Method Article

Sviluppo e test di dipeptidi nanostrutturati metilati che inibiscono l'attività della chinasi Src in vitro per applicazioni antitumorali

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene presentato un protocollo per la progettazione e il test di dipeptidi in grado di inibire l'attività dell'enzima chinasi Src utilizzando saggi acellulari e cellulari per applicazioni antitumorali. I peptidi qui formulati (W-RCH3, WCH3-R CH3 e W-R(CH3)2) hanno inibito la chinasi Src con valori IC50 rispettivamente di 510 nM, 916 nM e 1 μM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, con l'obiettivo di sviluppare un nuovo trattamento antitumorale, sono stati progettati sette dipeptidi che contenevano triptofano metilato e/o arginina metilata e sono stati prodotti utilizzando la sintesi di peptidi in fase solida Fmoc. La sovraespressione dell'enzima tirosin-chinasi Src è stata implicata nello sviluppo di diversi tumori. I dipeptidi contenenti aminoacidi innaturali come l'arginina metilata (RCH3), l'arginina dimetilata (R(CH3)2) e/o i residui di triptofano metilato (WCH3) hanno precedentemente dimostrato di inibire la chinasi Src. In questo studio, tre di questi dipeptidi, WRCH3, WCH3-R CH3 e WR(CH3)2, sono stati testati utilizzando saggi acellulari e sono risultati avere valori IC50 (la concentrazione alla quale si verifica l'inibizione del 50%) rispettivamente di 510 nM, 916 nM e 1 μM. Questi valori erano paragonabili a quelli ottenuti per i peptidi penta- o nano-W-R ciclici ([W-R]5-[W-R]9) sintetizzati in studi precedenti. Tuttavia, le versioni non metilate dei dipeptidi non hanno mostrato alcuna attività inibitoria contro la chinasi Src. Tutti questi dipeptidi (50 μM) non hanno mostrato alcuna citotossicità dopo l'incubazione fino a 72 ore con tre diverse linee cellulari tumorali, tra cui la leucemia (CCRF-CEM), l'adenocarcinoma mammario (MDA-MB-231) e le linee cellulari di adenocarcinoma ovarico (SK-OV-3), indicando la limitata permeabilità dei peptidi attraverso la membrana cellulare. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per migliorare la permeabilità di questi peptidi per applicazioni antitumorali, ad esempio utilizzando un vettore peptidico o un'ulteriore funzionalizzazione peptidica. In sintesi, questo studio fornisce un protocollo per sintetizzare e testare peptidi che inibiscono l'attività della chinasi Src e quindi possiedono una promettente capacità antitumorale, come dimostrato utilizzando saggi acellulari e cellulari.

Introduction

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Il cancro è causato dalla crescita anormale di cellule normali ed è una delle malattie più letali in tutto il mondo. Queste cellule anormali si diffondono in diversi organi del corpo attraverso un processo chiamato metastasi. La forma più comune di cancro è il cancro al seno, che si è verificato in 2,26 milioni di persone nel 2020. Inoltre, nel 2020 ci sono stati circa 1,80 milioni di decessi dovuti al cancro ai polmoni1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, nel 2020 circa 10 milioni di persone sono morte di cancro2 milioni di persone. Le cellule tumorali differiscono dalle cellule normali in quanto sovraesprimono alcuni enzimi, come le proteine tirosin-chinasi (PTK). Il National Cancer Institute definisce le chinasi come enzimi in grado di fosforilare altre proteine o zuccheri3. La conoscenza della funzione regolatoria delle chinasi può facilitare la progettazione di farmaci antitumorali efficaci. Ad esempio, i PTK catalizzano la fosforilazione di altre proteine o zuccheri e, di conseguenza, l'ATP viene convertito in ADP dalla perdita di un gruppo fosfato. Un totale dell'80% degli oncogeni e protooncogeni codifica per PTKs4. Le Src chinasi sono una famiglia di tirosin-chinasi non recettoriali, tra cui Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes e Yrk, che sono sovraespresse nelle cellule tumorali, in particolare nel carcinoma mammario 5,6. Le tirosin-chinasi Src sono associate alla mitogenesi, al differenziamento, all'attivazione delle cellule T e alla trasformazione cellulare. Src aiuta l'invasione e la metastasi delle cellule tumorali grazie alla sua capacità di ridurre l'adesione delle cellule tumorali. Ci sono cinque diversi domini nella chinasi Src, ordinati dai terminali N a C come: dominio degli acidi grassi, dominio dell'omologia Src 3 (SH3), dominio dell'omologia Src 2 (SH2), dominio della tirosin-chinasi (SH1) e dominio regolatorio C-terminale7.

