Articolo metodologico

Purificazione dei polisomi dai noduli simbiotici di soia

DOI:

10.3791/64269

⸱

1 luglio 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, 2Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology, University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo per la purificazione dei polisomi eucariotici da noduli di soia intatti. Dopo il sequenziamento, le pipeline standard per l'analisi dell'espressione genica possono essere utilizzate per identificare geni differenzialmente espressi a livello di trascrittoma e translatoma.

Abstract

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Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una strategia per lo studio del translatoma eucariotico del nodulo simbiotico di soia (Glycine max). Questo articolo descrive metodi ottimizzati per isolare i poliribosomi di origine vegetale e i loro mRNA associati da analizzare utilizzando il sequenziamento dell'RNA. In primo luogo, i lisati citoplasmatici sono ottenuti attraverso l'omogeneizzazione in condizioni di conservazione di polisomi e RNA da noduli di soia interi e congelati. Quindi, i lisati vengono eliminati mediante centrifugazione a bassa velocità e il 15% del surnatante viene utilizzato per l'isolamento totale dell'RNA (TOTAL). Il restante lisato eliminato viene utilizzato per isolare i polisomi mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio a due strati (12% e 33,5%). L'mRNA associato ai polisomi (PAR) viene purificato dai pellet polisomiali dopo la risospensione. Sia TOTAL che PAR sono valutati mediante elettroforesi capillare altamente sensibile per soddisfare gli standard di qualità delle librerie di sequenziamento per RNA-seq. Come esempio di applicazione a valle, dopo il sequenziamento, è possibile utilizzare pipeline standard per l'analisi dell'espressione genica per ottenere geni differenzialmente espressi a livello di trascrittoma e translatoma. In sintesi, questo metodo, in combinazione con RNA-seq, permette lo studio della regolazione traslazionale degli mRNA eucariotici in un tessuto complesso come il nodulo simbiotico.

Introduzione

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Le leguminose, come la soia (Glycine max), possono stabilire simbiosi con specifici batteri del suolo chiamati rizobia. Questa relazione mutualistica provoca la formazione di nuovi organi, i noduli simbiotici, sulle radici delle piante. I noduli sono gli organi vegetali che ospitano i batteri e sono costituiti da cellule ospiti il cui citoplasma è colonizzato con una forma specializzata di rizobia chiamata batterioidi. Questi batterioidi catalizzano la riduzione dell'azoto atmosferico (N 2) in ammoniaca, che viene trasferita alla pianta in cambio di carboidrati 1,2.

Sebbene questa simbiosi azotofissatrice sia una delle simbiosi pianta-microbo più studiate, molti aspetti rimangono da comprendere meglio, come il modo in cui le piante sottoposte a diverse condizioni di stress abiotico modulano la loro interazione con il loro partner simbiotico e come questo influisce sul metabolismo dei noduli. Questi processi potrebbero essere meglio compresi analizzando il translatoma dei noduli (cioè, il sottoinsieme di RNA messaggeri [mRNA] attivamente tradotti). I poliribosomi o polisomi sono complessi di ribosomi multipli associati all'mRNA, comunemente usati per studiare la traduzione3. Il metodo di profilazione dei polisomi consiste nell'analisi degli mRNA associati ai polisomi ed è stato utilizzato con successo per studiare i meccanismi posttrascrizionali che controllano l'espressione genica che avviene in diversi processi biologici 4,5.

Storicamente, l'analisi dell'espressione del genoma si è concentrata principalmente sulla determinazione dell'abbondanza di mRNA 6,7,8,9. Tuttavia, vi è una mancanza di correlazione tra i livelli di trascrizione e proteina a causa delle diverse fasi di regolazione posttrascrizionale dell'espressione genica, in particolare la traduzione10,11,12. Inoltre, non è stata osservata alcuna dipendenza tra i cambiamenti a livello del trascrittoma e quelli che si verificano a livello del translatoma13. L'analisi diretta dell'insieme di mRNA che vengono tradotti consente una misura più accurata e completa dell'espressione genica cellulare (il cui endpoint è l'abbondanza proteica) rispetto a quella ottenuta quando vengono analizzati solo i livelli di mRNA14,15,16.

Questo protocollo descrive come i polisomi di origine vegetale vengono purificati dai noduli di soia intatti mediante centrifugazione differenziale attraverso un cuscino di saccarosio a due strati (Figura 1). Tuttavia, poiché nei noduli sono presenti anche ribosomi di derivazione batterioide, viene purificato un mix di ribosomi e specie di RNA, anche se quelli eucariotici rappresentano la frazione principale (90%-95%). Vengono inoltre descritti il successivo isolamento, quantificazione e controllo di qualità dell'RNA (Figura 1). Questo protocollo, in combinazione con RNA-seq, dovrebbe fornire risultati sperimentali sulla regolazione traslazionale degli mRNA eucariotici in un tessuto complesso come il nodulo simbiotico.

