Method Article

Mappatura della densità assoluta del DNA nei nuclei cellulari mediante microscopia a localizzazione a singola molecola

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive un metodo che misura la densità assoluta del DNA all'interno di nuclei cellulari aderenti utilizzando la tassellatura Voronoi di dati di microscopia di localizzazione di singole molecole, volume noto, dimensione del genoma e stadio del ciclo cellulare.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

All'interno del nucleo cellulare, i geni silenti sono generalmente localizzati in aree di cromatina ad alta densità chiamate eterocromatina, mentre i geni attivi possono essere trovati principalmente all'interfaccia tra la cromatina e lo spazio intercromatinico chiamato eucromatina. Attualmente, la caratterizzazione dell'eu- e dell'eterocromatina si basa principalmente sulle modificazioni epigenetiche delle proteine istoniche lungo la sequenza del DNA, mentre poco si sa sulle densità assolute del DNA nel nucleo cellulare e sulle loro implicazioni funzionali. I modelli del nucleo basati esclusivamente su dati biochimici e ipotesi sulla natura della cromatina come polimero differiscono ancora fondamentalmente dai dati di imaging generati dalla microscopia ad alta risoluzione. Ciò indica che mancano ancora importanti informazioni strutturalmente rilevanti. Riteniamo che i vincoli spaziali possano essere coinvolti nella regolazione genica e abbiamo quindi sviluppato un metodo che consente la misurazione delle densità assolute del DNA nei nuclei delle cellule di mammifero trasformando i dati di localizzazione in super-risoluzione in mappe di densità in scala reale mediante tassellatura di Voronoi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fin dagli albori della biologia cellulare, il nucleo cellulare, la sede dell'informazione genetica, ha affascinato i biologi. Dopo aver applicato metodi di colorazione citologica auto-sviluppati, Emil Heitz scoprì, nel 1928, aree diversamente colorate intensamente all'interno del nucleo cellulare1. Chiamò le aree più intensamente colorate e dense "eterocromatina", mentre chiamò le aree meno colorate e meno dense "eucromatina". Nel corso del tempo, è diventato evidente che i geni attivi si trovano principalmente nell'eucromatina, mentre le aree più dense sono risultate ricche di elementi ripetitivi e geni silenti. I termini eterocromatina ed eucromatina sono sopravvissuti fino ai giorni nostri, anche se la loro definizione è cambiata da proprietà strutturali a molecolari (vedi sotto). Oggi sappiamo che il nucleo cellulare è diviso in due fasi principali. Uno liquido (il compartimento intercromatinico), che ospita i corpi nucleari, il compartimento di splicing e il nucleoplasma, e l'altro solido, simile all'idrogel, il dominio della cromatina, che include i territori cromosomici e i nucleoli2. All'interfaccia con lo spazio intercromatinico, la cromatina è meno densa, ed è qui che avvengono principalmente i processi geneticamente attivi come la trascrizione, la replicazione e la riparazione 3,4,5, mentre adiacente alla lamina, intorno ai nucleoli e vicino ai centromeri, la cromatina mostra alti livelli di compattazione ed è in generale trascrizionalmente piuttosto inattiva6.

A livello molecolare, la cromatina è costituita da DNA avvolto attorno ai nucleosomi (un ottamero delle proteine istoniche del nucleo). Gli istoni possiedono domini di coda intrinsecamente disordinati che possono essere modificati post-traduzionalmente aggiungendo diversi gruppi chimici (metile, acetile, fosforo, biotina), aminoacidi (arginina) o persino proteine (SUMO, ubiquitina)7. Queste modificazioni possono essere lette e attrarre altre proteine (ad esempio, rimodellatore della cromatina, HP1, proteine di riparazione, RNA) e quindi definire lo stato fisiologico della sequenza del DNA (trascrizionalmente permissivo/restrittivo), senza modificarne direttamente la sequenza (quindi "epi"genetica)7. Il tipo e il numero di modifiche attorno a una sequenza specifica possono differire profondamente tra i tipi di cellule, è reversibile e può cambiare durante lo sviluppo, la senescenza e la malattia 8,9,10. Ci sono modificazioni delle code istoniche che sono più prevalenti nelle regioni altamente trascritte e modificazioni che predominano nelle regioni del genoma che hanno poca o nessuna attività trascrizionale.

Ad esempio, le regioni altamente trascritte che sono ricche di modificazioni di H3K4 o le cui code istoniche sono acetilate sono solitamente descritte come eucromatina, mentre le aree ricche di modificazioni istoniche repressive (H3K9me3, H3K27me3 o H4K20me3) sono indicate come eterocromatina, che è ulteriormente suddivisa in eterocromatina costitutiva (trascrizionalmente inattiva in tutte le cellule) (ad esempio, H4K20me3) ed eterocromatina facoltativa (cromatina silenziata a seconda del tipo di cellula, ad esempio, H3K27me3)6. Sebbene i metodi biochimici e di biologia molecolare siano molto adatti per misurare i cambiamenti chimici a livello di sequenza, è molto più difficile utilizzarli per fare affermazioni sulle proprietà spaziali alla mesoscala utilizzando questi metodi.

