controlli isotipici al fine di escludere l'etichettatura non specifica e gli effetti biologici durante l'analisi dei risultati dello studio.

2. Iniezione intraperitoneale di endotossine

NOTA: Per valutare le interazioni piastrine-neutrofili-endoteliali nelle sinusoidi epatiche in un modello sperimentale di sepsi murina, può essere utilizzata l'iniezione di endotossine.

1. Pesare i topi per determinare la quantità di endotossina da iniettare (5 mg/kg; Escherichia coli sierotipo O111:B4; contenuto di endotossine 1 x 10⁶ EU/mg).
   NOTA: La potenza e l'effetto delle endotossine dipendono dalla specie e dal ceppo e possono variare da lotto a lotto¹¹. Pertanto, per massimizzare la coerenza dei risultati, gli esperimenti dovrebbero essere condotti con lo stesso lotto di endotossina¹².
2. Aspirare l'endotossina diluita con soluzione fisiologica normale (cloruro di sodio allo 0,9%) in una siringa con un ago da 27 G inserito. Nella mano non dominante, tieni il mouse per la collottola usando il pollice e l'indice. Usando l'altra mano, metti la trazione sulla coda per esporre l'addome e posiziona la coda tra il quinto dito e il palmo della mano non dominante.
3. Pulisci l'addome con etanolo al 70%. Inserire l'ago nell'addome in basso a sinistra (o a destra) e iniettare l'endotossina.
   NOTA: Prestare attenzione per evitare di inserire l'ago troppo in profondità perché esiste il rischio di lesioni agli organi che potrebbero confondere gli esperimenti (ad esempio, lesioni all'intestino, all'intestino, ai reni, ecc.).
4. Eseguire i passaggi 2.1-2.3 negli animali di controllo utilizzando soluzione fisiologica normale (o veicolo).
   NOTA: Il danno epatico indotto da APAP può essere ottenuto utilizzando una metodologia simile a quella sopra, utilizzando APAP piuttosto che l'endotossina⁶. Vedere la discussione per i dettagli relativi al modello di danno epatico indotto da APAP.

3. Induzione e mantenimento dell'anestesia degli animali ed eutanasia

1. Posizionare gli animali sotto un piano chirurgico di anestesia. Mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano inalato tramite un cono o un tubo tracheostomico. Valuta e regola il livello di anestesia monitorando il movimento dopo un pizzicamento del dito del piede.
2. Eseguire l'eutanasia al termine di tutti gli esperimenti mediante dissanguamento sotto un piano chirurgico di anestesia seguito da pneumotorace bilaterale.

