Method Article

Visualizzazione della dinamica conformazionale dei recettori di membrana utilizzando FRET a singola molecola

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta una procedura dettagliata per eseguire esperimenti di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) sui recettori accoppiati a proteine G (GPCR) utilizzando la marcatura sito-specifica tramite incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA). Il protocollo fornisce una guida passo-passo per la preparazione dei campioni smFRET, gli esperimenti e l'analisi dei dati.

Abstract

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La capacità delle cellule di rispondere ai segnali esterni è essenziale per lo sviluppo, la crescita e la sopravvivenza cellulare. Per rispondere a un segnale proveniente dall'ambiente, una cellula deve essere in grado di riconoscerlo ed elaborarlo. Questo compito si basa principalmente sulla funzione dei recettori di membrana, il cui ruolo è quello di convertire i segnali nel linguaggio biochimico della cellula. I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande famiglia di proteine recettoriali di membrana nell'uomo. Tra i GPCR, i recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono una sottoclasse unica che funziona come dimeri obbligati e possiede un ampio dominio extracellulare che contiene il sito di legame del ligando. I recenti progressi negli studi strutturali dei mGluR hanno migliorato la comprensione del loro processo di attivazione. Tuttavia, la propagazione di cambiamenti conformazionali su larga scala attraverso mGluR durante l'attivazione e la modulazione è poco conosciuta. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica potente per visualizzare e quantificare la dinamica strutturale delle biomolecole a livello di singola proteina. Per visualizzare il processo dinamico di attivazione di mGluR2, sono stati sviluppati sensori conformazionali fluorescenti basati sull'incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA) che hanno permesso la marcatura proteica sito-specifica senza perturbazioni della struttura nativa dei recettori. Il protocollo qui descritto spiega come eseguire questi esperimenti, incluso il nuovo approccio di etichettatura UAA, la preparazione del campione e l'acquisizione e l'analisi dei dati smFRET. Queste strategie sono generalizzabili e possono essere estese per studiare le dinamiche conformazionali di una varietà di proteine di membrana.

Introduction

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Il trasferimento di informazioni attraverso la membrana plasmatica dipende fortemente dalla funzione dei recettori di membrana1. Il legame del ligando a un recettore porta a un cambiamento conformazionale e all'attivazione del recettore. Questo processo è spesso di natura allosterica2. Con oltre 800 membri, i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono la più grande famiglia di recettori di membrana nell'uomo3. A causa del loro ruolo in quasi tutti i processi cellulari, i GPCR sono diventati obiettivi importanti per lo sviluppo terapeutico. Nel modello canonico di segnalazione GPCR, l'attivazion....

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Protocol

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Il flusso di lavoro complessivo del protocollo è descritto nella Figura 1.

1. Preparazione della camera di campionamento

  1. Pulizia vetrini e coprivetrini
    NOTA: Questi passaggi mirano a pulire le superfici dei vetrini e dei vetrini e prepararli per l'aminosilanizzazione. Un requisito critico per condurre esperimenti di fluorescenza a singola molecola su molecole legate alla superficie è una superficie passivata. La tecnica di passivazione più affidabile e riproducibile consiste nell'attaccare covalentemente catene polimeriche inerti alla superficie del vetro come uno strato denso. Il glicole polie....

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Results

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Espressione ed etichettatura fluorescente di sensori FRET basati su UAA
Quivengono discussi i risultati esemplari dell'inserimento e dell'etichettatura fluorescente di una UAA (AZP) all'interno del CRD di mGluR2 (548UAA). Come accennato in precedenza, per inserire AZP in mGluR2, è necessaria la co-espressione del macchinario traslazionale ingegnerizzato, che include una tRNA sintetasi modificata e tRNA complementare (pIRE4-Azi), e mGluR2 contenente un codone ambrato in posizion.......

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Discussion

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I GPCR sono proteine che operano sulla membrana cellulare per avviare la trasduzione del segnale. Molti GPCR sono costituiti da più domini, con la segnalazione dipendente dall'interazione cooperativa tra i domini. Per modulare le proprietà di questi recettori di membrana, è essenziale comprendere il comportamento dinamico dei molteplici domini. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica di fluorescenza che consente la misurazione della conformazione e della dinamica.......

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Disclosures

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgements

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Ringraziamo i membri del laboratorio Reza Vafabakhsh per le discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione R01GM140272 del National Institutes of Health (a R.V.), dal Searle Leadership Fund for the Life Sciences della Northwestern University e dal Chicago Biomedical Consortium con il supporto dei Searle Funds del Chicago Community Trust (a R.V.). B.W.L. è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-Sodio L-AscorbatoSigma AldrichCat # 11140-250G
4-azido-L-fenilalaninaChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021Costrutto trasfettato
Acido aceticoFisher Chemical64-19-7
AcetoneFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Software, algoritmo
Aminoguanidina (cloridrato)Cayman Chemical81530
AminosilanoAldrich919-30-2
Bagno Sonicatore 2,8 LFisher ScientificBagno a ultrasuoni 2,8 L
Biotina-PEGLaysan BioInc Articolo# Biotina-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Strumenti chimici1237-500
Solfato di rame (II)Sigma AldrichCat # 451657-10G
Vetrino coprioggettiVWR16004-306Camera del campione
Cy3 AlkyneClick Strumenti chimiciTA117-5
Cy5 AlkyneClick Strumenti chimiciTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GMDetergente
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 MLDetergente con coleccerolo
Definito Siero fetale bovinoThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635Filtro SemrockNotch
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDAndorDU-897UTelecamera
ET542lpChromaFiltro di emissione passa-lungo
FF640-FDi01dicroico di emissioneSemrock
Anticorpo FLAG-tag GenscriptA01429
Perlina fluorescenteInvitrogen T7279Microsfere TetraSpeckPerlina sferica
VetriniFisherfinestdi campionamento12-544-4
GlutammatoSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Linea cellulare
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Splitter di immaginiOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxiusCombinatore laser a 4 linee
Lipofectamine 3000 Reagente di trasfezioneThermo Fisher ScientificL3000015Reagente di trasfezione
MetanoloFisher Chemical67-56-1
MicroscopioOlympusOlympus IX83
Milli-Q acquaBarnsteadDeionizzatore d'acqua
m-PEGLaysan Bio IncArticolo# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635dicroicoSemrock
OptiMEMThermo Fisher Scientific 51985091Siero ridotto Medium
OptiMEM/Siero ridottoMedium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Software di analisi dei dati e grafici
Penicillina-StreptomicinaGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlasmide # 105829Costrutto trasfettato
Poli-L-lisina bromidratoSigma AldrichCat # P2636
Acido protocatechico (PCA)Gruppo HWI99-50-3
smCamera (Versione 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Camera software
Bicarbonato di sodioFisherBioReagents144-55-8
Idrossido di sodio (NaOH)Sigma1310-73-2
Filtro siringaWhatman UNIFLOCat#9914-2502Filtrazione di liquidi
TroloxSigma53188-07
Filtro camera Specchio

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, ....

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Tags

Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

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