Method Article

Applicazioni tecniche di microelectrode array e patch clamp recordings su cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

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I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un promettente modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Qui, dettagliamo un protocollo per misurare la contrattilità e l'elettrofisiologia delle hiPSC-CM.

Abstract

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La cardiotossicità indotta da farmaci è la principale causa di logoramento e ritiro dal mercato. Pertanto, l'utilizzo di appropriati modelli di valutazione della sicurezza cardiaca preclinica è un passo fondamentale durante lo sviluppo del farmaco. Attualmente, la valutazione della sicurezza cardiaca dipende ancora fortemente dagli studi sugli animali. Tuttavia, i modelli animali sono afflitti da scarsa specificità traslazionale per gli esseri umani a causa delle differenze specie-specifiche, in particolare in termini di caratteristiche elettrofisiologiche cardiache. Pertanto, vi è l'urgente necessità di sviluppare un modello affidabile, efficiente e basato sull'uomo per la valutazione preclinica della sicurezza cardiaca. I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un prezioso modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Gli hiPSC-CM possono essere ottenuti da individui con diversi background genetici e varie condizioni patologiche, rendendoli un surrogato ideale per valutare individualmente la cardiotossicità indotta da farmaci. Pertanto, è necessario stabilire metodologie per studiare in modo completo le caratteristiche funzionali delle hiPSC-CM. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio vari saggi funzionali che possono essere valutati su hiPSC-CM, tra cui la misurazione della contrattilità, del potenziale di campo, del potenziale d'azione e della manipolazione del calcio. Nel complesso, l'incorporazione di hiPSC-CM nella valutazione preclinica della sicurezza cardiaca ha il potenziale per rivoluzionare lo sviluppo di farmaci.

Introduction

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Lo sviluppo di farmaci è un processo lungo e costoso. Uno studio su nuovi farmaci terapeutici approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti tra il 2009 e il 2018 ha riportato che il costo medio stimato della ricerca capitalizzata e degli studi clinici è stato di $ 985 milioni per prodotto1. La cardiotossicità indotta da farmaci è la principale causa di logoramento e ritiro dal mercato2. In particolare, la cardiotossicità è riportata tra più classi di farmaci terapeutici3. Pertanto, la valutazione della sicurezza cardiaca è una componente cruciale durante il processo di svilu....

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Protocol

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1. Preparazione di supporti e soluzioni

  1. Preparare il mezzo di mantenimento hiPSC-CM mescolando un flacone da 10 ml di supplemento 50x B27 e 500 mL di mezzo RPMI 1640. Conservare il mezzo a 4 °C e utilizzarlo entro un mese. Equilibrare il mezzo a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
  2. Preparare il terreno di semina hiPSC-CM miscelando 20 mL di siero sostitutivo e 180 mL di terreno di mantenimento hiPSC-CM (diluizione al 10%, v/v). Mentre si preferisce il terreno di semina appena preparato, può essere conservato a 4 °C per non più di 2 settimane. Equilibrare il mezzo a RT prima dell'uso.
  3. Preparare la soluzione di rivesti....

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Results

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Questo protocollo descrive come misurare il movimento di contrazione, il potenziale di campo, il potenziale d'azione e il transitorio Ca2+ delle hiPSC-CM. Un diagramma schematico che include la digestione enzimatica, la semina cellulare, il mantenimento e la conduzione del saggio funzionale è mostrato nella Figura 1. La formazione del monostrato hiPSC-CM è necessaria per la misurazione del movimento di contrazione (Figura 2B). Una traccia rappresentat.......

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Discussion

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La tecnologia iPSC umana è emersa come una potente piattaforma per la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per misurare la contrattilità hiPSC-CM, il potenziale di campo, il potenziale d'azione e il transitorio Ca2+. Questo protocollo fornisce una caratterizzazione completa della contrattilità e dell'elettrofisiologia hiPSC-CM. Questi saggi funzionali sono stati applicati in più pubblicazioni del nostro gruppo 12,13,18,24,25,26,27........

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Disclosures

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J.C.W. è un co-fondatore di Greenstone Biosciences ma non ha interessi concorrenti, poiché il lavoro qui presentato è completamente indipendente. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgements

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Ringraziamo Blake Wu per aver revisionato il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW) e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piatto inferiore in vetro da 35 mm con vetro di copertura da 20 pozzetti #1.5CellvisD35-20-1.5-NPatch clamp
50x integratori B27Life Technologies17504-044terreno di coltura hiPSC-CM
piastra di coltura a 6 pozzettiE & K ScientificEK-27160coltura hiPSC-CM
96 pozzetti fondo chiaro fondo nero micropiastre trattate con TCCorning3603Misurazione del movimento di contrazione
AccutaseSigma-AldrichA6964Dissociazione enzimatica
Axion's Integrated Studio (AxIS)Axion Biosystemssoftware di navigazione
Capillari in vetro borosilicatoApparecchio HarvardBF 100-50-10,Morsetto patch
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' ThermoFisher
ScientificC10228Conta cellulare
CytoView Piastre MEA a 48 pozzettiAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Terreno matrice extracellulare
DPBS, senza calcio, senza magnesioFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Soluzione per pipette intracellulari
EPC 10 USB  amplificatore patch clampWarner Instruments89-5000Patch clamp
Fura-2, AM, cella permeansThermoFisher ScientificF1221Ca2+ misura dei transitori
GlucosioSigma-AldrichG8270Tyrode' s soluzione
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s soluzione
hiPSCsStanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode' s soluzione
KnockOut Siero di RicambioThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM terreno di semina
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Soluzione per pipette intracellulari
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ misura di transitori; sorgente luminosa a commutazione di lunghezza d'onda ad altissima velocità
Contatore di cellule a fluorescenza automatizzato Luna-FLWISBIOMEDLB-L20001Conteggio delle cellule
Maestro Pro  Sistema MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Matrice della membrana basaleCorning356231Matrice extracellulare
MgATPSigma-AldrichA9187Soluzione di pipetta intracellulare
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s soluzione
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' soluzione
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s
soluzione NIS Elements AR
Pluronic F-127 (soluzione al 20% in DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPMisura dei transitori Ca2+
RPMI 1640 mediumLife Technologies11875-119terreno di coltura hiPSC-CM
di imaging del movimento cellulare Sony SI8000BiotechnologyMisurazione del movimento di contrazione
Estrattore per micropipette SutterInstrumentsP-97Pinza patch
Tintura blu TrypanLife TechnologiesT10282Conteggio cellulare
Sistema Sony

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al.

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Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

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