Articolo metodologico

Visualizzazione della dinamica conformazionale dei recettori di membrana utilizzando FRET a singola molecola

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DOI:

10.3791/64254

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17 agosto 2022

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1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta una procedura dettagliata per eseguire esperimenti di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) sui recettori accoppiati a proteine G (GPCR) utilizzando la marcatura sito-specifica tramite incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA). Il protocollo fornisce una guida passo-passo per la preparazione dei campioni smFRET, gli esperimenti e l'analisi dei dati.

Abstract

La capacità delle cellule di rispondere ai segnali esterni è essenziale per lo sviluppo, la crescita e la sopravvivenza cellulare. Per rispondere a un segnale proveniente dall'ambiente, una cellula deve essere in grado di riconoscerlo ed elaborarlo. Questo compito si basa principalmente sulla funzione dei recettori di membrana, il cui ruolo è quello di convertire i segnali nel linguaggio biochimico della cellula. I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande famiglia di proteine recettoriali di membrana nell'uomo. Tra i GPCR, i recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono una sottoclasse unica che funziona come dimeri obbligati e possiede un ampio dominio extracellulare che contiene il sito di legame del ligando. I recenti progressi negli studi strutturali dei mGluR hanno migliorato la comprensione del loro processo di attivazione. Tuttavia, la propagazione di cambiamenti conformazionali su larga scala attraverso mGluR durante l'attivazione e la modulazione è poco conosciuta. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica potente per visualizzare e quantificare la dinamica strutturale delle biomolecole a livello di singola proteina. Per visualizzare il processo dinamico di attivazione di mGluR2, sono stati sviluppati sensori conformazionali fluorescenti basati sull'incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA) che hanno permesso la marcatura proteica sito-specifica senza perturbazioni della struttura nativa dei recettori. Il protocollo qui descritto spiega come eseguire questi esperimenti, incluso il nuovo approccio di etichettatura UAA, la preparazione del campione e l'acquisizione e l'analisi dei dati smFRET. Queste strategie sono generalizzabili e possono essere estese per studiare le dinamiche conformazionali di una varietà di proteine di membrana.

Introduzione

Il trasferimento di informazioni attraverso la membrana plasmatica dipende fortemente dalla funzione dei recettori di membrana1. Il legame del ligando a un recettore porta a un cambiamento conformazionale e all'attivazione del recettore. Questo processo è spesso di natura allosterica2. Con oltre 800 membri, i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono la più grande famiglia di recettori di membrana nell'uomo3. A causa del loro ruolo in quasi tutti i processi cellulari, i GPCR sono diventati obiettivi importanti per lo sviluppo terapeutico. Nel modello canonico di segnalazione GPCR, l'attivazione agonista provoca cambiamenti conformazionali del recettore che successivamente attivano il complesso della proteina G eterotrimerica attraverso lo scambio di GDP per GTP nella tasca di legame nucleotidico di Gα. Le subunità G α-GTP e Gβγ attivate controllano quindi l'attività delle proteine effettrici a valle e propagano la cascata di segnalazione 4,5. Questo processo di segnalazione dipende essenzialmente dalla capacità dei ligandi di cambiare la forma tridimensionale del recettore. Una comprensione meccanicistica di come i ligandi raggiungono questo obiettivo è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie e la progettazione di recettori e sensori sintetici.

I recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono membri della famiglia GPCR di classe C e sono importanti per gli effetti neuromodulatori lenti del glutammato e per la sintonizzazione dell'eccitabilità neuronale 6,7. Tra tutti i GPCR, i GPCR di classe C sono strutturalmente unici in quanto funzionano come dimeri obbligati. mGluR contiene tre domini strutturali: il dominio Venere acchiappamosche (VFT), il dominio ricco di cisteina (CRD) e il dominio transmembrana (TMD)8. I cambiamenti conformazionali durante il processo di attivazione sono complessi e coinvolgono l'accoppiamento conformazionale locale e globale che si propaga su una distanza di 12 nm, così come la cooperatività del dimero. Le conformazioni intermedie, l'ordinamento temporale degli stati e il tasso di transizione tra gli stati sono sconosciuti. Seguendo in tempo reale la conformazione dei singoli recettori è possibile individuare gli stati intermedi transitori e la sequenza dei cambiamenti conformazionali durante l'attivazione. Questo può essere ottenuto applicando il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola 9,10 (smFRET), come è stato recentemente applicato per visualizzare la propagazione dei cambiamenti conformazionali durante l'attivazione di mGluR2 11. Un passo fondamentale negli esperimenti FRET è la generazione di sensori FRET mediante inserimento sito-specifico dei fluorofori donatori e accettori nella proteina di interesse. Una strategia di incorporazione di aminoacidi innaturali (UAA) è stata adottata12,13,14,15 per superare i limiti delle tipiche tecnologie di etichettatura fluorescente sito-specifiche che richiedono la creazione di mutanti senza cisteina o l'inserimento di un grande tag geneticamente codificato. Ciò ha permesso di osservare il riarrangiamento conformazionale dell'essenziale linker allosterico compatto, che si univa ai domini di legame e segnalazione del ligando di mGluR2. In questo protocollo, viene presentata una guida passo-passo per eseguire esperimenti smFRET su mGluR2, incluso l'approccio per l'etichettatura sito-specifica di mGluR2 con UAA per attaccare fluorofori utilizzando la reazione di ciclizzazione dell'azide catalizzata dal rame. Inoltre, questo protocollo descrive la metodologia per la cattura diretta delle proteine di membrana e l'analisi dei dati. Il protocollo qui delineato è applicabile anche allo studio della dinamica conformazionale di altre proteine di membrana.

