Misurazione della termogenesi del muscolo scheletrico in topi e ratti

Nell'ambito della ricerca metabolica, l'esame della termogenesi del muscolo scheletrico è una nuova strada promettente per sondare l'omeostasi del peso corporeo. La letteratura pubblicata supporta l'idea che le risposte termogeniche di uno dei più grandi sistemi di organi del corpo, il muscolo scheletrico, forniscano una strada per aumentare il dispendio energetico e altri effetti metabolici, riequilibrando così efficacemente i sistemi all'interno di malattie come l'obesità ^1,2,3. Se il muscolo può essere considerato un organo termogenico, gli studi devono utilizzare una metodologia pratica per studiare i cambiamenti termogenici all'interno di questo organo. Il desiderio di comprendere l'impatto endotermico dei muscoli scheletrici e l'utilità di questa metodologia per studiare la termogenesi muscolare non tremante non sono specifici degli studi metabolici. Discipline tra cui l'evoluzione⁴, la fisiologia comparata⁵ e l'ecofisiologia ^6,7 hanno mostrato un interesse acquisito nella comprensione dei modi in cui la termogenesi muscolare può contribuire all'endotermia e come questo meccanismo si adatta all'ambiente. Il protocollo presentato fornisce i metodi critici necessari per affrontare queste domande.

Il metodo fornito può essere utilizzato nella valutazione della modulazione degli stimoli sia contestuali che farmacologici della temperatura muscolare, compresa la tecnica unica di fornire odore predatore (PO) per spostare il contesto per replicare la minaccia del predatore. Rapporti precedenti hanno dimostrato la capacità di PO di indurre rapidamente un aumento considerevole della termogenesi muscolare⁸. Inoltre, gli stimoli farmacologici possono anche alterare la temperatura muscolare. Ciò è stato dimostrato nel contesto della termogenesi muscolare indotta da PO, dove il blocco farmacologico dei recettori periferici β-adrenergici, utilizzando nadololo, ha inibito la capacità di PO di indurre la termogenesi muscolare senza influenzare significativamente la termogenesi contrattile durante la camminata sul tapis roulant⁸. La somministrazione centrale di agonisti del recettore della melanocortina nei ratti è stata utilizzata anche per discernere i meccanismi cerebrali che alterano la termogenesi ^9,10.

Fornito qui è un'indagine preliminare sulla capacità del neuroormone ossitocina (Oxt) di alterare la termogenesi muscolare nei topi. Simile alla minaccia dei predatori, gli incontri sociali con un conspecifico dello stesso sesso aumentano la temperatura corporea, un fenomeno indicato come ipertermia sociale¹¹. Data la rilevanza di Oxt per il comportamento sociale¹², è stato ipotizzato che Oxt sia un mediatore dell'ipertermia sociale nei topi. Infatti, un antagonista del recettore dell'ossitocina diminuisce l'ipertermia sociale nei topi¹¹ e i cuccioli di topo privi di Oxt mostrano deficit negli aspetti comportamentali e fisiologici della termoregolazione, inclusa la termogenesi¹³. Dato che Harshaw et al. (2021) non hanno trovato prove a sostegno della termogenesi del tessuto adiposo bruno (BAT) dipendente dal recettore β3 con ipertermia sociale¹¹, è stato ipotizzato che l'ipertermia sociale possa essere guidata dall'induzione della termogenesi muscolare da parte di Oxt.

Per misurare la termogenesi del muscolo scheletrico, il seguente protocollo utilizza l'impianto di transponder IPTT-300 preprogrammati adiacenti al muscolo di interesse all'interno di un topo o ratto 8,10,14,15. Questi transponder sono microchip incapsulati in vetro che vengono letti utilizzando i corrispondenti lettori di transponder. Poca o nessuna ricerca ha utilizzato questa tecnologia in questa capacità, anche se gli studi hanno suggerito la necessità della specificità fornita da questo metodo^16,17. Precedenti indagini hanno dimostrato l'affidabilità di questo metodo e vari modi in cui i transponder di temperatura possono essere utilizzati rispetto ad altri metodi di prova della temperatura¹⁸ o in combinazione con metodi chirurgici (ad esempio, incannulamento¹⁹). Tuttavia, studi di questa natura si basano su diversi posizionamenti strategici per misurare la temperatura corporea complessiva 20,21,22 o tessuti specifici come BAT^23,24,25.

Piuttosto che misurare la temperatura da queste posizioni o durante l'utilizzo di termometri auricolari o rettali²⁶, il metodo qui descritto fornisce specificità per il muscolo di interesse. La capacità di indirizzare un sito impiantando direttamente transponder adiacenti ai muscoli di interesse è più efficace per sondare specificamente la termogenesi muscolare. Fornisce una nuova strada oltre a quelle fornite dalla termometria infrarossa superficiale ^27,28 o dalle misurazioni della temperatura cutanea tramite termocoppia ²⁹. Inoltre, i dati forniti attraverso questo metodo offrono una gamma di percorsi di ricerca, evitando la necessità di apparecchiature e software ad alta tecnologia di grandi dimensioni, costosi e ad alta tecnologia come la termografia a infrarossi^30,31,32.