4. Cateterismo della vena giugulare e della trachea

1. Eseguire una tracheotomia per facilitare la respirazione e il posizionamento di cateteri vascolari per l'iniezione di anticorpi/coloranti marcati.
   NOTA: Un microscopio per dissezione chirurgica o lenti d'ingrandimento sono utili per il cateterismo.
2. Radere il pelo dal collo e dall'addome; Rimuovere i peli in eccesso. Posizionare l'animale su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 °C, utilizzando una sonda rettale per monitorare la temperatura interna. Strofinare il collo con betadina seguita da etanolo al 70%.
3. Praticare un'incisione verticale sulla linea mediana nel collo ed esporre la trachea utilizzando la dissezione smussata.
   1. Tracheostomia
      1. Preparare un tubo tracheostomico PE90 con un ago smussato da 21 G inserito (Figura 1A).
         NOTA: L'aggiunta di uno smusso di ~45° all'estremità del tubo tracheostomico può aiutare a facilitarne l'inserimento nella trachea. In alternativa, un catetere endovenoso periferico da 18-20 G può anche essere sostituito con il tubo PE90.
      2. Una volta incisa la pelle e la fascia, riflettere le ghiandole salivari lontano dal centro.
      3. Utilizzando la dissezione smussata, separare il muscolo sternotiroideo per dare un migliore accesso alla trachea.
         NOTA: Fare attenzione ad evitare i vasi di alimentazione e le arterie carotidi adiacenti alla trachea.
      4. Praticare una piccola incisione orizzontale (~1-2 mm) tra gli anelli tracheali sul lato ventrale/anteriore della trachea (Figura 1B).
         NOTA: L'uso delle forbici Vannas faciliterà una corretta dissezione. Assicurarsi che venga incisa solo la faccia anteriore della trachea; La transezione completa della trachea renderà difficile incannulare la trachea e rischia di danneggiare le strutture vascolari vicine.
      5. Passare un tubo per tracheostomia nel foro. Assicurarsi che la punta del tubo non sia inserita oltre la carena.
      6. Fissare il tubo tracheostomico all'interno della trachea legando una sutura di seta #4-0 attorno alla trachea e al tubo, utilizzando gli anelli tracheali come supporto (Figura 1C).
   2. Incannulamento giugulare esterno
      1. Preparare un catetere giugulare (Figura 2) utilizzando un tubo PE50 (OD 0,97 mm, ID 0,58 mm) con un tubo PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) inserito in un'estremità (Figura 2 nel riquadro) e un ago smussato da 22 G o 23 G inserito nell'altra. Utilizzare l'adesivo per assicurarsi che il tubo non scivoli o perda. Collegare una siringa riempita con soluzione fisiologica normale sterile per lavare il catetere.
      2. Esporre la vena giugulare esterna (EJV) dopo la riflessione delle ghiandole salivari. Utilizzando la dissezione smussata, liberare l'EJV dal tessuto connettivo circostante (Figura 3A).
      3. Utilizzando le suture di seta #4-0, legare l'estremità cranica dell'EJV visualizzata e posizionare un anello libero attorno all'estremità caudale dell'EJV (Figura 3B). Bloccare le estremità di ciascuna sutura insieme con gli emostatici e ritrarre delicatamente i due emostati l'uno dall'altro per aiutare a esporre l'EJV.
         NOTA: La regione ottimale per incannulare è tra i rami della vena giugulare anteriore cranialmente e la vena giugulare interna caudalmente. Per facilitare il posizionamento della sutura, piegare un pezzo (~15 cm) di sutura a metà e passare l'estremità piegata sotto l'EJV con un paio di pinze, sollevando l'EJV con un paio di pinze separate per evitare il rotolamento del vaso. Quindi, taglia la sutura per creare due lunghezze separate.
      4. Con le forbici di Vannas, praticare una piccola incisione (~1 mm) sulla superficie anteriore dell'EJV. Inserire un ago smussato piegato da 30 G (aumentato con un perno da 0,15 mm limato senza mezzi termini e inserito nella punta dell'ago) nell'EJV attraverso l'incisione e sollevarlo delicatamente per facilitare il passaggio del catetere contenente soluzione fisiologica normale nell'EJV.
         NOTA: Assicurarsi che il catetere e il mozzo non presentino bolle d'aria prima di inserirli e lavarli nel mouse. Un embolo aereo può essere letale per l'animale.
      5. Una volta che il catetere si trova all'interno dell'EJV, allentare l'ansa caudale quanto basta per consentire il passaggio del catetere più in profondità nella vena. Verificare il posizionamento del catetere aspirando il sangue e lavando il catetere per verificare la presenza di perdite (Figura 3C).
      6. Utilizzando l'ansa caudale, fissare il catetere all'interno dell'EJV. Utilizzando la sutura cranica, fissare il catetere all'estremità cranica dell'EJV per ridurre al minimo la decannulazione accidentale (Figura 3D).
      7. Chiudere l'incisione cutanea del collo con sutura di seta #4-0.