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Protocollo

Il flusso di lavoro complessivo del protocollo è descritto nella Figura 1.

1. Preparazione della camera di campionamento

  1. Pulizia vetrini e coprivetrini
    NOTA: Questi passaggi mirano a pulire le superfici dei vetrini e dei vetrini e prepararli per l'aminosilanizzazione. Un requisito critico per condurre esperimenti di fluorescenza a singola molecola su molecole legate alla superficie è una superficie passivata. La tecnica di passivazione più affidabile e riproducibile consiste nell'attaccare covalentemente catene polimeriche inerti alla superficie del vetro come uno strato denso. Il glicole polietilenico (PEG) è il polimero più efficiente utilizzato per la passivazione superficiale16. I dettagli della procedura di passivazione mediante PEG (PEGylation) sono descritti di seguito:
    1. Segnare i fori da praticare sulle guide con un pennarello (~6 mm di distanza e lontano dal bordo). Utilizzare un Dremel per praticare piccoli fori (diametro 1 mm) sul vetrino. Immergere gli scivoli in acqua durante il processo di perforazione.
    2. Lavare i vetrini con acetone per rimuovere l'inchiostro residuo dal pennarello.
    3. Togliere dall'acetone e sciacquare i vetrini con acqua, quindi cuocerli nel microonde per 5 minuti in acqua ad alta potenza (700 W).
    4. Pulire i vetrini con acqua prima di metterli in un barattolo di vetro per essere sonicati. Posizionare i vetrini in un barattolo di colorazione diverso.
    5. Sonicare i vetrini e i coprivetrini in acetone per 30 minuti in un sonicatore da bagno a 23 °C.
    6. Nel frattempo, pulire un matraccio di vetro per preparare la soluzione di aminosilanizzazione utilizzata durante la fase successiva. Riempire il pallone con 1 M KOH, sonicare il pallone per 30 minuti, sciacquare accuratamente il KOH con acqua e quindi sonicare per altri 30 minuti in metanolo. Lasciare il matraccio in metanolo fino al momento della fase di aminosilanizzazione.
    7. Nel frattempo, rimuovere aminosilano, mPEG e biotina-PEG dal congelatore (-20 °C) e lasciarli arrivare a temperatura ambiente (RT) al buio.
    8. Smaltire l'acetone dai barattoli di vetrino e coprivetrino nell'apposito contenitore per rifiuti chimici, sciacquare abbondantemente con acqua, quindi sonicare i vetrini in 5 M KOH per 30 minuti.
    9. Risciacquare i vetrini e i coperchi con acqua, quindi sonicare in metanolo per 2 minuti (ripetere due volte). Lasciare i barattoli pieni di metanolo fino alla fase di aminosilanizzazione.
      NOTA: In questo studio, viene utilizzata acqua deionizzata se non diversamente specificato. Viene utilizzato un sonicatore da bagno funzionante a 23 °C.
  2. Aminosilanizzazione
    NOTA: Questo passaggio mira a collegare covalentemente l'aminosilano alla superficie pulita del vetrino e del coprifoglio. MPEG funzionalizzato e biotina-PEG si legheranno covalentemente a questa superficie nella fase successiva.
    1. Preparare una miscela di aminosilanizzazione in un matraccio pulito (punto 1.6). Preparare la soluzione mescolando metanolo (150 ml), acido acetico (7,5 ml, utilizzare pipetta di vetro) e aminosilano (2,5 ml).
    2. Mescolare delicatamente la soluzione nella cappa aspirante chimica, quindi versarla nei barattoli di vetrino e coprifoglio. Utilizzare 50 ml per i vetrini e 100 ml per le diapositive. Assicurarsi che le diapositive e i vetrini siano completamente immersi nella soluzione.
    3. Incubare per 10 minuti, quindi sonicare i barattoli per 1 minuto (la sonicazione rimuove le impurità dalla superficie) e incubare per altri 10 minuti.