figure-introduction-1
Figura 1: I domini target nell'enzima chinasi Src, inclusi un dominio SH3, un dominio SH2, un dominio chinasi (SH1) e un segmento regolatorio C-terminale corto. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Il dominio chinasico SH1 è più comunemente preso di mira quando si progettano inibitori della chinasi Src, poiché contiene due siti conservati per il legame dell'ATP e del substrato (Figura 1). Se la sequenza amminoacidica del dominio chinasico è nota, il substrato può anche essere utilizzato come bersaglio per progettare un composto che imita il legame del substrato alla chinasiSrc 8. Inoltre, altri siti, come i domini SH3 e SH2, possono essere utilizzati come destinazioni. Rispetto ad altri agenti chemioterapici, gli inibitori della chinasi mostrano una minore tossicità e una maggiore efficacia9. A partire da settembre 2021, ci sono 73 piccole molecole che agiscono come inibitori delle chinasi che sono state approvate dalla FDA10. L'imatinib è un esempio di farmaco antitumorale che inibisce selettivamente l'attività della tirosin-chinasi; Tuttavia, alcuni pazienti sono resistenti al farmaco a causa della comparsa di una mutazione puntiforme nel dominio chinasico11. AstraZeneca ha rilasciato Saracatinib, che è un farmaco che inibisce la famiglia Src delle tirosin-chinasi con un valore IC50 (la concentrazione alla quale si verifica l'inibizione del 50%) di 2,7 nM, ma è stato scartato negli studi di fase 212. Dei 52 inibitori PTK approvati dalla FDA statunitense all'inizio del 202013, solo 28 PTK bersaglio del recettore, 11 bloccano il PTK non recettoriale, 11 inibiscono le proteina-serina/treonina protein chinasi e due bloccano MEK1/213. Il crescente interesse della ricerca in oncologia continuerà ad alimentare la scoperta di inibitori delle chinasi come potenziali farmaci antitumorali. Tuttavia, finora solo 50 delle 500 protein chinasi sono state prese di mira per il trattamento; Pertanto, si prevede che un numero maggiore di chinasi sarà studiato per lo sviluppo di farmaci nel prossimo futuro14. Inoltre, c'è la necessità di scoprire inibitori della chinasi per esplorare mutazioni chinasiche non ancora identificate che portano al cancro.

Pertanto, questo studio mirava a sviluppare peptidi che potessero essere utilizzati come inibitori per la famiglia Src e colpire il sito di legame dell'ATP grazie alla sua capacità di fungere da sito conservato tra diverse chinasi. A tal fine, sono stati sintetizzati una serie di dipeptidi contenenti triptofano metilato e/o arginina metilata e testati per la loro capacità sinergica di inibire la chinasi Src. L'anello indolico del triptofano imita l'adenina dell'ATP e compete con l'ATP dal legame al sito di legame dell'ATP. Inoltre, l'arginina metilata nel ligando compete per il dominio SH3 di Src. I ricercatori hanno dimostrato che un polipeptide contenente arginina demetilata inibisce il dominio SH3, probabilmente a causa di una specifica sequenza conservata sul motivo di legame SH3 (cioè PXXP), che ha un'affinità di legame con un ligando contenente da due a tre residui di Arg nell'N-terminale o da uno a due residui di Arg sul C-terminale dei ligandi15, 16,17. Il gruppo guanidinico di Arg si lega al residuo conservato di Asp-99 del dominio SH318,19, mentre la restante porzione di Arg si lega al Trp-118 conservato dell'enzima, come confermato dall'analisi NMR e dalle strutture cristalline di diversi domini SH319. Qui viene presentato un protocollo per la sintesi di sette dipeptidi metilati e per testare la loro capacità di inibizione contro la chinasi Src. Inoltre, è stata esaminata la capacità di questi peptidi di uccidere diverse linee cellulari tumorali in vitro.

