Sviluppo e test di dipeptidi nanostrutturati metilati che inibiscono l'attività della chinasi Src in vitro per applicazioni antitumorali

Summary

Qui viene presentato un protocollo per la progettazione e il test di dipeptidi in grado di inibire l'attività dell'enzima chinasi Src utilizzando saggi acellulari e cellulari per applicazioni antitumorali. I peptidi qui formulati (W-R_CH3, W_{CH3-R CH3} e W-R_(CH3)2) hanno inibito la chinasi Src con valori IC₅₀ rispettivamente di 510 nM, 916 nM e 1 μM.

Abstract

Qui, con l'obiettivo di sviluppare un nuovo trattamento antitumorale, sono stati progettati sette dipeptidi che contenevano triptofano metilato e/o arginina metilata e sono stati prodotti utilizzando la sintesi di peptidi in fase solida Fmoc. La sovraespressione dell'enzima tirosin-chinasi Src è stata implicata nello sviluppo di diversi tumori. I dipeptidi contenenti aminoacidi innaturali come l'arginina metilata (R_CH3), l'arginina dimetilata (R_(CH3)2) e/o i residui di triptofano metilato (W_CH3) hanno precedentemente dimostrato di inibire la chinasi Src. In questo studio, tre di questi dipeptidi, WR_CH3, W_{CH3-R CH3} e WR_(CH3)2, sono stati testati utilizzando saggi acellulari e sono risultati avere valori IC₅₀ (la concentrazione alla quale si verifica l'inibizione del 50%) rispettivamente di 510 nM, 916 nM e 1 μM. Questi valori erano paragonabili a quelli ottenuti per i peptidi penta- o nano-W-R ciclici ([W-R]₅-[W-R]₉) sintetizzati in studi precedenti. Tuttavia, le versioni non metilate dei dipeptidi non hanno mostrato alcuna attività inibitoria contro la chinasi Src. Tutti questi dipeptidi (50 μM) non hanno mostrato alcuna citotossicità dopo l'incubazione fino a 72 ore con tre diverse linee cellulari tumorali, tra cui la leucemia (CCRF-CEM), l'adenocarcinoma mammario (MDA-MB-231) e le linee cellulari di adenocarcinoma ovarico (SK-OV-3), indicando la limitata permeabilità dei peptidi attraverso la membrana cellulare. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per migliorare la permeabilità di questi peptidi per applicazioni antitumorali, ad esempio utilizzando un vettore peptidico o un'ulteriore funzionalizzazione peptidica. In sintesi, questo studio fornisce un protocollo per sintetizzare e testare peptidi che inibiscono l'attività della chinasi Src e quindi possiedono una promettente capacità antitumorale, come dimostrato utilizzando saggi acellulari e cellulari.

Introduction

Il cancro è causato dalla crescita anormale di cellule normali ed è una delle malattie più letali in tutto il mondo. Queste cellule anormali si diffondono in diversi organi del corpo attraverso un processo chiamato metastasi. La forma più comune di cancro è il cancro al seno, che si è verificato in 2,26 milioni di persone nel 2020. Inoltre, nel 2020 ci sono stati circa 1,80 milioni di decessi dovuti al cancro ai polmoni¹. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, nel 2020 circa 10 milioni di persone sono morte di cancro^{2 milioni} di persone. Le cellule tumorali differiscono dalle cellule normali in quanto sovraespri....

Protocol

1. Sintesi di peptidi

NOTA: La sintesi di W-R è descritta come un esempio rappresentativo (Figura 2).

1. Pesare 566 mg (0,3 mmol) di resina H-Arg(Pbf)-2-clorotririle e aggiungerla al recipiente di sintesi peptidica (vedi Tabella dei materiali), secondo la procedura utilizzata da Mandal et al²⁰. Eseguire la sintesi dei peptidi utilizzando la consolidata strategia di sintesi dei peptidi in fase solida (SPPS)²¹.
   NOTA: I dipeptidi metilati o dimetilati contenenti amminoacidi non naturali sono stati assemblati su una resina....

Results

W-R_CH3, W_{CH3-R CH3}, W-R_(CH3)2, _WCH3-R, W_CH3-R(CH3)2 e i peptidi W-R di controllo sono stati sintetizzati utilizzando la sintesi di peptidi in fase solida Fmoc (Figura 3), con purezza rispettivamente del 95%, 98,7%, 99%, 100%, 100% e 99,5%. Le strutture chimiche di questi dipeptidi sono state confermate utilizzando ESI-MS. I valori m/z di questi dipeptidi erano rispettivamente 374,1624, 388,1949, 388,1794,.......

Discussion

I peptidi fabbricati e testati qui per l'inibizione della chinasi Src e la conseguente uccisione delle cellule tumorali contenevano triptofano metilato e/o arginina metilata, che sono amminoacidi innaturali. La formazione del precipitato bianco dopo l'aggiunta di etere etilico è un passaggio critico nella sintesi di questi peptidi. Tuttavia, non tutti i peptidi sintetici possono formare un precipitato; pertanto, anche quando non si forma un precipitato, il successo della sintesi peptidic.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	10708984001	Sintesi di peptidi
Imbuto filtrante fritte di Aldrich per la sintesi in fase solida	Sigma-Aldrich	Z283304	Recipiente di sintesi di peptidi
Alexa594 Tracer	Bell Brook Labs, Madison, WI	3013
Anisole	Sigma-Aldrich	8014520500
CellTiter 96 AQueous One  Soluzione  Reagenti per il saggio di proliferazione cellulare	Promega	G3582	Saggio di proliferazione cellulare (reagente MTS)
Diclorometano, 99,9%, Extra Dry	Fishersci	AC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OH	Sigma-Aldrich	8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OH	Sigma-Aldrich	8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Sigma-Aldrich	8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- Colonna OH	Sigma-Aldrich	47561-25G-F
HPLC C18	Shimadzu  (Sistema RP-HPLC)		gradiente acqua/acetonitrile
IRDye QC-1 quencher	Bell Brook Labs, Madison, WI	3013
Lettore di micropiastre SpectraMax M2e	Dispositivi
Microsoft Excel	per	fogli di calcolo
N,N-Diisopropiletilammina (DIPEA)	Sigma-Aldrich	496219
N,N-Dimetilformammide, anidro, 99,8%	Fishersci	AA43997M1
Piperidina 20%	Sigma-Aldrich	80645
Resina ammidica Rink (100-200 mesh)	Sigma-Aldrich	8550010025
Tioanisolo	Sigma-Aldrich	92358
Transcreener ADP2 FI Assay	Bell Brook Labs, Madison, WI	3013	kit per il saggio dell'attività chinasica c-Src