    4. Smaltire la soluzione di aminosilanizzazione nel contenitore di raccolta dei rifiuti. Aggiungere metanolo ai barattoli, chiudere i barattoli con i coperchi e agitare delicatamente a mano. Smaltire il metanolo e riempire i barattoli con acqua.
    5. Riportare il flacone di aminosilano nel congelatore (-20 °C).
  3. PEGilazione
    Nota : questi passaggi descrivono la procedura PEGylation.
    1. Durante l'aminosilanizzazione, preparare il tampone di pegilazione. Pesare 84 mg di bicarbonato di sodio (NaHCO3) e aggiungerlo a 10 ml di acqua (10 mM). Inoltre, pesare mPEG e biotina-PEG e metterli da parte. Per sei vetrini e copertine, utilizzare 96 mg di mPEG e 1,2-2,4 mg di biotina-PEG.
      NOTA: È importante non aggiungere troppa biotina-PEG poiché può aumentare il numero di macchie sullo sfondo. Non sciogliere la miscela PEG fino a poco prima dell'applicazione sui vetrini.
    2. Risciacquare i vetrini con acqua, asciugarli con un leggero colpo d'aria, quindi posizionarli nelle scatole di assemblaggio umidificate.
      NOTA: È essenziale utilizzare una compagnia aerea pulita. Evitare l'uso di aria compressa in scatola, che può lasciare residui sul vetro.
    3. Aggiungere il tampone di pegilazione alla miscela di polvere PEG e pipettare delicatamente su e giù più volte per sciogliere. Aggiungere 55 μL di tampone di pegilazione per vetrino (per sei vetrini, aggiungere 330 μL di tampone di pegilazione).
    4. Centrifugare a 9.600 x g per 1 minuto a 23 °C per precipitare le particelle non disciolte. Raccogliere il surnatante da utilizzare nel passaggio successivo.
      NOTA: La biotina-PEG si idrolizza rapidamente grazie alla presenza del gruppo NHS. È importante eseguire rapidamente le fasi di miscelazione e centrifugazione.
    5. Applicare 60 μL di soluzione di PEGilazione su ciascun vetrino e quindi posizionare il vetrino di copertura sopra in modo che la soluzione di PEGilazione sia inserita tra il vetrino e il vetrino.
      NOTA: Evitare di introdurre bolle tra la slitta e il coprivetrino, in quanto ciò ridurrebbe l'efficienza di passivazione. Rimuovere eventuali bolle regolando il coprivetrino e la slitta con una punta a pipetta.
    6. Posiziona le diapositive in un cassetto piatto e scuro. Le diapositive possono essere memorizzate durante la notte; Tuttavia, l'incubazione per 4-6 ore si traduce in una passivazione ottimale.
      NOTA: È essenziale ricordare quale lato è pegilato.
    7. Segnare il lato non pegilato prima di riporlo. Dopo l'incubazione, smontare delicatamente e sciacquare accuratamente i vetrini e i coperchi con acqua
    8. Asciugare i vetrini e i coperchi soffiando aria. Tenere i vetrini e i vetrini in un tubo sterile (50 ml), con la superficie PEGilata rivolta l'una verso l'altra. Conservare a -20 °C fino al giorno dell'esperimento.
      NOTA: è meglio usare vetrini e copertine entro 4 settimane dalla preparazione. Le superfici PEGilate devono essere rivolte l'una verso l'altra. Conservare i vetrini e le vetrine PEGilate in sacchetti sigillati sottovuoto può aumentarne la durata.

2. Espressione di mGluR2 con amminoacido innaturale incorporato, etichettatura fluorescente ed estrazione

NOTA: Questo protocollo delinea la preparazione, i reagenti e il trattamento delle cellule per esprimere mGluR2 contenenti la UAA 4-azido-L-fenilalanina (AZP). La procedura è per le cellule HEK293T cresciute su vetrini da 18 mm. La procedura può essere scalata in base alle esigenze.