Ad esempio, sono stati fatti tentativi utilizzando le informazioni di prossimità provenienti da esperimenti Hi-C, che rilevano e mappano le immediate prossimità del DNA tra le regioni di sequenza, per ricostruire modelli spaziali del genoma11. Tuttavia, il confronto diretto con immagini di microscopia ottica ed elettronica ad alta risoluzione mostra che ciò è possibile solo in misura limitata (Figura 1). Sebbene metodi come Hi-C12 possano rilevare correttamente i territori cromosomici nelle cellule interfasiche come entità separate, questi modelli sono piuttosto "miopi", perché le sole prossimità della sequenza del DNA sono cieche per riflettere le relazioni spaziali tra parti più distanti del genoma e quindi non sono molto adatte per una corretta ricostruzione del genoma 3D. Pertanto, anche le differenze di densità non possono essere riflesse correttamente dalle informazioni sulla frequenza di contatto. Questo porta a rappresentazioni "spaghettificate" del genoma nel nucleo (vedi Figura 1B), che sembrano verificarsi in un gomitolo di anelli simili a lana, liberamente accessibili.

Per aprire la strada a un'immagine integrativa e più realistica del nucleo che combini informazioni biochimiche con dati biofisici e strutturali, è necessario sviluppare metodi che consentano di generare dati su diversi aspetti dell'organizzazione nucleare. Fino a poco tempo fa, era anche difficile determinare le densità assolute del DNA nei nuclei cellulari dai dati di imaging. Le ragioni di ciò erano la risoluzione limitata dei microscopi ottici convenzionali, i problemi nella microscopia elettronica per colorare specificamente il DNA e i piccoli volumi di osservazione nella microscopia elettronica.

La risoluzione dei microscopi a fluorescenza convenzionali è limitata dalla diffrazione della luce. L'immagine di una sorgente di luce puntiforme è diffusa a causa del limite di diffrazione e può essere descritta dalla funzione di diffusione puntiforme (PSF). Secondo la PSF, l'immagine di un fluoroforo, che può essere considerato in buona approssimazione come una sorgente di luce puntiforme, occupa un volume di una certa dimensione attorno alla sua fonte di origine (fluoroforo)13. Quando molti fluorofori, situati molto più vicini l'uno all'altro rispetto alle dimensioni delle loro immagini a diffrazione limitata, vengono eccitati simultaneamente, le distribuzioni di intensità dell'immagine vengono sovrapposte e la posizione dei singoli fluorofori non può essere risolta. L'emissione sequenziale e stocastica di luce dai fluorofori (lampeggiante) consente l'isolamento ottico delle singole molecole e, quindi, la ricerca delle loro posizioni esatte determinando i centri di gravità dell'intensità dei loro segnali.

Questo può essere utilizzato per ricostruire le informazioni strutturali dei campioni mediante l'accumulo di dati di localizzazione dei fluorofori da molte immagini registrate. Questo metodo è generalmente indicato come microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) (per ulteriori informazioni vedere14). Più fotoni emette un fluoroforo durante il suo "tempo di accensione", più precisamente è possibile determinare i centri di gravità dell'intensità. Le lenti astigmatiche nel percorso del fascio trasformano i segnali dei fluorofori sopra o sotto il piano focale ottico in ellissi, che possono essere utilizzate per determinare la loro posizione lungo l'asse ottico. Gli assi lunghi delle ellissi originate dai segnali fluorescenti al di sotto del piano focale sono ruotati di 90° rispetto agli assi delle ellissi originate dai fluorofori al di sopra del piano focale. Inoltre, il rapporto assi di queste ellissi consente di determinare la posizione della molecola lungo l'asse ottico rispetto al piano focale entro un intervallo di ±300 nm15.

La qualità delle immagini a super-risoluzione generate dalla ricostruzione di eventi di lampeggio stocastico dipende fortemente dalla densità di marcatura e dal numero di eventi di lampeggiamento. Questi ultimi dipendono dalla fotostabilità dei fluorofori e dal numero di eventi di lampeggiamento prima che falliscano (numero di cicli di accensione/spegnimento). Il metodo qui descritto per ottenere immagini a super-risoluzione della distribuzione intranucleare del DNA è chiamato fBALM (microscopia di localizzazione attivata dal legame assistito da fluttuazione della struttura del DNA). Si basa su fluorofori che si intercalano transitoriamente in acidi nucleici e diventano fluorescenti solo una volta che sono legati al DNA16,17. A causa dei residui carichi della sua spina dorsale di fosforo-diestere, il DNA è un polimero altamente caricato negativamente. La stabilizzazione dei filamenti di DNA complementari nelle cellule viventi richiede la neutralizzazione da parte di proteine caricate positivamente (ad esempio, istoni) e ioni. Abbassando il pH, la stabilità dell'accoppiamento complementare delle basi viene ridotta per consentire ai coloranti intercalanti di diffondersi dentro e fuori 16,17.