5. Esteriorizzazione del fegato

1. Pulisci l'addome con uno scrub a base di betadina seguito da etanolo al 70%.
2. Praticare un'incisione verticale di ~ 1 cm nella pelle della parte superiore dell'addome iniziando dalla base dello sterno. Usando la dissezione smussata, separare la pelle dai muscoli addominali. Cauterizzare i grandi vasi di alimentazione della pelle e dei muscoli per ridurre al minimo il sanguinamento durante i passaggi successivi (Figura 4A).
3. Praticare un'incisione orizzontale di ~1-2 cm della pelle seguita dal muscolo addominale, dividendo in due l'incisione verticale nel passaggio 5.2 circa nella parte superiore del fegato visibile; utilizzare uno strumento cauterizzato per assistere nell'emostasi della pelle (Figura 4B).
   NOTA: La dimensione dell'incisione dell'addome è fondamentale per un imaging ottimale del fegato. Se l'apertura è troppo piccola, c'è il rischio di ischemia epatica a causa di un eccessivo stiramento o di un conflitto dell'arteria epatica e/o della vena porta. Se l'apertura è troppo grande, anche altri organi, come l'intestino, possono essere esteriorizzati e interferire con l'imaging.
4. Tagliare un cerchio di circa 1 cm al centro di una garza da 2 pollici x 2 e inumidirlo con soluzione fisiologica calda. Posizionare la garza in modo che l'apertura sia centrata sull'incisione. Separare delicatamente i bordi dell'incisione e applicare una leggera pressione verso l'alto sull'addome per esteriorizzare il fegato in modo che il fegato poggi facilmente sopra la garza inumidita (Figura 4C).
5. Posizionare il mouse sul vassoio di imaging in posizione prona, con il fegato centrato sul vetrino coprioggetti (Figura 4D).
   NOTA: In un animale di controllo, il fegato dovrebbe apparire marrone. In questo protocollo viene utilizzato un microscopio confocale a scansione laser invertito con uno scanner a testina di risonanza a due vie per l'IVM. Pertanto, è stata utilizzata una stampante 3D per creare un vassoio IVM personalizzato (Figura 5). Vengono forniti i file .stl creati per la stampa 3D (File supplementare 1); Possono essere necessari aggiustamenti per soddisfare le esigenze individuali.
6. Trasferire l'animale al microscopio invertito.

6. Imaging al microscopio intravitale del fegato

NOTA: Questo protocollo utilizza un microscopio confocale a scansione laser con uno scanner della testina di risonanza a due vie per la microscopia intravitale. Per stabilizzare la frequenza della testina di risonanza, accendere il sistema per almeno 30 minuti prima dell'imaging. Sistemi diversi possono avere capacità diverse. La discussione di questi esula dallo scopo di questo articolo. Contattare i rappresentanti delle apparecchiature per i dettagli tecnici di sistemi specifici.

1. Per mantenere un piano chirurgico di anestesia, collegare l'animale al sistema di somministrazione dell'isoflurano.
   NOTA: A seconda del protocollo sperimentale, può essere necessaria la ventilazione meccanica (rispetto alla ventilazione spontanea).
2. Posizionare un cuscinetto riscaldante radiante sull'animale, utilizzando la sonda rettale per mantenere una temperatura interna di 37 °C.
   NOTA: In questo protocollo, un pezzo rettangolare di schiuma che si inserisce attorno al vassoio IVM funge da isolante e distanziatore su cui posizionare il cuscinetto riscaldante radiante (Figura 4D).
3. Impostare la torretta dell'obiettivo sull'ingrandimento desiderato, applicando olio da immersione se necessario. Per seguire questo protocollo, utilizzare l'obiettivo a olio siliconico 60x/NA1.30 con zoom ottico 1x.
4. Una volta identificato il piano focale, identificare ≥10 campi visivi casuali, evitando le aree vicino ai bordi del fegato.
   NOTA: Poiché il fegato mostra autofluorescenza nel canale dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC), utilizzare l'epifluorescenza per identificare rapidamente il piano focale generale.
   1. A seconda del sistema, identificare i bordi del fegato visibili utilizzando l'epifluorescenza nel canale FITC e registrare le coordinate dello stadio (x,y).
   2. Usa i confini (x,y) del fegato e un generatore di numeri casuali per identificare coordinate casuali (x,y). Per un campo visivo accettabile, cercare (a) la presenza di imbarcazioni disperse in tutto il campo visivo; b) ≥80% delle navi sullo stesso piano focale; e (c) campo visivo di ≥1 lontano da qualsiasi bordo del fegato (esempio nella Figura 6). Se l'analisi di immagine si concentra sulle interazioni piastrine-leucociti-endoteliali nei sinusoidi epatici, escludere i campi con vasi il cui diametro è di ≥15 μm (i sinusoidi murini hanno tipicamente un diametro di ≤10 μm).

7. Analisi delle immagini

NOTA: ImageJ/FIJI è stato utilizzato per elaborare tutte le immagini in questo documento. FIJI (fiji.sc) è una versione open source di Image J (imagej.nih.gov) che ha più funzionalità attraverso l'uso di plug-in e macro aggiuntivi¹³.