  1. Semina
    NOTA: Mantenere le cellule HEK293T in DMEM integrate con siero bovino fetale al 10% (v/v), 100 unità·mL−1 penicillina-streptomicina e 15 mM tampone HEPES (Supplementary File 1) (pH 7,4) a 37 °C sotto il 5% di CO2.
    1. Far passare le cellule con tripsina-EDTA allo 0,05%. Seminare le cellule HEK293T su vetrini di poli-L / D-lisina (PLL / PDL) in modo che raggiungano il ≥80% di confluenza durante il periodo di trasfezione.
  2. Trasfezione
    1. Preparare una soluzione madre di 40 mM di AZP in 0,1 M NaOH.
    2. Preparare i terreni integrati con AZP per la crescita delle cellule e l'espressione di mGluR2. Integrare i mezzi standard (+ FBS, penna/streptococco, 15 mM HEPES) utilizzando la soluzione madre AZP da 40 mM. Portare la concentrazione finale di AZP a 0,6 mM. Aggiungere 1 M di soluzione HEPES (metà del volume di 40 mM di soluzione madre AZP aggiunta). Ad esempio, per preparare 10 ml di mezzi integrati con AZP, combinare 9,775 ml di terreno standard, 150 μL di soluzione madre AZP da 40 mM e 75 μL di soluzione HEPES da 1 M.
    3. Filtrare (sterilizzare) il fluido utilizzando un filtro a siringa (0,2 μm, PES).
    4. Sostituire i supporti standard con supporti contenenti supporti integrati con AZP prima della trasfezione.
      NOTA: Fare attenzione a non asciugare le cellule durante la sostituzione del supporto.
    5. Trasfettare le celle con reagente di trasfezione (Table of Materials) seguendo il manuale del produttore. Transfettare le cellule HEK293T su un coprivetrino di 18 mm utilizzando un totale di 2 μg di DNA (1000 ng di tRNA/sintetasi + 1000 ng di plasmide proteico contenente codone ambrato). Fare riferimento alla Tabella 1 per la concentrazione e il volume dei componenti utilizzati.
    6. Cambiare il terreno 24 ore dopo la trasfezione in nuovi terreni integrati con AZP e lasciare che le cellule crescano per altre 24 ore.
  3. Etichettatura con coloranti alchinicianici
    1. 20 minuti prima dell'etichettatura, lavare due volte i vetrini con tampone di registrazione (RB) caldo (37 °C) (file supplementare 1) e spostarli su supporti standard caldi (37 °C) senza AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
    2. Preparare la soluzione di etichettatura contenente Cy3-alchini, Cy5-alchini, BTTES, solfato di rame (II) (CuSO4), L-ascorbato di sodio (+) e aminoguanidina.
    3. Seguire l'ordine di produzione e aggiunta delle soluzioni (Tabella 2):
      1. Preparare 50 mM BTTES.
      2. Preparare 100 mM di aminoguanidina.
      3. Preparare 100 mM di Na-ascorbato.
      4. Preparare 655,5 μL di RB.
      5. Aggiungere il colorante alchino Cy3/Cy5 (10 mM in stock DMSO) al RB.
        NOTA: aggiungere aminoguanidina al RB.
      6. Preparare 20 mM CuSO4.
      7. Mescolare CuSO4 e BTTES in un nuovo tubo (la soluzione diventerà blu).
      8. Aggiungere la miscela CuSO4 e BTTES a RB (2.3.3.6).
      9. Aggiungere il Na-Ascorbate.
      10. Seguire il volume indicato nella tabella 2 qui di seguito per una copertina di 18 mm.
    4. Mescolare accuratamente la soluzione e incubare su ghiaccio e al buio per 10 minuti prima di etichettare le cellule.
    5. Prima di aggiungere la soluzione di etichettatura ai vetrini, rimuovere il supporto e lavarli con RB. Aggiungere la soluzione di etichettatura e incubare per 15 minuti a 37 °C in condizioni di oscurità.
    6. NOTA: Per migliorare l'etichettatura, aggiungere glutammato (concentrazione finale ~ 0,5 mM) dopo 10 minuti e incubare per altri 5 minuti. Il rame è molto tossico per le cellule e la reazione di etichettatura non dovrebbe continuare per più di 15 minuti in vivo. Preparare tutti i componenti freschi. Aggiungi Na-Ascorbate per ultimo. Mantenere la reazione a 4°C durante la preparazione. Tuttavia, dopo l'aggiunta della soluzione di etichettatura, le celle devono essere conservate a 37 °C all'interno dell'incubatore.
  4. Raccolta delle cellule ed estrazione delle proteine (lisi cellulare)
    1. Rimuovere la soluzione di etichettatura e lavare due volte con il RB il coprislip (18 mm) contenente le celle trasfettate mGluR2.
    2. Utilizzando un pipet, lavare le cellule dal vetrino di copertura e risospendere in RB (1 mL).
      NOTA: ridurre al minimo l'esposizione del campione alla luce il più possibile dopo questo punto.
    3. Pellettare le cellule ruotando a 1.000 x g a 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 80-130 μL della soluzione di lisi.
      NOTA: Il pellet cellulare deve essere visibile ad occhio. Il volume di lisi dipende dalla quantità di campione perso durante il processo di etichettatura e lavaggio.
    4. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio per rompere il pellet. Avvolgere in un foglio di alluminio e disporre sul bilanciere a 4 °C per 0,5-1 h per lisare le cellule.
    5. Pellettare la frazione insolubile mediante centrifugazione a 20.000 x g e 4 °C per 20 min. Trasferire il surnatante in un tubo freddo fresco (la proteina lisata che contiene la proteina fluorescente di interesse) e conservarlo su ghiaccio per esperimenti.