Questo metodo è stato utilizzato con successo per misurare la temperatura nel quadricipite e nel gastrocnemio, unilateralmente o bilateralmente. Questo metodo è stato efficace anche in combinazione con la chirurgia stereotassica^14,15. Entro ~ 7-10 cm dall'arto del transponder, i lettori transponder portatili (DAS-8027 / DAS-7007R) vengono utilizzati per scansionare, misurare e visualizzare la temperatura. Questa distanza è stata critica e preziosa per le indagini precedenti ^8,9,10 perché riduce al minimo i potenziali fattori di stress e le variabili che alterano la temperatura come la manipolazione degli animali durante le procedure di test. Utilizzando i timer, le misurazioni possono quindi essere registrate e raccolte per un periodo di tempo senza interazione diretta con gli animali.

Per ridurre ulteriormente il disturbo dei topi durante i test, questo metodo descrive l'assemblaggio e l'uso di riser realizzati con tubazioni in PVC per dare allo sperimentatore l'accesso al fondo delle gabbie domestiche durante i test. Utilizzando i riser in tandem con il lettore digitale, le misurazioni della temperatura dell'arto del transponder possono essere effettuate senza alcuna interazione animale dopo che lo stimolo è stato posizionato. A un costo minimo, questo metodo può essere utilizzato in combinazione con stimoli farmacologici e contestuali, rendendolo abbastanza accessibile per i ricercatori. Inoltre, questo metodo può essere impiegato con un numero considerevole di soggetti (~ 16 topi o ~ 12 ratti) alla volta, risparmiando tempo nell'aumentare il throughput complessivo per qualsiasi progetto di ricerca.

Introdotto in questo metodo è un meccanismo artigianale per presentare gli odori ai topi utilizzando palline di infusore di tè in rete di acciaio inossidabile, d'ora in poi denominate "palline di tè". Sebbene queste palline di tè siano ideali per contenere qualsiasi materiale odoroso, in questi studi, gli asciugamani che sono serviti come biancheria da letto in gabbia per 2-3 settimane per i furetti, un predatore naturale di topi e ratti, sono collocati all'interno di ogni pallina da tè di trattamento. Ogni asciugamano è tagliato in quadrati di 5 cm x 5 cm. Questa aliquotazione viene ripetuta anche con asciugamani di controllo altrimenti identici inodori. Presentare questi odori senza una barriera (cioè una pallina di tè) ha portato i topi a distruggere le fibre all'interno delle loro gabbie, aumentando l'attività fisica. Questo comportamento non era così saliente nei ratti. Le palline di tè forniscono un involucro ventilato all'asciugamano, dando pieno accesso all'odore pur rimanendo protetti per l'intera prova sperimentale. Queste palline di tè possono essere sanificate secondo i protocolli di utilizzo degli animali, preparate e introdotte direttamente dopo l'intervento chirurgico per iniziare ad abituare gli animali alla struttura insieme allo stimolo di controllo. I topi possono quindi vivere con l'arricchimento aggiuntivo, diminuendo la salienza della presentazione dello stimolo acuto.

L'abitudine alla presenza della pallina da tè è solo un aspetto dell'assuefazione che è fondamentale per questo metodo. Il protocollo di assuefazione descritto consiste anche nell'esposizione ripetuta alla procedura di test per normalizzare l'ambiente di test (cioè personale, trasporto e spostamento verso il luogo del test, esposizione allo stimolo). Questa assuefazione prolungata riduce al minimo le risposte sfumate degli animali e concentra le misurazioni sulle variabili dipendenti desiderate (ad esempio, stimoli farmacologici o contestuali). La precedente valutazione di questo protocollo ha identificato quattro prove come il numero minimo di assuefazioni necessarie prima del test della temperatura all'interno delle gabbie domestiche nei ratti⁸. Se il test è separato da lunghi periodi (più di 2-3 settimane), gli animali devono essere nuovamente abituati. Per l'assuefazione ripetuta, sono sufficienti almeno una o due prove. Tuttavia, se i test di temperatura sono separati da periodi di tempo più prolungati, potrebbe essere necessario ripetere più prove.