A seconda del colorante fluorescente intercalante, questo stato può essere raggiunto entro un certo intervallo di pH. I coloranti fluorescenti come YoYo-1 e SYTOX Orange emettono fluorescenza solo quando si legano al DNA e poiché i coloranti intercalanti (a differenza dei coloranti che legano il solco minore del DNA come Hoechst e 4',6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI]) di solito si legano in modo indipendente dalla sequenza, sono adatti per mappare la distribuzione del DNA all'interno dei nuclei cellulari mediante microscopia di localizzazione.

La tassellatura di Voronoi è un metodo matematico che permette di suddividere lo spazio in diverse partizioni in base alla posizione dei punti. Nello Spazio 2D, la dimensione delle tessere risultanti riflette l'inverso della densità dei punti18. Poiché la microscopia di localizzazione ricostruisce le immagini come un insieme di punti che rappresentano la posizione dei fluorofori, la tassellatura di Voronoi può aiutare a determinare la densità dei segnali di localizzazione (Figura 2). Pertanto, l'utilizzo di un colorante specifico per il DNA come fluoroforo consente di misurare la densità del DNA.

La conoscenza a priori del contenuto di DNA (numero di coppie di basi) e della dimensione spaziale del nucleo permette la trasformazione delle densità relative del DNA in densità assolute del DNA. Il seguente protocollo mostra la mappatura delle densità assolute del DNA nelle cellule aderenti utilizzando SMLM ad una risoluzione molto elevata e dimostra che queste densità sono soggette a grandi variazioni.

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Protocol

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NOTA: la Figura 3 fornisce una panoramica del flusso di lavoro descritto in questa sezione. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi ai reagenti, ai materiali, alle apparecchiature e al software utilizzati in questo protocollo. Il codice utilizzato per questa pubblicazione può essere visualizzato e scaricato qui: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Coltura cellulare

  1. Coltivare cellule C3H10T1/2, HFB e HeLa in DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino a 37 °C in un'atmosfera umidificata integrata con il 5% di CO2. Quando le cellule sono vicine alla confluenza, subcolture le cellule dividendole in un rapporto di 1:3 (C3H10T1/2, HFB) e 1:10 (HeLa), rispettivamente.
  2. Un giorno prima di eseguire le misurazioni, seminare le cellule provenienti da colture a crescita esponenziale su un piatto a griglia da 35 mm. Assicurarsi che le piastre di osservazione forniscano un'eccellente qualità ottica per la microscopia a fluorescenza (fondo in vetro con uno spessore di 170 μm, #1,5) e dispongano di una griglia per localizzare in modo univoco le cellule. Assicurarsi inoltre che le cellule siano in una sospensione unicellulare e che l'intera area della superficie della capsula sia ricoperta in modo omogeneo di cellule.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare piastre con una griglia stampata per trovare nuovamente le celle esatte che sono state assegnate a una determinata fase del ciclo cellulare.
  3. Se richiesto dall'esperimento, aggiungere 100 nM di Tricostastatina A (TSA) al terreno di coltura cellulare e incubare le cellule nelle condizioni precedentemente descritte nella fase 1.1.

2. Preparazione del campione

  1. Il giorno della misurazione, lavare le cellule una volta con 1x DPBS prima di fissarle per 30 minuti in paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x DPBS.
    NOTA: Per risultati riproducibili, assicurarsi che venga preparata ogni volta una soluzione di PFA fresca e prestare particolare attenzione che la concentrazione di PFA sia accurata.
  2. Dopo aver rimosso il fissativo, lavare nuovamente le cellule 2 volte con 1 DPBS prima di permeabilizzarle per 20 minuti in 1 DPBS contenente lo 0,4% di Triton X-100.
  3. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione con una pipetta ed eseguire un'ulteriore fase di lavaggio con 1x DPBS prima di trattare le cellule con un cocktail di RNasi (diluizione 1:1.000 in 1x DPBS). Porre le cellule in un incubatore per 30 minuti a 37 °C in una camera umidificata.
  4. Preparare la soluzione colorante diluendo la soluzione madre SYTOX Orange compatibile con fBALM (5 mM in 1x DPBS a diluizione 1:10.000).
  5. Rimuovere il tampone RNasi utilizzando una pipetta e applicare una fase di lavaggio aggiuntiva con 1x DPBS prima di aggiungere la soluzione colorante. Incubare le cellule a temperatura ambiente in una camera umidificata per 5 minuti.
  6. Rimuovere la soluzione colorante SYTOX Orange dalle cellule con una pipetta, lavare con 1x DPBS e conservare le cellule in 1x DPBS, al riparo dalla luce intensa.

3. Determinazione citometrica del ciclo cellulare

NOTA: Per questa fase, è stato utilizzato un microscopio di screening invertito ad alto contenuto, ma può essere utilizzato qualsiasi microscopio a fluorescenza a campo largo inverso automatizzato. L'intensità dell'intero nucleo è una misura del suo contenuto di DNA; Quindi, assicurati di aprire completamente il foro stenopeico se utilizzi un sistema confocale. Le lenti ad aria per obiettivi a bassa apertura numerica (NA) sono preferibili alle lenti per obiettivi a immersione in olio.