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Protocol

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1. Sintesi di peptidi

NOTA: La sintesi di W-R è descritta come un esempio rappresentativo (Figura 2).

  1. Pesare 566 mg (0,3 mmol) di resina H-Arg(Pbf)-2-clorotririle e aggiungerla al recipiente di sintesi peptidica (vedi Tabella dei materiali), secondo la procedura utilizzata da Mandal et al20. Eseguire la sintesi dei peptidi utilizzando la consolidata strategia di sintesi dei peptidi in fase solida (SPPS)21.
    NOTA: I dipeptidi metilati o dimetilati contenenti amminoacidi non naturali sono stati assemblati su una resina ammidica rink (capacità di carico di 0,3 mmol/g), mentre i dipeptidi contenenti amminoacidi naturali sono stati assemblati su una resina a cui era attaccato il primo amminoacido, come la resina H-Arg(Pbf)-2-clorotririle (capacità di carico di 0,3 mmol/g). È importante sottolineare che la resina ammidica della pista produce un peptide ricoperto da un C-terminale NH2.
  2. Gonfiare la resina secca per 1 ora in 5 mL di N,N-dimetilformammide (DMF) sotto la pressione del gas azoto collegato al recipiente del peptide.
    NOTA: Eseguire l'intero processo di sintesi in una cappa aspirante. Occhiali, guanti e un camice da laboratorio devono essere indossati durante l'esperimento. Un timer è essenziale anche per tenere traccia tra le fasi di aggiunta del reagente chimico.
  3. Rimuovere il DMF in eccesso utilizzando la pressione dell'azoto gassoso collegata al recipiente di sintesi dei peptidi durante tutto il processo di sintesi.
  4. Pesare 473,9 mg di Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 mmol) e 341 mg di 2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio esafluorofosfato (HBTU) (0,9 mmol) come reagenti di accoppiamento. Aggiungere le polveri in una provetta e scioglierle in 5 ml di DMF secco.
  5. Aggiungere 313,4 μl (1,8 mmol) di N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) come agente attivante nella provetta (passaggio 1.4) e mescolare agitando la provetta.
  6. Aggiungere il contenuto della provetta alla resina e lasciare che la reazione proceda per 1 ora sotto azoto gassoso a temperatura ambiente. Quindi, drenare il DMF in eccesso utilizzando la pressione del gas azoto e lavare la resina 3 volte con DMF.
  7. Deproteggere l'Fmoc N-terminale utilizzando 5 mL di piperidina al 20% in DMF (v/v) per 20 minuti sotto azoto gassoso. Lavare la resina 3 volte con DMF (3 x 5 mL).
  8. Asciugare la resina aggiungendo 5 mL di diclorometano (DCM) e tenerla sotto azoto gassoso per 5 minuti, quindi scaricare il DCM utilizzando la pressione dell'azoto gassoso. Aggiungere 5 ml di metanolo sotto l'azoto gassoso per 5 minuti per aumentare la secchezza della resina.
  9. Aggiungere 10 ml di un cocktail di scissione appena preparato di TFA/tioanisolo/ditiotreitolo/anisolo (90:3:5:2 v/v/w/v) per 2,5 ore per deproteggere tutte le catene laterali e scindere il dipeptide dalla resina.
    ATTENZIONE: Il cocktail di scissione deve essere aggiunto in un cilindro graduato di vetro in quanto il TFA è acido e pericoloso; Prestare attenzione quando lo si utilizza.
  10. Dopo 2,5 ore, drenare la soluzione di reazione dal recipiente peptidico utilizzando la pressione dell'azoto in un pallone a fondo rotondo. Aggiungere 250 mL di etere etilico freddo (Et2O) al pallone a fondo rotondo contenente il peptide grezzo per far precipitare il peptide.
  11. Filtrare il peptide precipitato utilizzando una carta da filtro in un imbuto conico con un braccio laterale collegato con l'acqua (in modo che la filtrazione avvenga a causa della pressione dell'acqua) e raccogliere il precipitato (i peptidi) per rimuovere completamente l'etere. Il peptide grezzo precipita entro 10 minuti.
  12. Purificare il peptide grezzo su una colonna per cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in fase inversa (vedere la tabella dei materiali) utilizzando un sistema a gradiente. Utilizzare un gradiente di acetonitrile 0%-100% contenente 0,1% TFA in acqua contenente 0,1% TFA per 30-60 minuti a una velocità di flusso di 1 mL/min.