Nel continuo sforzo di abituare topi e ratti alla procedura di test, un periodo di acclimatazione prima della presentazione dello stimolo dovrebbe essere incluso in ogni prova sperimentale. Questo tempo di acclimatazione è fondamentale per riequilibrare la temperatura e l'attività dopo essere stati spostati nel luogo di test. I roditori tendono ad avere forti aumenti di temperatura dovuti alla traslocazione. L'acclimatazione dovrebbe consistere in un minimo di 1 ora senza interazione da parte dello sperimentatore il giorno della prova prima di qualsiasi aggiunta di un agente farmacologico o stimoli contestuali. Questo è necessario ogni giorno di test.

Nei test di temperatura della gabbia domestica delineati, i topi hanno il campo libero della loro gabbia domestica per vagare in risposta allo stimolo testato. Ciò può causare cambiamenti variabili nell'attività, influenzando l'accuratezza delle letture della temperatura e, quindi, l'analisi degli effetti termogenici della variabile indipendente (ad esempio, stimolo farmacologico o contestuale). In riconoscimento dei potenziali cambiamenti di temperatura dovuti al livello di attività, un protocollo è incluso di seguito che descrive l'uso della temperatura durante la camminata sul tapis roulant. La letteratura pubblicata descrive l'uso efficace di questa procedura nei ratti ed è attualmente impiegata con topi 8,10,14,15. La camminata sul tapis roulant mantiene una velocità costante di attività per il soggetto del test. Per questo studio, i tapis roulant sono rigorosamente utilizzati per controllare il livello di attività e, pertanto, sono impostati sulla velocità più bassa disponibile sul tapis roulant per promuovere la camminata per i topi e un'impostazione altrettanto bassa per i ratti.

La seguente procedura è descritta per la misurazione della temperatura del gastrocnemio unilaterale nei topi e la presentazione degli odori dei predatori. Il disegno può essere utilizzato in combinazione con agenti farmacologici ed è trasferibile ai ratti e ad altri gruppi muscolari scheletrici (cioè quadricipiti) nei topi. Per i ratti, i transponder possono essere posizionati nel gastrocnemio bilateralmente e nel tessuto adiposo bruno. A causa dei limiti di dimensioni e distanza, è possibile utilizzare un solo transponder per mouse. Modifiche minori (ad esempio, la rimozione di stimoli contestuali) possono essere apportate per valutare le risposte termogeniche agli agenti farmacologici.

Questi metodi possono essere applicati sia a modelli di ratto che di topo e sono stati eseguiti con l'approvazione istituzionale (Kent State University, IACUC Approval #359 e #340 CN 12-04). Prima dell'attuazione del protocollo, gli animali devono essere alloggiati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Preparazione del lettore di transponder

NOTA: Prima dell'uso, il lettore del transponder deve essere impostato; I seguenti passaggi includono solo le modifiche alle impostazioni necessarie per questo studio. Questa parte del protocollo è direttamente associata ai lettori portatili DAS-8027-IUS; Altri modelli di lettori devono seguire le istruzioni fornite dal manuale per ottenere risultati di programmazione.

1. Impostare Audio Beep su OFF.
   1. Accendere il dispositivo premendo il pulsante SCAN e attendere che l'illuminazione appaia sul display OLED. Tenere premuto il pulsante BACK/MENU per accedere alla schermata del menu .
   2. Utilizzando il pulsante NEXT/ENTER , scorrere le opzioni fino a OPERATIONAL SETUP. Qui, attiva o disattiva le frecce su o giù per girare SÌ e apri il sottomenu operativo.
   3. Utilizzando il pulsante NEXT/ENTER, scorrere fino a AUDIO BEEP. Poiché l'impostazione predefinita è ON, attivare o disattivare le frecce su o giù e modificare l'impostazione su OFF.
   4. Premere il pulsante NEXT/ENTER per salvare la modifica delle impostazioni.
2. Impostare Vibrazione in lettura su ON.
   1. Seguire i passaggi da 1.1 a 1.2 o completare il passaggio successivo direttamente dopo il passaggio 1.4.
   2. Utilizzando il pulsante NEXT/ENTER, scorrere fino a VIBRARE DURANTE la LETTURA. Poiché l'impostazione predefinita è OFF, attivare o disattivare le frecce su e giù e modificare l'impostazione su ON per sentire, tramite vibrazione, quando la lettura è stata completata indipendentemente dalla possibilità di visualizzare lo schermo.

2. Transponder di programma

NOTA: Ogni transponder impiantato deve prima essere programmato con un'identificazione animale (ID animale o ID transponder). Questa nomenclatura può essere utilizzata come identificazione secondaria per il soggetto del test (ad esempio, quattro cifre per l'abbreviazione del ceppo del topo, posizione del transponder e altre tre o quattro cifre per indicare il numero dell'animale). La programmazione può essere completata giorni prima dell'intervento chirurgico mantenendo sterili i transponder prima dell'intervento.