  1. Posizionare la capsula con le cellule su un microscopio a fluorescenza inversa dotato di un tavolino motorizzato e di un software che consente la ricostruzione di ampie aree del campione unendo insieme le immagini registrate automaticamente.
  2. Scegliere una lente obiettiva che consenta la registrazione di un numero sufficiente di cellule per campo visivo (almeno 900 singoli nuclei in totale [per i dettagli, vedere Roukos et al.19]) in modo che l'acquisizione dell'immagine per la determinazione del ciclo cellulare possa essere eseguita in un tempo ragionevole. Utilizzare una lente che non mostri grandi differenze di intensità tra il centro e i bordi. Se tale obiettivo non è disponibile, applicare una correzione a campo piatto alle immagini (vedere il passaggio 7). Per seguire questo protocollo, utilizzare un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di una lente d'aria 20x NA 0,4 con una profondità di fuoco = 8 μm.
  3. Durante l'acquisizione dell'immagine, coprire l'area centrale della parabola utilizzando filtri appropriati per il fluoroforo utilizzato. Scatta immagini in campo chiaro in modalità luce trasmessa.
    NOTA: Le immagini in campo chiaro sono importanti per il riposizionamento delle celle sulla griglia nel passaggio 4.6.
  4. Mettere la pirofila con le celle in frigorifero a 4 °C fino al passaggio 4.4.
  5. Ricostruisci l'area scansionata dalle singole immagini affiancando le singole immagini registrate.
  6. Trasferisci i dati dell'immagine della colorazione fluorescente del DNA su un computer che esegue il software open source CellProfiler4.2.120.
  7. Se è necessaria una correzione a campo piatto delle immagini a fluorescenza, generare un'immagine di riferimento del microscopio utilizzato dalle immagini registrate. Aprire la pipeline Illumination Correction.cpproj (inclusa come file supplementare 1); Si noti che la tubazione appare come una sequenza sullo schermo in cui è possibile fare clic su diversi passaggi. Trascinare e rilasciare le immagini nel campo designato nelle immagini del primo passaggio della pipeline.
    NOTA: Assicurarsi di escludere tutti i dati non immagine nei file elencati utilizzando le opzioni di filtro nella parte inferiore della finestra.
  8. Nell'ultimo passaggio della pipeline di correzione dell'illuminazione, fare clic su Salva immagini per definire una posizione in cui verranno memorizzate le immagini di riferimento, quindi fare clic sul pulsante Analizza immagini .
  9. Aprire la pipeline CellCycleAnalysis.cpproj (inclusa come file supplementare 2). Trascinare e rilasciare le immagini registrate nel passaggio 3.3 (vedere la Figura 4A come esempio), inclusa l'immagine di riferimento (passaggio 3.8), nel campo designato nel primo passaggio Immagini della pipeline.
    NOTA: Assicurarsi di escludere tutti i dati non immagine nei file elencati utilizzando le opzioni di filtro nella parte inferiore della finestra.
  10. Nel passaggio CorrectIlluminationApply della pipeline scegliere l'immagine di riferimento nel menu a discesa selezionando la funzione Select the Illumination.
  11. Nell'ultimo passaggio della pipeline di analisi del ciclo cellulare, definire una posizione in cui è stata memorizzata l'immagine di riferimento nel passaggio 3.7 e fare clic sul pulsante Analizza immagini per avviare la misurazione in blocco delle intensità di fluorescenza integrate di tutti i nuclei all'interno delle immagini registrate nel passaggio 3.3.
    NOTA: CellProfiler4.2.1 genererà un file di testo "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt", che contiene i dati di ciascun nucleo misurato (Immagine, ObjectID, intensità di fluorescenza integrata, coordinate dell'immagine) in formato CSV.
  12. Assicurarsi che l'elemento DisplayHistogram della pipeline sia selezionato come attivo.
  13. Si notino le intensità di fluorescenza integrate nell'istogramma per i picchi G1 e G2 (vedere la Figura 4B come esempio) e si inseriscano gli intervalli intorno ad essi negli elementi FilteredObjects della pipeline. Attivare gli elementi della tubazione facendo clic sulle caselle di controllo.
  14. Attivare gli elementi della pipeline DisplayDataOnImage corrispondenti per generare un'immagine che evidenzi le celle nella fase G1 o G2 ed eseguire nuovamente la pipeline (vedere la Figura 4C come esempio).
  15. Scegli fino a cinque cellule che rappresentano la fase del ciclo cellulare desiderata dall'immagine generata nell'area contrassegnata della camera di osservazione e prova a riposizionare le cellule sul microscopio SMLM.
    NOTA: Poiché qui vengono utilizzate due linee cellulari con dimensioni del genoma sconosciute, le dimensioni del genoma sono state determinate confrontando i picchi G1 di una linea cellulare di fibroblasti umani con i picchi G1 delle cellule HeLa e C3H10T1/2. Gli istogrammi e la relazione proporzionale tra le dimensioni del loro genoma possono essere visualizzati nella Figura S1 supplementare.