1. Aprire i file time-lapse multicanale in ImageJ/FIJI.
   NOTA: A seconda della piattaforma, potrebbero essere necessari programmi/plug-in aggiuntivi. ImageJ/FIJI dispone di un importatore di formati biologici in grado di aprire diversi tipi di file, come i file .oir di Olympus. Qui, i file sono stati convertiti in .tif perché è un formato più utilizzato.
2. Assicurarsi che sia impostata la scala corretta; Cerca il rapporto pixel/μm e l'intervallo di tempo nei metadati/proprietà.
3. Utilizza filtri diversi per rimuovere il rumore di fondo (ad esempio, un filtro mediano con un raggio di 2 pixel utilizzato in questo protocollo). Assicurati che l'elaborazione sia simile tra tutte le immagini per ridurre al minimo le variazioni nella post-elaborazione. Poiché i conteggi e le lunghezze vengono confrontati in questi esperimenti, invece dell'intensità media della fluorescenza, filtrare per migliorare la chiarezza e l'identificazione e la misurazione delle interazioni cellula-cellula.
   NOTA: L'uso e l'entità dei filtri dipenderanno dalle dimensioni dei target di interesse e dal rapporto segnale/rumore nelle immagini.
4. Poiché esiste eterogeneità tra i campi visivi in densità vascolare, misurare l'area vascolare totale in ciascun campo utilizzando il pennello di selezione (Figura 7).
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento di selezione ovale e selezionare lo strumento pennello di selezione .
   2. Regola le dimensioni del pennello facendo doppio clic sull'icona dello strumento pennello di selezione .
   3. Traccia i vasi per evidenziarli/selezionarli. Per eliminare parti della selezione, fare clic con il pulsante sinistro del mouse [alt] e aggiungere le parti con il clic sinistro [shift].
   4. Premete [M] per misurare l'area selezionata.
      NOTA: Se la scala dell'immagine è stata impostata correttamente, l'output dovrebbe essere in μm², che viene convertito in mm².
5. Conta il numero di piastrine e leucociti nel campo. Considera le cellule come cellule aderenti se si sono spostate <1 corpo cellulare per oltre 30 s. Calcolare il numero di cellule (piastrine e/o leucociti) per mm².
6. Per stimare il flusso sanguigno relativo all'interno di ciascun vaso, misurare la velocità media dei globuli rossi (RBC) come surrogato utilizzando il plug-in MTrackJ in ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)¹⁴, come descritto in precedenza⁵. Identificare i globuli rossi come difetti di riempimento rotondi o a forma di disco nel canale del destrano. Salva le tracce per la tenuta dei registri, l'analisi asincrona e la verifica.
   NOTA: un esempio di questo è mostrato nella Figura 8 e nel video supplementare S1.

Risultati

Valutazione dell'effetto del dominio dei bastoncelli della vimentina nell'adesione dei leucociti all'endotelio infiammato
Il legame del ligando-1 della glicoproteina P-selectina dei leucociti (PSGL-1) alla P-selectina endoteliale e piastrinica si verifica durante la fase acuta dell'infiammazione da danno epatico indotta da sepsi. Tuttavia, è stato dimostrato che il dominio dei bastoncelli umani ricombinante della vimentina (rhRod) si lega alla P-selectina e blocca l'adesione dei leucociti sia all'endo...