1. Inserisci il codice ID sul transponder.
   1. Applicare una bobina booster alla testa del lettore, un accessorio specifico per il modello DAS 8027-IUS, che aiuta nella procedura di programmazione.
   2. Usando una mano guantata, posizionare il transponder (all'interno dell'applicatore) nella bobina del booster.
   3. Accendere il dispositivo premendo il pulsante SCAN e attendere che il display OLED si accenda. Tenere premuto il pulsante BACK/MENU per accedere alla schermata del menu .
   4. Utilizzando il pulsante NEXT/ENTER, scorrere le opzioni fino a WRITE TRANSPONDER ID. Qui, attiva o disattiva le frecce su o giù per attivare YES.
   5. Utilizzando il pulsante NEXT/ ENTER, passare a ENTER ID CODE.
   6. Utilizzare i tasti freccia su e giù per scorrere numeri e lettere. Premere AVANTI/INVIO dopo ogni selezione di caratteri per passare al carattere successivo.
   7. Quando il codice ID è completo, premere SCAN per scrivere il transponder.
   8. Rimuovere il transponder dalla bobina booster e ripetere se necessario. Verificare che il transponder legga le variazioni di temperatura riscaldando i transponder chiusi tra le mani guantate e misurando utilizzando lo scanner di temperatura.
      NOTA: LE IMPOSTAZIONI AUTO MULTI WRITE e SEQUENTIAL COUNT possono essere impostate su ON per consentire la programmazione di transponder multipli o sequenziali durante una sessione. Ogni transponder deve essere testato durante la programmazione.

3. Prepara "palle da gabbia domestica"

1. Metti un asciugamano inodore / controllo di 5 cm x 5 cm in una pallina da tè.
2. Posiziona queste sfere di gabbia domestica in nuove gabbie domestiche dopo l'intervento chirurgico per iniziare ad abituare l'animale al metodo in cui gli stimoli contestuali verranno presentati durante i test. Sostituisci queste palle da gabbia domestiche ogni 2 settimane.

4. Chirurgia e cure postoperatorie

1. Pesare e registrare il peso corporeo pre-operatorio dei soggetti. Utilizzando una camera a induzione, fornire anestesia (ad esempio, isoflurano al 2-5%) all'animale.
2. Utilizzando tagliatrici elettriche, radere completamente l'arto posteriore. Somministrare analgesia (ad esempio, 5 mg/kg di ketoprofene, s.c.) in conformità con le linee guida istituzionali.
   NOTA: può essere necessaria un'ulteriore analgesia se questa procedura è combinata con altri metodi chirurgici.
3. Pulire l'area con alcool al 70% (o salvietta alcolica sterile disponibile in commercio) e lavaggio povidone-iodio (o tamponi betadine sterili disponibili in commercio) alternati almeno tre volte, terminando con povidone-iodio.
4. Riportare l'animale nella camera di induzione e anestetizzare l'animale a livelli chirurgici. Quindi, impostare il mouse in una maschera facciale per l'esposizione continua all'anestesia. Applicare un unguento oftalmico alla neomicina agli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   NOTA: La procedura non deve iniziare fino a quando il topo non mostra alcuna evidenza di ricezione del dolore (cioè riflesso corneale, risposta del pizzico della coda, riflesso del pizzico della punta).
5. Usando solo forbici chirurgiche, fai un taglio superficiale attraverso la pelle sull'arto posteriore destro.
6. Spostandosi parallelamente al gastrocnemio, posizionare il bordo tagliente di un transponder sterile preprogrammato e senza tappo nell'incisione. Assicurarsi che lo stantuffo verde sia rivolto verso l'alto e visibile. Continuare a spingere l'applicatore del transponder nell'incisione fino a quando l'apertura dell'applicatore del transponder non è più visibile.
   NOTA: non premere accidentalmente lo stantuffo verde sull'applicatore del transponder durante il punto 4.6. Lo scarico prematuro del transponder porterà a un posizionamento improprio.
7. Ruotare l'applicatore di 180°, facendo sì che lo stantuffo verde sia rivolto verso il basso verso l'arto del topo, non più visibile allo sperimentatore. Spingere l'applicatore del transponder nella posizione finale. Una volta nella posizione ideale, adiacente o parzialmente racchiuso nel gastrocnemio, spingere lo stantuffo verde, consentendo alla pressione dell'applicatore di allontanare la mano dello sperimentatore dal topo.
8. Usando una pinza, tenere insieme la pelle aperta e posizionare una clip per ferite con una clip automatica sterile o una sutura sterile. Se necessario, utilizzare punti di sutura riassorbibili prima dell'autoclip sterile per chiudere lo strato di fascia. Utilizzando il lettore di transponder, controllare la temperatura del muscolo del topo.
9. Rimuovere il topo dall'anestesia e metterlo in una gabbia domestica pulita posta sopra una piastra riscaldante a circolazione d'acqua impostata su un punto di riferimento per il recupero. Assicurati che la gabbia di casa includa una pallina da tè con un asciugamano inodore per iniziare l'assuefazione.
   NOTA: Il topo dovrebbe risvegliarsi dall'intervento chirurgico entro 15 minuti. Il cibo può essere posizionato sul fondo della gabbia per un facile accesso durante i giorni di recupero.
10. Cure postoperatorie
    1. Registrare quotidianamente i pesi e le temperature del topo utilizzando un lettore di transponder per almeno 2 giorni dopo l'intervento chirurgico o fino a quando i topi non recuperano o stabilizzano il peso corporeo.
    2. Somministrare analgesia non narcotica (ad esempio, 5 mg / kg di ketoprofene, s.c.) una volta al giorno ai topi per almeno 2 giorni dopo l'intervento, con dosi aggiuntive fornite secondo necessità.
       NOTA: Topi e ratti dovrebbero recuperare completamente entro 5-8 giorni dall'intervento chirurgico e possono sottoporsi a procedure di assuefazione e test.