4. SMLM-fBALM

NOTA: Sebbene la somma netta di ossigeno in queste reazioni biochimiche combinate sia pari a zero, si consiglia di eseguire la reazione in un piatto non sigillato, poiché concentrazioni limitate di ossigeno possono rallentare la produzione di D-glucono-1,5-lattone. L'aumento della concentrazione di D-glucono-1,5-lattone abbassa gradualmente il pH, il che è necessario poiché un abbassamento immediato del pH altererà l'ultrastruttura del campione.

  1. Preparare 1 mL di tampone per imaging mescolando i seguenti ingredienti: 900 μL di glucosio (1 g/mL di glucosio in 1x DPBS), 50 μL di glucosio ossidasi (0,5 mg/mL in 1x DPBS) e 50 μL di catalasi (40 μg/mL in 1x DPBS).
  2. Rimuovere 1x DPBS dal campione utilizzando una pipetta e aggiungere 1 mL di tampone di imaging nella piastra contenente le cellule.
  3. Monta la capsula sul tavolino di un microscopio compatibile con SMLM. Utilizzare un obiettivo ad alto NA e un elevato ingrandimento ottico.
  4. Individua uno dei nuclei scelti (dal passaggio 3.15) utilizzando il sistema di coordinate della parabola e centralo nel campo visivo della fotocamera.
    NOTA: La reazione enzimatica dura ~60-180 minuti fino a raggiungere il pH corretto per il metodo fBALM e facilita l'ammiccamento appropriato. Si consiglia di montare la capsula di osservazione il prima possibile per fornire al campione il tempo sufficiente per adattarsi alla temperatura dello strumento, poiché le variazioni di temperatura possono portare alla deriva assiale. Assicurarsi che la temperatura nella stanza che ospita il microscopio SMLM sia stabile per tutta la durata della misurazione.
  5. Determinare l'altezza del nucleo modificando la messa a fuoco con l'unità z del microscopio e registrando la posizione dei limiti superiore e inferiore.
  6. In momenti diversi, verificare il corretto lampeggiamento prodotto dal processo fBALM aumentando la potenza del laser. Una volta che il campione mostra un corretto lampeggio stocastico, iniziare l'acquisizione della serie di immagini necessarie per la ricostruzione dell'SMLM super-risolto.
    NOTA: Il microscopio utilizzato per fBALM deve essere dotato di laser di eccitazione adatti ad eccitare il fluoroforo utilizzato e in grado di generare densità di fotoni sufficientemente elevate da garantire un numero sufficiente di fotoni per fotogramma. Testalo in un esperimento pilota prima di tutti gli altri esperimenti.
  7. Una volta assicurato il corretto lampeggiamento del processo fBALM, iniziare l'acquisizione della serie di immagini utilizzando un tempo di esposizione di 50 ms, con un frame rate di ~20 fps.
  8. Prendi uno z-stack attraverso il nucleo (intorno alla sezione centrale) con intervalli di passo di 200 nm e solo 500 fotogrammi per sezione ottica leggera. Tornando alla sezione centrale, prendi una serie di immagini di 50.000 fotogrammi per raccogliere abbastanza eventi di lampeggio per una buona ricostruzione dei dettagli strutturali con un'alta precisione di localizzazione (questo richiederà ~45 minuti).
    NOTA: Lo z-stack è importante per determinare la frazione della sezione centrale del segnale del DNA rispetto all'intero nucleo. Assicurarsi che la dimensione effettiva dei pixel sia adatta per SMLM22 e che il segnale sulla fotocamera non saturi il sensore.
  9. Assicurarsi che siano soddisfatti i seguenti requisiti
    1. Assicurarsi che il computer di acquisizione contenga spazio su disco sufficiente poiché, a seconda del numero e delle dimensioni delle immagini a 16 bit, le dimensioni dei file delle pile di immagini possono diventare piuttosto grandi.
    2. Assicurarsi che il computer su cui è in esecuzione il software di acquisizione sia in grado di gestire un file system sul dispositivo di archiviazione utilizzato in grado di gestire file di grandi dimensioni (>4 GB) e che la velocità di trasferimento al dispositivo di archiviazione sia sufficientemente elevata per scrivere i file in tempo reale durante la registrazione diretta dei dati dell'immagine sul dispositivo di archiviazione.
    3. Quando si salvano i dati dopo l'acquisizione dell'immagine, assicurarsi che il computer sia dotato di RAM sufficiente (ad es. 64 GB).

5. Preparazione e registrazione di un piatto con perle fluorescenti per la calibrazione z del microscopio SMLM

NOTA: Per una corretta calibrazione assiale delle lenti astigmatiche del microscopio per assegnare le posizioni corrette lungo l'asse ottico, è necessario prendere in considerazione la registrazione di z-stack di perline fluorescenti da 100 nm.

