Individuazione di intermedi di ricombinazione omologhi tramite legatura di prossimità e PCR quantitativa in Saccharomyces cerevisiae

Diedre Reitz; Jérôme Savocco; Aurèle Piazza; Wolf-Dietrich Heyer

doi:10.3791/64240

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Individuazione di intermedi di ricombinazione omologhi tramite legatura di prossimità e PCR quantitativa in Saccharomyces cerevisiae

2.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/64240

⸱

11 settembre 2022

Diedre Reitz¹ , Jérôme Savocco² , Aurèle Piazza² , Wolf-Dietrich Heyer¹^,³

¹Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, ²Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, ³Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

I saggi di acquisizione D-loop (DLC) e D-loop extension (DLE) utilizzano il principio della legatura di prossimità insieme alla PCR quantitativa per quantificare la formazione di D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione del prodotto nel sito di una rottura inducibile a doppio filamento in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

I danni al DNA, comprese le rotture a doppio filamento del DNA e i legami incrociati tra filamenti, subiti durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare possono essere riparati mediante ricombinazione omologa (HR). Inoltre, HR rappresenta un importante meccanismo di salvataggio della forcella di replica dopo lo stallo o il collasso. La regolazione dei molti passi reversibili e irreversibili di questo complesso percorso ne promuove la fedeltà. L'analisi fisica degli intermedi di ricombinazione formati durante la HR consente la caratterizzazione di questi controlli da parte di vari fattori nucleoproteici e dei loro interattori. Sebbene esistano metodi consolidati per analizzare eventi specifici e intermedi nel percorso di ricombinazione, il rilevamento della formazione e dell'estensione del D-loop, due passaggi critici in questo percorso, si è dimostrato difficile fino a poco tempo fa. Qui vengono descritti metodi efficienti per rilevare eventi chiave nel percorso HR, vale a dire la formazione di rottura a doppio filamento del DNA, la formazione del D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione di prodotti tramite replicazione indotta da rottura (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Questi test rilevano i loro intermedi di ricombinazione rilevanti e prodotti ad alta sensibilità e sono indipendenti dalla vitalità cellulare. Il rilevamento di D-loop, estensione D-loop e il prodotto BIR si basa sulla legatura di prossimità. Insieme, questi saggi consentono lo studio della cinetica della FC a livello di popolazione per affrontare con precisione le funzioni delle proteine HR e dei regolatori in fasi significative del percorso.

Introduzione

La ricombinazione omologa (HR) è un meccanismo ad alta fedeltà di riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA (DSB), dei legami incrociati tra filamenti e delle lacune del ssDNA, nonché un percorso per la tolleranza al danno del DNA. L'HR differisce dai percorsi soggetti a errori per la riparazione/tolleranza al danno al DNA, come la giunzione finale non omologa (NHEJ) e la sintesi translesionale, in quanto utilizza un DNA duplex intatto e omologo come donatore per modellare l'evento di riparazione. Inoltre, molti degli intermedi chiave nel percorso HR sono reversibili, consentendo una regolazione squisita delle singole fasi del percorso. Durante le fasi S, G....