5. Preparazione dei test - gabbia domestica

1. Costruzione di riser
   NOTA: il passaggio seguente si basa su gabbie con filtro per mouse da 194 mm x 181 mm x 398 mm. Per adattarsi a gabbie più grandi (ad esempio, una gabbia domestica per topi), la larghezza dovrà essere regolata.
   1. Tagliare il tubo in PVC con una fresa in PVC a cricchetto in otto sezioni e assemblare seguendo la Figura 1C. Ciò darà una struttura da tavolo aperta che può contenere circa quattro gabbie. Fai il numero desiderato di riser.
2. Configurazione della stanza
   1. Assegna una posizione a ciascun montante all'interno della sala prove. Separare i riser impostati per ricevere diversi stimoli contestuali (cioè odori) di almeno 2 m per evitare variabili confondenti.
      NOTA: Ogni topo dovrebbe avere una posizione di test assegnata all'interno della sala di prova e sui riser fisici per quanto possibile per evitare lo sviluppo di associazioni tra diverse posizioni e stimoli termogenici.
   2. Utilizzando strisce magnetiche, attaccare fogli chirurgici o camici attraverso i riser, creando una barriera visiva tra il ricercatore e i soggetti del test. Impostare questa barriera per ridurre al minimo le variazioni di temperatura derivanti dall'attività del mouse quando si osservano gli sperimentatori che si muovono verso la gabbia o intorno alla sala di prova.
   3. (Facoltativo) Posizionare gli specchi sulla superficie sotto i riser per facilitare la visione del fondo della gabbia durante i test.
      NOTA: I riser possono essere sanificati attraverso un sistema di lavaggio a gabbia. I fogli di stoffa o chirurgici devono essere lavati prima dell'assuefazione e del test.
3. Preparazione della pallina da tè
   1. Preparare palline da tè con controllo e asciugamani PO (circa 5 cm x 5 cm). Per evitare la contaminazione incrociata, preparare prima le palline di tè con odore di controllo.
      NOTA: gli asciugamani con odore di predatore devono essere testati dagli agenti patogeni prima dell'uso. Anche questi asciugamani dovrebbero essere contenuti e i materiali che interagiscono con loro dovrebbero essere immediatamente disinfettati (ad esempio, lavaggio in gabbia), evitando l'esposizione dell'odore ad altri animali.

6. Test di temperatura - gabbia domestica

NOTA: Gli animali devono essere abituati all'intera procedura di test, esclusi gli stimoli sperimentali contestuali o farmacologici. Questo dovrebbe essere completato almeno 4 volte prima del test.

1. Trasferire gli animali nella sala prove preparata. Posizionare gli animali in una posizione preassegnata sul montante. Questa posizione dovrebbe essere la stessa in tutte le procedure di assuefazione e test.
2. Rimuovere la "palla della gabbia domestica" dalla gabbia domestica del topo e ricoprire le gabbie con un panno o un foglio chirurgico. Consentire ai topi di acclimatarsi allo spazio di prova per 1-2 ore.
3. Al termine dell'acclimatazione, utilizzare lo scanner per misurare e registrare la temperatura di base di ciascun soggetto. Evitare di manipolare i rivestimenti in tessuto durante le misurazioni.
   NOTA: Gli agenti farmacologici possono essere applicati qui. Il tempo di attesa dopo l'iniezione o l'applicazione possono essere aggiunti secondo necessità prima del test. Si raccomanda di registrare una linea basale secondaria direttamente prima del test dopo l'aggiunta di un agente farmacologico per monitorare la risposta agli stimoli farmacologici. Se la risposta agli odori non viene testata, le misurazioni della temperatura dei topi possono iniziare direttamente dopo l'iniezione. La randomizzazione dovrebbe essere impiegata quando si forniscono stimoli.
4. Scopri la gabbia e posiziona la pallina da tè (controllo o PO) sul pavimento della gabbia domestica. Riposizionare il coperchio della gabbia e il rivestimento in tessuto.
5. Iniziare il cronometro. Misurare le temperature dei soggetti del test nello stesso ordine di posizionamento della pallina da tè. Registrare le temperature e il tempo di clock delle misurazioni seguendo i punti temporali desiderati.
6. Quando l'esperimento è completo, rimuovere la sfera di trattamento. Metti i topi che hanno ricevuto PO in una nuova gabbia domestica con l'originale "home cage ball". Riportare la "palla della gabbia domestica" nella gabbia dei topi che hanno ricevuto l'odore di controllo. Trasferisci i topi nella posizione dell'alloggiamento.
   NOTA: La procedura di cui sopra può essere tradotta in modelli di ratto all'interno di gabbie di dimensioni appropriate. Possono essere necessarie modifiche alle misurazioni suggerite nella figura 1C per consentire un migliore accesso al fondo della gabbia domestica.