  1. Diluire le perle 1:10.000 in 1x DPBS e seminare le perle da 100 nm sullo stesso tipo di piatto utilizzato per le misurazioni SMLM.
    NOTA: Utilizzare solo la migliore qualità ottica e specifiche come i vetrini coprioggetti #1.5.
  2. Montare il piatto di calibrazione sul microscopio; Registra le pile di immagini attraverso il piano focale delle perline (~1,5 μm in totale; 10 nm di passi utilizzati qui)15.
  3. Trasferire i dati al computer di analisi dei dati.
    NOTA: Non conservare e utilizzare i vetrini di calibrazione per un lungo periodo di tempo.

6. Trattamento dei dati SMLM

NOTA: Il plug-in ImageJ23 "ThunderSTORM"24 è stato utilizzato per la registrazione delle localizzazioni (ad esempio, la conversione dei punti lampeggianti nella pila di immagini in un elenco contenente le coordinate di localizzazione, il numero di fotogramma, ecc.). ImageJ o Fiji25 funziona su tutti i principali sistemi operativi desktop (Linux/Windows/macOS) e può essere scaricato e utilizzato gratuitamente.

  1. Per utilizzare ThunderSTORM in FijI, assicurati di aggiungere il sito di aggiornamento del laboratorio Hohlbein in AIUTO | Aggiornamento | Gestisci i siti di aggiornamento, seleziona la casella di controllo per il laboratorio Hohlbein e riavvia le Fiji. Assicurarsi che il programma disponga di una quantità sufficiente di memoria.
    NOTA: I dati dell'immagine devono essere in un formato di file che possa essere letto da ImageJ/Fiji. Quando si registrano i dati su un sistema commerciale standard, aprire direttamente i dati utilizzando il plug-in Bio-Formats per ImageJ (fornito automaticamente con Fiji). In questo caso, è stato utilizzato uno script MATLAB h52tif.m (fornito nella pagina GitHub menzionata all'inizio del protocollo) per convertire i dati registrati registrati dal nostro set-up personalizzato dal formato hdf5 al formato TIFF.
    1. A seconda della quantità di memoria disponibile sul sistema utilizzato e del numero di fotogrammi da registrare, suddividere i dati in diversi sottostack per evitare di esaurire la memoria.
      NOTA: Di seguito, vengono utilizzate le impostazioni utilizzate per l'estrazione dei dati mostrati nella sezione dei risultati. Per una spiegazione più dettagliata delle impostazioni di ThunderSTORM, fare riferimento ai tutorial di ThunderSTORM, che possono essere trovati online.
  2. Ottimizza le impostazioni per il rilevamento dei segnali lampeggianti adattando le impostazioni di ThunderSTORM in base alle condizioni di registrazione desiderate. Clicca su ThunderSTORM | Eseguire l'analisi, scegliere Configurazione fotocamera e immettere la dimensione corretta dei pixel dei dati dell'immagine, il conteggio A/D, l'efficienza quantistica della fotocamera utilizzata, il livello di base e il guadagno EM (per questa configurazione, dimensione dei pixel: 65 nm, conteggio A/D: 0,64, efficienza quantistica: 0,8).
  3. Quindi, scegli l'algoritmo per determinare le coordinate di localizzazione adattando i segnali lampeggianti. Nella sezione Filtro immagini , utilizzare il filtro Wavelet (B-Spline) con un ordine B-Spline 3 e una scala B-Spline 2.0. Per le altre impostazioni, impostare Metodo di localizzazione approssimativa delle molecole su Massimo locale, Soglia di intensità di picco su 2*std(Wave.F1) e Connettività su 8-neighborhood. Nella sezione Localizzazione sub-pixel delle molecole , scegli PSF: Gaussiana integrata, Raggio di adattamento [px]: 3, Metodo di adattamento: Massima verosimiglianza e Sigma iniziale [px]: 1,6.
  4. Eseguire il plug-in per creare una tabella contenente una voce per ogni localizzazione rilevata e le relative proprietà. Salvare la tabella sul disco rigido.
  5. Se è necessario analizzare più stack di immagini o suddividere gli stack di immagini in più stack (ad esempio, per consentire l'analisi di set di dati di grandi dimensioni o nel caso in cui non sia disponibile molta memoria nel computer di analisi dei dati), automatizzare il rilevamento della localizzazione eseguendo una macro.
  6. Se i dati di acquisizione devono essere partizionati in più stack di immagini, concatenare le tabelle di localizzazione in ThunderSTORM importando un file dopo l'altro. Assicurarsi che l'opzione Aggiungi alla tabella corrente del menu Importa sia attivata e che venga utilizzato il numero iniziale corretto per evitare di sovrascrivere le localizzazioni nella tabella.