3. Assemblaggio e funzionalizzazione della camera di flusso a singola molecola

  1. Rimuovere il vetrino e il coprivetrino dal congelatore e lasciarli riscaldare a RT al buio (~30 min).
  2. Assemblare la camera utilizzando nastro biadesivo inserendo strisce di nastro biadesivo tra la slitta e la vetrina. Assicurarsi che le superfici PEGilate formino l'interno della camera di flusso.
  3. Utilizzando una punta per pipetta, premere il coprislip per assicurarsi che il nastro sia a contatto completo sia con il coprislip che con il vetrino; Fare attenzione a non rompere il coprifoglio. Applicare resina epossidica ai bordi delle diapositive.
    NOTA: Non aggiungere così tanto che la resina epossidica riempia i fori praticati.
  4. Posizionare la camera di flusso con il lato del coperchio rivolto verso il basso in una scatola scura umidificata per consentire alla resina epossidica di asciugarsi (~ 30 min).
    NOTA: Aggiungere tampone T50 (file supplementare 1) attraverso i fori praticati per evitare che la resina epossidica copra i fori (10-15 μL) durante il periodo di asciugatura.
  5. Incubare ogni corsia della camera con 500 nM Neutravidina (diluita in T50) applicando lentamente ~40 μL a ciascuna corsia.
  6. Incubare a RT per 2 minuti all'interno di una scatola scura umidificata. Lavare con ~100 μL di tampone T50 per corsia.
  7. Incubare ogni corsia camerale con l'anticorpo 20 nM biotinilato11. La scelta dell'anticorpo dipende dal tag sulla proteina.
    NOTA: Se l'anticorpo primario non è biotinilato, prima incubare con l'anticorpo secondario biotinilato per 30 minuti e poi incubare con l'anticorpo primario.
  8. Incubare a RT per 30 minuti all'interno di una scatola scura umidificata. Lavare con ~200 μL di T50 per corsia.
    NOTA: Assicurarsi che le corsie non si asciughino mai durante il processo di preparazione.

4. Tamponi a singola molecola

  1. Tampone Trolox
    NOTA: il buffer Trolox è il buffer iniziale per creare un buffer di imaging. I componenti del tampone dipendono dall'esperimento e possono variare a seconda della proteina di interesse. Il tampone utilizzato nel protocollo qui descritto include sali (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2), agente tampone (HEPES) e Trolox (pH ~ 7,35).
    1. Sciogliere 9-10 mg di Trolox in 10 mL di tampone di registrazione a singola molecola (SRB, File supplementare 1)
      NOTA: Trolox rende il tampone leggermente acido. Regolare il pH in questa fase utilizzando una soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 10 M (pH 7,35). La regolazione fine del pH verrà effettuata dopo che Trolox è completamente sciolto; tuttavia, aumentando il pH a questo punto aumenta la solubilità del Trolox.
    2. Mescolare la soluzione a RT utilizzando un bilanciere da banco per 4-8 ore (avvolto in un foglio di alluminio) per sciogliere completamente il Trolox.
    3. Controllare il pH e regolare se necessario.
    4. Assicurarsi che il Trolox sia completamente sciolto. Sterilizzare la soluzione con un filtro a siringa e conservare a 4 °C.
      NOTA: Il tampone deve essere utilizzato dopo 2-10 giorni di invecchiamento. Trolox aiuta a sopprimere il battito delle palpebre ed è comunemente usato negli studi su singole molecole17. Le proprietà anti-blinking derivano da un derivato ossidato di Trolox18; quindi, si consiglia di tenerlo a RT per almeno alcune ore per maturare. Inoltre, la radiazione UV della soluzione fresca di Trolox accelera il processo di ossidazione e può essere utilizzata per accelerare l'"invecchiamento" del tampone Trolox18.
  2. Ricetta tampone di imaging: mescolare tampone Trolox + detergente (~2 volte il valore CMC del detergente) + 4 mM di acido protocatechuico (PCA).
    NOTA: La concentrazione del detergente viene mantenuta vicino a CMC poiché alte concentrazioni di detergente possono comportare una maggiore denaturazione delle proteine. Ad esempio, la seguente miscela può essere utilizzata 955 μL di Trolox + 5 μL 10% DDM + colesterolo (W%, 10:1) + 40 μL di 100 mM di soluzione madre PCA. Qui, PCA agisce come agente antiossidante ed è stato precedentemente utilizzato negli studi smFRET19. Il DDM non è ionico, è comunemente usato per solubilizzare le proteine di membrana20,21 ed è stato utilizzato in studi su singole molecole. DDM è un buon detergente di prima scelta; Tuttavia, consigliamo di testare più detergenti e di assicurarsi che i risultati siano coerenti.