Figura 1: Transponder e test della temperatura della gabbia domestica. (A) Diagramma di posizionamento unilaterale del transponder per la prova della temperatura in un gastrocnemio di topo. Una volta programmato e posizionato, il lettore di transponder (DAS-8027-IUS, mostrato) può essere utilizzato per misurare la temperatura. (B) A sinistra, foto di una pallina da tè in acciaio inossidabile a maglie aperte e un asciugamano di 5 cm x 5 cm. A destra, pallina da tè chiusa, usata per tenere l'assuefazione e gli asciugamani odoranti nei test della gabbia domestica. (C) Schema dei riser costruiti con tubazioni in PVC per il collaudo delle gabbie domestiche. (D) Flusso di lavoro del protocollo di test della gabbia domestica. (E) Immagini dell'impianto dell'area di prova delle gabbie domestiche. A sinistra, quattro gabbie per topi in cima a un montante. Le strisce magnetiche si trovano sulla parete adiacente e magneti e panno chirurgico sono sul tavolo. A destra, gabbie di topi coperte su riser. (A), (C) e (D) sono stati creati con Biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

7. Test di temperatura - camminata sul tapis roulant

1. Assegna a ciascun animale un tapis roulant come posizione assegnata per le procedure di assuefazione e test.
2. Preparare i tapis roulant per il test, assicurandosi che gli ammortizzatori siano funzionali.
   NOTA: Per la camminata sul tapis roulant, i tapis roulant devono essere impostati al ritmo più basso disponibile che promuova il movimento continuo ma non la corsa sia per l'assuefazione che per il test. Per il tapis roulant metabolico modulare chiuso 1012M-2, questo è 5,2 m / min per i topi e 7 m / min per i ratti. Potrebbe essere necessario regolare questo ritmo in base all'obesità del soggetto. Gli shock dovrebbero essere impostati su un'intensità e un tasso di ripetizione di 5,0.
3. Assuefazione
   1. Sposta i topi nella stanza di prova. Consentire ai topi 1-2 ore di acclimatarsi al trasferimento della stanza nelle loro gabbie domestiche.
   2. Dopo l'acclimatazione, guidare i topi all'apertura del tapis roulant assegnato e chiudere il tapis roulant. Avviare la cintura, l'ammortizzatore e il cronometro.
   3. Consentire ai topi di camminare sui tapis roulant per 15 minuti, utilizzando lo stimolo d'urto come motivazione per il movimento. Interrompere immediatamente il test se un animale rimane su uno shock attivo per un periodo prolungato.
   4. Dopo il test, rimuovere i topi e riportarli nelle gabbie di casa.
   5. Pulire i tapis roulant con detergente liquido e acqua.
4. Collaudo
   1. Sposta i topi nella stanza di prova. Consentire ai topi 1-2 ore di acclimatarsi al trasferimento della stanza nelle loro gabbie domestiche.
   2. Misurare e registrare la temperatura basale prima di spostare il mouse sul tapis roulant.
      NOTA: Per i test che includono agenti farmacologici, applicarli o iniettarli qui, seguendo lo schema mostrato nella Figura 2A. Il tempo di attesa dopo l'iniezione può essere aggiunto secondo necessità prima che i topi vengano posizionati sul tapis roulant. La randomizzazione dovrebbe essere impiegata quando si forniscono stimoli.
   3. Posizionare quadrati di controllo di 5 cm x 5 cm o asciugamani PO all'interno del tapis roulant più vicino alla parte anteriore del tapis roulant. Far aderire gli asciugamani al soffitto del tapis roulant o sotto per un facile posizionamento e rimozione.
   4. Guida i topi nel tapis roulant assegnato. Accendi la cintura del tapis roulant e lo shocker.
   5. Avviare il cronometro. Misurare i soggetti del test nello stesso ordine in cui i topi sono stati sistemati nei tapis roulant. Registrare le temperature e l'ora di clock delle misurazioni seguendo i punti temporali desiderati.
      NOTA: la temperatura può essere misurata in modo affidabile dall'esterno del tapis roulant mentre un mouse è all'interno di un tapis roulant chiuso durante l'attività di camminata. Per i ratti, le dimensioni del tapis roulant e le limitazioni della distanza del lettore del transponder possono richiedere a uno sperimentatore di tenere aperta la parte posteriore del tapis roulant per inserire il lettore all'interno del tapis roulant, più vicino al soggetto.
   6. Al termine del test, spegnere gli ammortizzatori e i tapis roulant; Riportare i topi nelle loro gabbie di casa. Trasferisci i topi nella posizione dell'alloggiamento.
   7. Pulire i tapis roulant utilizzando detergente liquido e acqua, prestando particolare attenzione a rimuovere eventuali residui di PO.
   8. Quando gli esperimenti sono completi, eutanasia gli animali (ad esempio, usando l'inalazione di CO₂ ) e confermare visivamente la posizione del transponder.