  7. Una volta generata la tabella di localizzazione completa, controllare il risultato ricostruendo l'immagine dalle posizioni nella tabella dei risultati. Premere il pulsante Visualizzazione nella finestra dei risultati di ThunderSTORM e attendere che appaia l'immagine ricostruita (ad esempio, l'istogramma delle localizzazioni).
  8. Controllare l'immagine ricostruita per problemi come la deriva laterale e altri artefatti di imaging. Misurare e correggere la deriva nel sottomenu Deriva determinando la correlazione incrociata delle sottosezioni sommate dello stack di dati (utilizzato qui) o utilizzando i marcatori fiduciali nel campione. Dopo aver premuto il menu >> , inserire 5 contenitori e il fattore di ingrandimento (6,5 in questo protocollo). Attendi che appaia una finestra che mostri la deriva x e y.
    NOTA: Le prime immagini dopo la registrazione potrebbero ancora soffrire di una forte fluorescenza di fondo (mentre portano i fluorofori allo stato di oscurità); quindi, può essere necessario escludere le prime duecento immagini dall'analisi (ad esempio, digitare "fotogramma >500" nel campo Filtro nella finestra principale di ThunderSTORM).
  9. Per evitare di sovrastimare i segnali visibili su più fotogrammi consecutivi, applicare l'unione ai dati di localizzazione utilizzando un raggio che consideri la precisione media di localizzazione (20 nm qui), 1 dark frame e 0 fotogrammi massimi (nessuna restrizione sul tempo di accensione massimo di una molecola).
  10. Se è necessario analizzare solo una sezione ultrasottile ottica a luce sottile, escludere dal set di dati tutte le localizzazioni sopra e sotto il piano focale. Innanzitutto, cerca il punto in z che contiene la maggior parte delle localizzazioni premendo Traccia istogramma nella finestra contenente la tabella dei risultati, quindi elimina le localizzazioni 50 nm sopra e sotto questo punto utilizzando il comando di filtraggio:
    Z > "Picco dell'istogramma" - 50 & Z < "Picco dell'istogramma" + 50
  11. Per determinare la frazione di DNA nella sezione registrata, determinare le localizzazioni in ciascun piano della pila di immagini (spessore 200 nm; 100 nm su ciascun lato) registrate al punto 4.7.1. Aprire la prima tabella dei risultati di localizzazione dello stack scegliendo i plug-in | Tempesta di tuono | Importazione/Esportazione | Importa i risultati e filtra ogni sezione registrata a 200 nm. Per questo, fai clic su Applica dopo aver digitato nel campo del filtro:
    Z > -100 e Z < 100
  12. Fare clic su Visualizzazione e scegliere l'opzione Istogrammi per generare un'immagine di ogni fetta. Salvate l'immagine risultante in una cartella in formato TIFF. Chiudi tutte le immagini aperte. Ripetere l'operazione per tutti i piani dell'immagine.
  13. Apri tutte le sezioni e combinale utilizzando Immagine | Pile | Immagini da impilare. Scegli l'immagine | Pile | Z-Project e scegli l'opzione Somma . Aprire ROI Manager in ImageJ (Analizza | Strumenti | ROI-Manager); quindi, scegli lo strumento di selezione poligonale dalla barra degli strumenti ImageJ nella finestra principale di ImageJ e delinea il nucleo. Fai clic su Aggiungi nel ROI-Manager.
    1. Fare clic su Analizza | Impostare Misure e selezionare Densità integrata. Fare clic su Analizza | Misurare. In ThunderSTORM, aprire la tabella dei risultati del piano centrale come descritto sopra e filtrarla a uno spessore di 100 nm utilizzando il seguente comando nel campo del filtro:
      Z > -50 & Z < 50
  14. Generare un istogramma delle localizzazioni filtrate come descritto sopra, attivare il ROI definito selezionandolo nel ROI Manager e cliccare su Analizza | Misurare.
  15. Determinare la frazione delle localizzazioni nella sezione centrale spessa 100 nm rispetto al numero totale di localizzazioni dividendo le densità integrate misurate, il fattore di conversione necessario nel passaggio 8.2 per calcolare le densità assolute del DNA.
    NOTA: Il contenuto di DNA è proporzionale al numero di localizzazioni. Per stimare la frazione di DNA nell'immagine a super-risoluzione (sezione centrale) è quindi sufficiente determinare il numero totale di localizzazioni in tutto il volume dell'intero nucleo e determinare il numero totale di localizzazioni nella sezione di interesse. Ciò può essere ottenuto generando istogrammi 2D delle localizzazioni.