5. Configurazione del microscopio e acquisizione dati smFRET

  1. Accendere il computer e il microscopio. Accendere i laser per riscaldarsi (532 nm per l'eccitazione Cy3 e 640 nm per l'eccitazione Cy5).
    NOTA: Qui è stato utilizzato un microscopio invertito dotato di un obiettivo TIRF 100x (N.A. 1.49), splitter di immagini e fotocamera EMCCD. La configurazione è dotata di un combinatore laser a quattro linee, uno specchio dicroico, un filtro di emissione a passaggio lungo, un filtro dicroico di emissione e un filtro notch.
  2. Accendere la videocamera EMCCD e aprire il software della fotocamera. Attendere 20 minuti affinché la fotocamera raggiunga -69 °C e stabilizzi.
  3. Montare la camera del campione sul palco del microscopio. Aggiungere gradualmente il campione proteico per ottenere ~ 400 molecole per campo visivo (passo 2.4.5). Lavare la camera con 100 μL di tampone di imaging.
  4. Regolare il guadagno, la velocità di acquisizione e le potenze del laser in modo tale che i segnali di fluorescenza a singola molecola vengano rilevati sia nel canale donatore che in quello accettore. Se necessario, regolare la concentrazione delle proteine all'interno della camera del campione.
    NOTA: Con più di 400 molecole nel campo visivo, distinguere le singole molecole diventa più difficile e il rumore di fondo sarà più alto.
  5. Eccitare il donatore e acquisire tracce temporali fino a quando almeno l'80% delle molecole donatrici nel campo visivo sono fotosbiancate.
  6. Alla fine del film, accendere il laser a 640 nm per eccitare direttamente l'accettore fino a quando alcune delle molecole accettori non fotosbiancano, facilitando la discriminazione di singole molecole da multimeri.
  7. Passare a un campo visivo diverso e ripetere i passaggi precedenti per raccogliere almeno tre filmati (repliche tecniche) per condizione.
    NOTA: utilizzare la potenza laser più bassa possibile durante la selezione di una nuova regione di interesse (ROI) e la messa a fuoco per ridurre al minimo il fotosbiancamento. Prestare attenzione alla deriva del palcoscenico durante l'acquisizione. Se si osserva una deriva evidente dopo il passaggio a un nuovo ROI, attendere 3 minuti prima di iniziare l'acquisizione.