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Figura 2: Sintesi peptidica in fase solida di W-R. Abbreviazioni: HBTU = 2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio esafluorofosfato; DIPEA = N,N-diisopropiletilamina; TFA = acido trifluoroacetico; DMF = dimetilformammide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Determinazione della tossicità cellulare dei peptidi sintetizzati

  1. Piastra 2.000 cellule/pozzetto di cellule SK-OV-3, 5.000 cellule/pozzetto di cellule MDA-MB-231 o 5 × 106 cellule/pozzetto di cellule CCRF-CEM (in un volume totale di 100 μL/pozzetto) in una micropiastra a 96 pozzetti. Incubare le cellule in un'atmosfera umidificata di CO2 al 5%, aria al 95% a 37 °C fino a raggiungere la confluenza del 75%-80%.
    NOTA: I terreni RPMI-16 vengono utilizzati per la coltura di cellule CCRF-CEM e del terreno minimo essenziale (EMEM) di Eagle per le linee cellulari MDA-MB-231 e SK-OV-3. Entrambi i terreni sono integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL di penicillina e 10 mg/mL di streptomicina in 0,9% di NaCl). Mettere tutti i terreni e gli integratori in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti prima di iniziare l'esperimento. L'esperimento deve essere eseguito con un cappuccio di biosicurezza, indossando guanti e camice da laboratorio.
  2. Aspirare il terreno utilizzando una pipetta e aggiungere 100 μL del peptide da 50 μM o della doxorubicina (Dox) da 10 μM utilizzata come controllo positivo in triplicato in pozzetti contenenti i tre diversi tipi di cellule tumorali piastrate nella piastra a 96 pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatrice per 72 ore (alle stesse condizioni menzionate al punto 2.1).
  3. Dopo 72 ore, aggiungere 20 μl di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-solfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) nella piastra a 96 pozzetti. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio e incubare la piastra per 1-4 ore a 37 °C in atmosfera umidificata.
    NOTA: MTS è un colorante utilizzato per visualizzare le cellule vive (non trattate o trattate con i peptidi), poiché solo le cellule vive convertono il tetrazolio MTS in colorante formazan colorato che può essere misurato a 490 nm.
  4. Misurare l'assorbanza del prodotto formazan a 490 nm (A490) su un lettore di micropiastre (vedi Tabella dei materiali). Includi il terreno mescolato con MTS come spazio vuoto per l'esperimento. Utilizzare solo acqua (poiché i peptidi sono solubili in acqua) e 0,1 N HCl (poiché WCH3 richiede HCl per la dissoluzione) come controlli negativi.
  5. Misurare la percentuale di sopravvivenza cellulare utilizzando la seguente equazione (Eq 1), utilizzando un foglio di calcolo (vedi Tabella dei materiali). La procedura è la stessa utilizzata da Mandal et al20.
    figure-protocol-2Eq (1)

3. Saggio dell'attività della chinasi c-Src

NOTA: Il saggio dell'attività della chinasi Src è stato eseguito utilizzando un kit di analisi commerciale (vedi Tabella dei materiali) in triplicato, secondo la procedura di Chhikara et al.22. Utilizzare WCH3 e RCH3 da soli come controlli per confrontare l'effetto del solo amminoacido metilato sulla chinasi e con un altro amminoacido metilato o non metilato.