7. Calibrazione Z del microscopio SMLM

  1. Apri le pile di immagini registrate nella sezione 5 nelle Figi.
  2. Nel menu del plugin ThunderSTORM, selezionare il sottomenu Calibrazione 3D | Calibrazione delle lenti cilindriche.
  3. Inserire la dimensione del passo utilizzato per registrare i dati di calibrazione (10 nm) e definire l'area della pila di immagini che verrà utilizzata per la calibrazione.
  4. Specificare una posizione in cui salvare il file di calibrazione.
  5. Utilizzare i dati di calibrazione nella finestra di dialogo Esegui analisi selezionando PSF: Gaussiana ellittica (astigmatismo 3D) nel pannello Localizzazione sub-pixel delle molecole e regolando il percorso del file al file di calibrazione creato nella sezione 5.

8. Tassellatura Voronoi

NOTA: Una volta che la tabella di localizzazione è stata generata e curata, procedere all'ultimo passaggio dell'analisi dell'immagine: la tassellatura Voronoi. Usa MATLAB 2021 per questo passaggio; gli script MATLAB fanno parte del pacchetto software "Localization Analyzer for Nanoscale Distributions" (LAND) e possono essere scaricati dai link presenti nella Tabella dei Materiali. Analogamente alla registrazione dei dati e alla generazione della tabella di localizzazione, è importante utilizzare un sistema ben dotato di memoria e potenza di elaborazione. Il sistema utilizzato per generare le immagini per questa pubblicazione è stato dotato di 128 GB di RAM e di una CPU Intel i9 a 9 core.

  1. Converti la tabella di localizzazione ThunderSTORM dal formato .csv al formato Orte eseguendo lo script MATLAB "TS2Orte.m", che trasforma la tabella di localizzazione in una matrice MATLAB e la salva nel formato ".mat".
  2. Una volta che i dati sono nel formato corretto, inizia i preparativi per la tassellatura di Voronoi e il calcolo della densità del DNA. Calcolare il fattore di conversione dividendo il numero di coppie di basi nel nucleo per il numero relativo di localizzazioni nella sezione fotografata rispetto al volume (vedi passaggio 6.15). Andare nella cartella LAND-Voronoi e nella sottocartella /coreAlgorithm , aprire il file voronoiCluster.m e regolare il fattore di conversione per i calcoli della densità assoluta alla riga 13.
    NOTA: Vedere la Figura 5 per un esempio del nucleo HeLa G1 ; È stato misurato un fattore di conversione di 265.
  3. Modifica lo script che avvia l'analisi "VonoRoi.m". Regolare il percorso del file per i dati di localizzazione Orte e la cartella di output per i file dei risultati. Nell'elenco delle coordinate, specificare le coordinate che definiscono l'area in cui deve essere eseguita la tassellatura. Poiché la tassellatura Voronoi può richiedere molto tempo per il calcolo (a seconda delle specifiche della macchina utilizzata), definire più aree da calcolare all'interno dello stesso set di dati di input.
  4. Dopo aver eseguito lo script, cerca l'immagine che mostra le densità assolute del DNA insieme ad altri file contenenti grafici che mostrano l'istogramma della distribuzione dell'area e un file "densities.mat" contenente le densità di ogni singola cella di Voronoi calcolata nella cartella di output.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il nucleo HeLa mostrato in Figura 5 è stato scelto dalla tabella generata da CellProfiler4.2.1 nella sezione 3 per avere un'intensità di fluorescenza integrata vicina al primo picco nell'istogramma mostrato in Figura 5 che rappresenta i nuclei nella fase G1 . Date le sue piccole dimensioni e la struttura interna pronunciata, è probabile che si tratti di un nucleo G1 precoce che è ancora in fase di decondens...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo illustra come misurare le densità assolute del DNA nei nuclei delle cellule di mammifero utilizzando l'SMLM. Inoltre, abbiamo dimostrato come determinare lo stadio del ciclo cellulare delle cellule in coltura e come utilizzare queste informazioni per stimare la quantità di DNA presente in una sezione ottica ultrasottile leggera. Vengono inoltre descritte in dettaglio la preparazione di cellule aderenti per la microscopia fBALM SMLM e come elaborare i dati SMLM per generar...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo la Dott.ssa Sandra Ritz per averci permesso di utilizzare l'IMB Imaging Core Facility, la Dott.ssa Shih-Ya Chen per averci permesso di utilizzare il suo microscopio SMLM personalizzato, il Dott. Leonard Kubben (IMB) per la fornitura di fibroblasti umani, il Dott. Christof Niehrs (IMB) per la fornitura della linea cellulare C3H10T1/2 e il Dott. Jan Neumann per lo script MATLAB che abbiamo modificato per questo lavoro. Vogliamo anche ringraziare la Dott.ssa Marion Cremer, il Dott. Thomas Cremer e il Dott. Christoph Cremer per le fruttuose discussioni.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Coltura cellulare
µ-Dish 35 mm, alto Grid-500 Fondo in vetroIbidi81168
C3H 10T1/2IMB (Laboratorio Niehrs)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSLife Technologies16000-044
HelaStruttura Centrale di Microscopia (IMB)
HFBIMB (Laboratorio Kubben)
L-GlutamminaSigma-AldrichG7513
Amminoacidi e vitamine non essenziali per l'HFB
Piruvato di sodioS8636
Preparazione del campione
CatalasiMerck2593710
GlucosioThermoFisher241922500
Glucosio ossidasiMerck49180
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127
RNase CocktailThermoFisherAM2286
SYTOX OrangeThermoFisherS11368
Kit campionatore per microsfere fluorescenti TetraSpeckThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
Software
BioFormatiOpenMicroscopy.orgSoftware open source https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgsoftware open source https://cellprofiler.org
Figinih.govsoftware open source https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
TERRAnih.govSoftware open source https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Matematica Workssoftware commerciale - richiede "Image Processing Toolbox"
R v.4.. 0.3r-project.orgSoftware open source https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3Software open source https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Microscopi:
AF 7000Leica
Leica GSDLeica
Microscopio SMLMLaboratorio Cremercostruita su misura dal dottor S-Y. Chen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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