6. Analisi dei dati

  1. Allineamento dei canali donatore e accettore (mappatura dei filmati)
    1. Registrare le immagini delle sfere fluorescenti nei canali donatore e accettore.
    2. Generare il file di mappatura utilizzando i dati del bead per correlare la fluorescenza del donatore e dell'accettore da ciascuna molecola22,23.
      NOTA: Il segnale di emissione da una singola molecola viene suddiviso in segnali donatori e accettori dal filtro dicroico di emissione all'interno dello splitter di immagine. Le immagini del donatore e dell'accettore vengono proiettate sulla fotocamera fianco a fianco. Per associare con precisione le intensità del donatore e dell'accettore di una singola molecola tra le due aree, viene spesso generato un file di mappatura utilizzando campioni di perline fluorescenti. Utilizzando questo file di mappatura, tutte le molecole rilevate nei canali donatore e accettore vengono mappate l'una sull'altra. L'analisi genera quindi le tracce temporali, che sono le intensità del donatore e dell'accettore nel tempo, per ogni molecola.
  2. Selezione di tracce FRET a singola molecola (particle picking)
    NOTA: Le singole tracce di particelle vengono esaminate e selezionate per l'analisi a valle utilizzando MATLAB. I criteri di selezione esatti dipendono dal sistema. Le linee guida generali su ciò che costituisce una particella di qualità sono delineate qui. Tutti i codici personalizzati sono disponibili su GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Seleziona le tracce in cui l'intensità totale delle tracce (donatore + accettore) è stabile nel tempo. Selezionare le tracce con variazioni anti-correlate nelle intensità del donatore e dell'accettore.
    2. Selezionare le molecole donatrice e accettore che mostrano il fotosbiancamento in un'unica fase. Selezionare le tracce lunghe >5 s.
      NOTA: lo sfondo in ciascun canale dopo lo sbiancamento dovrebbe andare a zero. Le tracce non dovrebbero avere molti eventi lampeggianti; Ciò aumenterà la difficoltà di analisi.
    3. Calcolare l'efficienza FRET usando l'equazione E = (I A− 0,088 × I D)/(I D + [I A− 0,088 × I D])24,25,26, dove I D e I A sono rispettivamente le intensità grezze del donatore e dell'accettore.
      NOTA: La perdita di emissione del donatore nel canale accettore viene determinata utilizzando un campione marcato solo con donatore eccitato utilizzando un laser26 a 532 nm. Il fattore di correzione delle perdite, 0,088, può variare per diverse configurazioni a seconda dei set di filtri utilizzati. È importante notare che la conversione quantitativa e robusta delle efficienze FRET in distanze assolute richiede la correzione delle intensità del donatore e dell'accettore per molteplici fattori ed è stata ampiamente discussa primadel punto 27.
  3. Identificare lo stato conformazionale mediante Hidden Markov Modeling (HMM)
    1. Eseguire il programma vbFRET28 in MATLAB e importare le tracce selezionate per una determinata condizione. Impostare i vincoli per il numero di stati potenziali e iterazioni da eseguire.
      NOTA: Sulla base dei dati grezzi dei risultati rappresentativi, è stato ipotizzato che ci fossero fino a quattro stati FRET discreti occupati dal sensore conformazionale; Pertanto, è stata designata una gamma da uno a quattro stati. I miglioramenti nel fitting erano precedentemente determinati per aumentare in modo trascurabile con >25 iterazioni; Pertanto, sono state utilizzate 25 iterazioni per adattare i dati rappresentativi.
    2. Analizzare le tracce smFRET ed esportare le tracce idealizzate e la sessione di analisi. Salvare le tracce idealizzate in una cartella separata per l'analisi a valle.
      NOTA: I programmi utilizzati per estrarre i dati di transizione di stato e di permanenza da tracce idealizzate sono stati resi disponibili nel lavoro29 precedentemente pubblicato.
    3. Utilizzando i programmi MATLAB, estrarre le transizioni di stato e tracciarle come una mappa di calore con la coordinata X che indica la conformazione iniziale e la coordinata Y che indica la conformazione finale.
      NOTA: le transizioni sono definite come variazioni del valore FRET >0,1 nei risultati rappresentativi discussi qui. La soglia per le transizioni dipende dagli stati conformazionali ipotizzati che una proteina di interesse occupa (impostare la soglia di transizione per essere inferiore alla differenza tra gli stati FRET più vicini), nonché dalla risoluzione consentita dal setup sperimentale. L'esame delle mappe di calore per molteplici condizioni consente l'identificazione degli stati conformazionali più comuni che un sensore attraversa e, quindi, occupa. Quattro stati FRET sono stati identificati per i risultati rappresentativi (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 e 0,89).
    4. Utilizzando i programmi MATLAB, estrarre i tempi di permanenza per ogni stato conformazionale identificato. Designare un intervallo di valori FRET che delineano ogni stato e risoluzione temporale durante l'acquisizione dei dati. Gli intervalli FRET sono equamente divisi per stati FRET adiacenti. Esportare i tempi di permanenza per determinate condizioni di trattamento.
      NOTA: nella maggior parte dei casi, i dati del tempo di permanenza possono essere stimati bene da una singola funzione di decadimento esponenziale. Questa analisi può essere eseguita in un software di analisi dei dati e grafica.
  4. Adattamento gaussiano degli istogrammi della popolazione smFRET per quantificare l'occupazione statale
    1. Importa istogrammi FRET della popolazione per le condizioni di interesse nel software di analisi dei dati e grafici per l'analisi di più picchi di adattamento.
    2. Indicare il numero di picchi presenti (quattro picchi o stati basati sull'analisi HMM). Il fitting è stato eseguito utilizzando più distribuzioni gaussiane30 definite come figure-protocol-1, dove A è l'area del picco, xc è il centro del picco e w è la larghezza del picco per ogni picco.
    3. Vincolate i parametri di raccordo come A > 0, xc = FRET ± 0,02 e 0,1 ≤w≤ 0,24. Quattro picchi FRET per istogrammi FRET di popolazione individuale sono stati inseriti contemporaneamente. Applicare i vincoli definiti per i raccordi di tutte le condizioni.
    4. Calcola lo stato di occupazione (percentuale) come area di picco di interesse divisa per l'area totale, definita come la somma di tutti i picchi.