Figura 2: Test di temperatura ad attività controllata . (A) Flusso di lavoro di test di temperatura controllati ad attività con un agente farmacologico che utilizza il tapis roulant. (B) Immagini delle strutture dei tapis roulant. A sinistra, un'immagine della configurazione completa dell'attrezzatura. A destra, un'immagine più ravvicinata di singoli tapis roulant e shocker. (A) è stato creato con Biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

I transponder sono stati impiantati unilateralmente nel gastrocnemio destro di dieci topi wild-type (WT) di 4-6 mesi allevati dal ceppo SF1-Cre (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, ceppo #012462, C57BL/6J e background FVB; femmina N = 5; maschio N = 5). Dopo il recupero, i topi sono stati abituati a una procedura di test della temperatura della gabbia domestica che non includeva uno stimolo contestuale (ad esempio, PO). Le misurazioni della temperatura utilizzando una bacchetta transponder sono state registrate all'interno della loro stanza di alloggiamento e dopo il trasferimento al luogo di prova. Ai topi sono state somministrate 1-2 ore per acclimatarsi alla sala di prova e alla posizione. Al completamento dell'acclimatazione, sono state registrate misurazioni basali e consecutive per 1 ora per ciascun topo. Questa procedura è stata completata quattro volte.

Nel complesso, non sono state osservate differenze di sesso. Le temperature muscolari sono aumentate significativamente dopo che i topi sono stati spostati nella sala di prova, quindi sono diminuite dalla misurazione di base dopo 60 minuti trascorsi nel contesto del test. L'analisi del sesso combinato dello studio 4 non ha mostrato differenze significative tra le misurazioni della temperatura "prima del movimento" e "basale" (test t a due code, accoppiato, p > 0,10), mostrando l'efficacia dell'acclimatazione di 1 ora al contesto del test. Inoltre, il confronto statistico delle temperature al basale e al 60 min ha mostrato una significativa diminuzione della temperatura (test t a due code, accoppiato, p < 0,01), fornendo la prova che i topi si abituano al movimento dello sperimentatore durante la misurazione. Tuttavia, le femmine (ma non i maschi) hanno mostrato risposte incrementali in cui la temperatura misurata da 5 minuti a 15 minuti era inferiore con successivi studi di assuefazione (Figura 3). Quando si osservano gli effetti acuti dello spostamento o dell'aumento della temperatura dopo il basale, i topi tendono a rispondere meno al trasporto nella sala di prova nel corso di successivi studi di assuefazione (Supplementary File 1, analisi di prova).

I topi WT adulti abituati descritti sopra sono stati testati con Oxt, un agente farmacologico. Ai topi sono state somministrate iniezioni intraperitoneali (i.p., 2 mg / kg) di Oxt o veicolo (soluzione salina sterile) in ordine casuale e le temperature muscolari sono state misurate prima del movimento nella sala prove e dopo 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 minuti di iniezione. Ogni topo ha ricevuto entrambi i trattamenti. Un'analisi della varianza a misure ripetute (ANOVA) ha rivelato significativi effetti principali di Oxt e del tempo, in cui Oxt ha ridotto la temperatura muscolare rispetto al veicolo. Oxt ha ridotto la temperatura muscolare rispetto al basale fino a 5 minuti dopo l'iniezione, con una diminuzione massima osservata 30 minuti dopo l'iniezione (Figura 4). Le temperature muscolari sono state normalizzate di 60 minuti dopo l'iniezione di Oxt (test t a due code, accoppiato, p > 0,10).