  1. In una micropiastra nera a fondo rotondo a fondo tondo a 384 pozzetti a basso volume, aggiungere 2,5 μl del cocktail di reazione contenente 0,7 nM di dominio chinasico His 6-Src in tampone chinasi, che fa parte del kit del saggio, a 2,5 μl di peptidi prediluiti disciolti in DMSO al 10% (concentrazione target 4x). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando un agitatore per micropiastre (5 giri/min) seguendo il protocollo del produttore.
    NOTA: Il cocktail di reazione è costituito dal tampone chinasi (200 mM HEPES, pH 7,5), MgCl2 (16 mM), DMSO (4%), EGTA (8 mM), 2-mercaptoetanolo (43 mM) e Brij-35 (0,04%). Il substrato ottimale della reazione chinasica di questo esperimento è (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Aggiungere 5 μl di cocktail ATP/substrato (40 μM/600 μM) alla piastra e incubare per 30 minuti su un agitatore per micropiastre a temperatura ambiente.
  3. Nel frattempo, preparare la miscela di rilevamento ADP 1x contenente 8 nM di tracciante ADP e 10 μg/mL di anticorpo ADP2 coniugato con colorante (vedere la Tabella dei materiali) fino all'arresto e rilevare il tampone B (1x) dal kit. Arrestare la reazione chinasica (passaggio 3.2) aggiungendo 10 μl della miscela di rivelazione ADP 1x e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Misura l'intensità della fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre, con eccitazione a 580 nm, emissione a 630 nm e larghezza di banda di 10 nm. Ottenere unità di fluorescenza relative (RFU) dallo strumento per ottenere la percentuale di inibizione enzimatica, secondo l'Eq (2).
    figure-protocol-3Eq (2)
  5. Calcola il valore IC50 come elencato sul sito web della società23.

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Results

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W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 e i peptidi W-R di controllo sono stati sintetizzati utilizzando la sintesi di peptidi in fase solida Fmoc (Figura 3), con purezza rispettivamente del 95%, 98,7%, 99%, 100%, 100% e 99,5%. Le strutture chimiche di questi dipeptidi sono state confermate utilizzando ESI-MS. I valori m/z di questi dipeptidi erano rispettivamente 374,1624, 388,1949, 388,1794,...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I peptidi fabbricati e testati qui per l'inibizione della chinasi Src e la conseguente uccisione delle cellule tumorali contenevano triptofano metilato e/o arginina metilata, che sono amminoacidi innaturali. La formazione del precipitato bianco dopo l'aggiunta di etere etilico è un passaggio critico nella sintesi di questi peptidi. Tuttavia, non tutti i peptidi sintetici possono formare un precipitato; pertanto, anche quando non si forma un precipitato, il successo della sintesi peptidic...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare il Decanato della Ricerca Scientifica (DSR) presso la King Abdulaziz University (KAU), Jeddah, Arabia Saudita, che ha finanziato questo progetto con la sovvenzione n. (G: 031-130-1443).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DitiotreitoloSigma-Aldrich10708984001Sintesi di peptidi
Imbuto filtrante fritte di Aldrich per la sintesi in fase solidaSigma-AldrichZ283304Recipiente di sintesi di peptidi
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 AQueous One  Soluzione  Reagenti per il saggio di proliferazione cellulare PromegaG3582Saggio di proliferazione cellulare (reagente MTS)
Diclorometano, 99,9%, Extra DryFishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- Colonna OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 Shimadzu  (Sistema RP-HPLC)gradiente acqua/acetonitrile
IRDye QC-1 quencherBell Brook Labs, Madison, WI3013
Lettore di micropiastre SpectraMax M2eDispositivi
Microsoft Excelperfogli di calcolo
N,N-Diisopropiletilammina (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-Dimetilformammide, anidro, 99,8%FishersciAA43997M1
Piperidina 20%Sigma-Aldrich80645
Resina ammidica Rink (100-200 mesh)Sigma-Aldrich8550010025
TioanisoloSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013kit per il saggio dell'attività chinasica c-Src
molecolari Software Microsoft

References

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