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Risultati

Espressione ed etichettatura fluorescente di sensori FRET basati su UAA
Quivengono discussi i risultati esemplari dell'inserimento e dell'etichettatura fluorescente di una UAA (AZP) all'interno del CRD di mGluR2 (548UAA). Come accennato in precedenza, per inserire AZP in mGluR2, è necessaria la co-espressione del macchinario traslazionale ingegnerizzato, che include una tRNA sintetasi modificata e tRNA complementare (pIRE4-Azi), e mGluR2 contenente un codone ambrato in posizion...

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Discussione

I GPCR sono proteine che operano sulla membrana cellulare per avviare la trasduzione del segnale. Molti GPCR sono costituiti da più domini, con la segnalazione dipendente dall'interazione cooperativa tra i domini. Per modulare le proprietà di questi recettori di membrana, è essenziale comprendere il comportamento dinamico dei molteplici domini. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica di fluorescenza che consente la misurazione della conformazione e della dinamica...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio Reza Vafabakhsh per le discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione R01GM140272 del National Institutes of Health (a R.V.), dal Searle Leadership Fund for the Life Sciences della Northwestern University e dal Chicago Biomedical Consortium con il supporto dei Searle Funds del Chicago Community Trust (a R.V.). B.W.L. è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(+)-Sodio L-AscorbatoSigma AldrichCat # 11140-250G
4-azido-L-fenilalaninaChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021Costrutto trasfettato
Acido aceticoFisher Chemical64-19-7
AcetoneFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Software, algoritmo
Aminoguanidina (cloridrato)Cayman Chemical81530
AminosilanoAldrich919-30-2
Bagno Sonicatore 2,8 LFisher ScientificBagno a ultrasuoni 2,8 L
Biotina-PEGLaysan BioInc Articolo# Biotina-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Strumenti chimici1237-500
Solfato di rame (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
Vetrino coprioggettiVWR16004-306Camera del campione
Cy3 AlkyneClick Strumenti chimiciTA117-5
Cy5 AlkyneClick Strumenti chimiciTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GMDetergente
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 MLDetergente con coleccerolo
Definito Siero fetale bovinoThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635Filtro SemrockNotch
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDAndorDU-897UTelecamera
ET542lpChromaFiltro di emissione passa-lungo
FF640-FDi01dicroico di emissioneSemrock
Anticorpo FLAG-tag GenscriptA01429
Perlina fluorescenteInvitrogen T7279Microsfere TetraSpeckPerlina sferica
VetriniFisherfinestdi campionamento12-544-4
GlutammatoSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Linea cellulare
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Splitter di immaginiOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxiusCombinatore laser a 4 linee
Lipofectamine 3000 Reagente di trasfezioneThermo Fisher ScientificL3000015Reagente di trasfezione
MetanoloFisher Chemical67-56-1
MicroscopioOlympusOlympus IX83
Milli-Q acquaBarnsteadDeionizzatore d'acqua
m-PEGLaysan Bio IncArticolo# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635dicroicoSemrock
OptiMEMThermo Fisher Scientific 51985091Siero ridotto Medium
OptiMEM/Siero ridottoMedium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Software di analisi dei dati e grafici
Penicillina-StreptomicinaGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlasmide # 105829Costrutto trasfettato
Poli-L-lisina bromidratoSigma AldrichCat # P2636
Acido protocatechico (PCA)Gruppo HWI99-50-3
smCamera (Versione 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera software
Bicarbonato di sodioFisherBioReagents144-55-8
Idrossido di sodio (NaOH)Sigma1310-73-2
Filtro siringaWhatman UNIFLOCat#9914-2502Filtrazione di liquidi
TroloxSigma53188-07
Filtro camera Specchio

Riferimenti

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