I ratti maschi adulti di Sprague-Dawley (N = 4, età ~ 6 mesi) impiantati bilateralmente con transponder nel gastrocnemio sono stati abituati e quindi testati in una gabbia domestica con uno stimolo PO (odore di furetto). Sono state registrate le misurazioni di base e a ciascun ratto è stato presentato un PO sotto forma di asciugamano. L'odore è stato poi rimosso dopo 10 minuti di esposizione; Sono state effettuate misurazioni consecutive prima e dopo la rimozione dello stimolo. Questi dati preliminari (Figura 5) suggeriscono che la PO ha un impatto continuo sulla termogenesi del muscolo scheletrico dopo la rimozione dello stimolo.

I dati pubblicati in precedenza hanno valutato l'attivazione della minaccia predatoria della termogenesi del muscolo scheletrico nei ratti Sprague-Dawley maschi adulti (età ~ 6 mesi)8. I ratti con transponder gastrocnemio bilaterali impiantati sono stati presentati con odore di predatore (furetto). Le misurazioni sono state effettuate in una gabbia domestica (N = 8, Figura 6A). Questi dati hanno rivelato un robusto aumento della temperatura rispetto agli odori di controllo. Per analizzare le risposte termogeniche avverse o stressanti all'odore del furetto, ai ratti maschi (N = 7, Figura 6B) è stato presentato un odore avversivo (acido butirrico), un nuovo odore (2-metilbenzossazolo) o un odore di volpe, o trattenuto per 1 minuto prima del test (stress moderato). Le misurazioni sono state effettuate in una gabbia domestica per un periodo di 2 ore. L'analisi di questi dati ha mostrato che l'odore del furetto produce e mantiene un forte cambiamento nella termogenesi rispetto a tutte le altre condizioni. Insieme, questi dati forniscono la prova dell'influenza minima e transitoria dell'odore di controllo sulla termogenesi del muscolo scheletrico.

Figura 3: Analisi della temperatura muscolare durante l'assuefazione per il test della temperatura della gabbia domestica. I topi impiantati unilateralmente con transponder nel gastrocnemio destro erano abituati alla procedura di test. I topi sono stati misurati nella stanza di stabulazione degli animali, "Before Move", nella sala prove, "After Move", dopo l'acclimatazione per 1-2 ore, "Baseline", quindi consecutivamente oltre 1 ora. Tutti i confronti statistici mostrati sono stati effettuati tra lo studio 1 e lo studio 4, * p < 0,05, ** p < 0,01 (t-test, N = 10); † p < 0,05, †† p < 0,01, ‡ p < 0,001 studio sull'effetto principale (ANOVA, N [studi] = 4). Le barre di errore visualizzate mostrano l'errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Temperatura muscolare durante la stimolazione farmacologica dell'ossitocina nei topi. Ai topi abituati, impiantati unilateralmente con transponder, sono stati somministrati 2 mg/kg (i.p.) di ossitocina o veicolo (soluzione salina sterile). Diminuzioni significative della temperatura muscolare sono state osservate a 5 minuti dopo l'iniezione di ossitocina e normalizzate di 60 minuti, ** p < 0,01, *** p < 0,001 (test t accoppiato a due code, N = 9). Le barre di errore mostrate mostrano l'errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Termogenesi dell'odore predatore nei test della temperatura della gabbia domestica del ratto. Misurazioni della temperatura in ratti con transponder impiantati bilateralmente nel gastrocnemio dopo esposizione all'odore di predatore (furetto) per 10 minuti. Dopo l'esposizione per 10 minuti, gli asciugamani contenenti lo stimolo sono stati rimossi, come indicato dalla freccia. I ratti hanno mantenuto una temperatura aumentata 20 minuti dopo la rimozione dello stimolo. Significativamente superiore alla temperatura basale, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 (test t, N = 4). Le barre di errore mostrate mostrano l'errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: L'odore del furetto induce un rapido aumento della temperatura muscolare rispetto al controllo. (A) La temperatura del gastrocnemio era significativamente elevata dopo l'odore del predatore (furetto) rispetto all'esposizione di controllo nei ratti maschi (test t accoppiato a due code, N = 8). (B) Gli odori nuovi, avversivi o di volpe non hanno modificato significativamente la temperatura muscolare rispetto al controllo. Il cambiamento di temperatura indotto da uno stress moderato è diminuito rapidamente dopo 5 minuti. L'odore di furetto ha mantenuto una risposta robusta, rispetto ad altre condizioni, per l'intero test (ANOVA, N = 7). † p tutte le altre condizioni; * p < 0,025, confronto puntuale tra odore di furetto e stress moderato rispetto all'odore di controllo. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Gorrell et al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: markdown R per l'analisi di assuefazione della Figura 3 . Il file Markdown per l'analisi dell'assuefazione con codice R mostra metodi di codifica di esempio e modi in cui il sesso può essere sondato all'interno dei dati. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.