Discussione

Lo scopo di questo documento sui metodi è quello di delineare i passaggi necessari per acquisire in modo affidabile immagini e video intravitali ad alta risoluzione del fegato di topo in condizioni omeostatiche e dopo la somministrazione di endotossina o APAP. Sebbene questo protocollo abbia consentito la produzione coerente di dati sulle interazioni piastrine-leucociti-endoteliali nel fegato, ci sono una serie di passaggi critici necessari per il successo, nonché potenziali insidie che ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Forniture chirurgiche
2" x 2" spugne non tessute	McKesson Med. Surg	92242000	Per l'isolamento del fegato
#4-0 sutura intrecciata in seta con ago	SOFSILK	N/A	4-0 intrecciato rivestito in softsilk nero, non assorbibile: ago da taglio C-1
#4-0 sutura intrecciata in seta senza ago	Ethicon	N/A	4-0 Seta intrecciata nera, ago
smussato da 21 G non assorbibile (0,5 pollici)	SAI Infusion Technologies	B21-50	Viene utilizzato per il fissaggio all'estremità del tubo tracheostomico per consentire il collegamento al ventilatore. Una fonte alternativa è
l'ago smussato Instech 23 G (0,5 pollici)	SAI Infusion Technologies	B23-50	Questo viene utilizzato per il catetere vascolare per consentire il collegamento a una siringa. Una fonte alternativa è Instech
Dissecting Scissors (Pointed Tip)	Kent Scientific	INS600393-G	Micro Dissecting Scissors; lame in metallo duro; Diritto; punte acuminate; Lunghezza lama 24 mm; 4 1/2" Lunghezza totale Micro
forbici McPherson-Vannas (Vannas)	Kent Scientific	INS600124	Queste sono utili per creare le aperture nella trachea e nei vasi
Tubo in polietilene 10	Instech	BTPE-10	Questo viene utilizzato per realizzare la parte intravascolare del catetere. Una fonte alternativa è
il tubo in polietilene	Instech	BTPE-50	Questo viene utilizzato per realizzare la parte extravascolare del catetere. Una fonte alternativa è
il tubo in polietilene	Instech	BTPE-90	Questo viene utilizzato per realizzare il tubo tracheostomico. Una fonte alternativa è BD Intramedic
USP grade sterile soluzione salina normale	Coviden	8881570121	Hospira 0,0% Sodium Chloride Injection, USP
Microscopy Supplies
Isoflurane e ventilatore	Kent Scientific	Somnosuite	Combination Ventilatore per roditori e sistema
di somministrazione di anestetico volatileDistanziatore in schiuma per cuscinetto riscaldante durante la microscopia	N/A	N/A	Questo distanziatore deve essere tagliato in schiuma di alta qualità, deve adattarsi al vassoio del microscopio epatico e le dimensioni specifiche dell'altezza dipendono dal sistema del microscopio
microscopio confocale a scansione laser con scanner della testa di risonanza	Olympus	FV3000	Sebbene descriviamo l'uso di un Olympus FV3000 utilizzando uno scanner della testa di risonanza, questo protocollo funziona con la maggior parte dei sistemi di imaging
Vassoio per microscopio epatico	N/A	N/A	Il vassoio per microscopio epatico è stato progettato per un microscopio invertito
Antibodies & Reagenti correlati
Brilliant Violet 421/anticorpo Ly6G anti-topo	BioLegend	127628	3 &; g/mouse. Per marcare i neutrofili,
l'anticorpo BV421/F4/80	BioLegend	123132	0,75 mg/kg. Per marcare le cellule di Kupffer
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio o magnesio	Gibco/ThermoFisher Scientific	14190144	Utilizzato come dialisato per rimuovere l'azide di sodio dagli anticorpi
DyLight649/anti-GPIbβ	emfret Analytics	X649	3 &; g/mouse. Per etichettare le piastrine
DyLight488/anti-topo GPIbβ anticorpo	emfret Analytics	X488	6 &; micro; g/mouse. Per etichettare le piastrine
Endotossina da Escherichia coli sierotipo O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024	5 mg/kg; La potenza dell'endotossina può variare da lotto a lotto. Pertanto, lo stesso lotto dovrebbe essere utilizzato per una serie di esperimenti per ridurre al minimo la variazione dovuta al lotto di endotossine
PerCP-eFluor 710/anticorpo anti-topo P-selectina	Invitrogen	46-0626-82	4 &; g/mouse. Per etichettare P-selectin
Slide-a-Lyzer 7.000 MWCO cassetta	Thermo Scientific	66370	Utilizzato per dializzare gli anticorpi per rimuovere l'azide di sodio
Destrano marcato in rosso Texas	Sigma-Aldrich	T1287	~150 kDa; 250 e micro; g/topo
TRITC/albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A2289	500 µ g/mouse. Diluire a una concentrazione madre di 50 mg/mL (5%) in soluzione fisiologica. Utilizzato per etichettare il sistema vascolare. Può fuoriuscire nello spazio interstiziale più facilmente del destrano ad alto peso molecolare durante l'infiammazione