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Figura 1: Panoramica schematica della metodologia proposta per la purificazione dei polisomi eucariotici da noduli simbiotici. Lo schema fornisce una panoramica delle fasi seguite nel protocollo da (1) crescita delle piante e (2) raccolta di noduli a (3) preparazione degli estratti citosolici, (3) ottenimento di campioni TOTAL e (4) campioni PAR e (5) estrazione dell'RNA e controllo di qualità. Abbreviazioni: PEB = tampone di estrazione dei polisomi; RB = buffer di risospensione; TOTALE = RNA totale; PAR = mRNA associato ai polisomi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Protocollo

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1. Crescita delle piante e inoculazione dei rizobi

  1. Per generare i noduli necessari, seminare i semi di soia scelti nel substrato selezionato in una camera di crescita in condizioni controllate.
    NOTA: In questo protocollo, i semi sono stati seminati in una bottiglia di plastica da 0,5 L riempita con una miscela di sabbia: vermiculite (1: 1). La camera di crescita è stata impostata con una temperatura del ciclo giorno/notte di 28 °C / 20 °C, rispettivamente, e un fotoperiodo luce/oscurità di 16 h/8 h, rispettivamente. L'intensità della radiazione fotosinteticamente attiva era di 620 μmol·m−2·s−1.
  2. Preparare in anticipo il mezzo liquido di estratto di lievito mannitolo (YEM) (vedere la tabella dei materiali). Autoclave il mezzo.
  3. Lo stesso giorno della semina, inoculare un matraccio contenente 100 mL di YEM con il ceppo Bradyrhizobium elkanii U1302. Incubare il matraccio a 28 °C su un agitatore orbitale a 100 giri/min.
    1. Lascia crescere la rizobia per 2 giorni e inocula le piantine con 2 ml di coltura.

2. Trattamento del deficit idrico (facoltativo)

NOTA: Questo protocollo delinea il trattamento del deficit idrico delle piante di soia. Questa parte può essere modificata o omessa completamente a seconda della domanda sperimentale in questione.

  1. Coltiva le piantine di soia per 19 giorni (stadio di sviluppo V2-3) senza restrizioni idriche. Mantenere il substrato alla capacità del campo con B&D-medium17 integrato con 0,5 mM KNO3.
  2. Il giorno 20, ritirare l'irrigazione.
    NOTA: Qui, il contenuto di acqua è stato misurato quotidianamente dalla gravimetria (contenuto gravimetrico dell'acqua) durante i periodi di crescita e deficit idrico.
  3. Misurare la conduttanza stomatica in triplice copia giornalmente sulla superficie fogliare abassiale con un porometro, come indicato dal produttore (vedi la tabella dei materiali), dal giorno 20 fino alla fine del periodo di deficit idrico.
    NOTA: La fine del periodo di deficit idrico è stata determinata individualmente per ogni pianta quando il valore di conduttanza stomatica era circa il 50% di quello ottenuto il giorno 20 dalla semina.

3. Raccolta dei noduli

  1. Raccogliere l'azoto liquido in un contenitore pulito ed etichettare tubi da 15 ml (uno per ogni pianta).
    ATTENZIONE: Maneggiare azoto liquido indossando guanti criogenici, schermi facciali e occhiali di sicurezza.
  2. Recupera ogni pianta individualmente. Tagliare e scartare la parte aerea. Lavare accuratamente la radice con acqua per rimuovere qualsiasi substrato rimanente.
  3. Staccare ogni nodulo dalla radice e raccoglierli in un tubo da 15 ml prerefrigerato. Congelare a scatto i tubi e conservarli a -80 °C.

4. Preparazione di estratti citosolici

NOTA: Lo scopo finale di questo protocollo è quello di ottenere RNA totale di alta qualità (TOTAL) e RNA associato ai polisomi (PAR). Pertanto, lavorare in condizioni che impediscano la degradazione dell'RNA, mantenendo sempre i campioni a 4 °C e utilizzando apparecchiature e soluzioni di laboratorio prive di RNasi. Se non diversamente specificato, tutte le soluzioni sono preparate con acqua ultrapura sterile.

  1. Preparazione di soluzioni tampone
    1. Preparare le soluzioni madre autoclavabili elencate nella Tabella 1, sterilizzarle in autoclave per 15 minuti e conservare a RT.
    2. Preparare le soluzioni madre sterilizzabili con filtro elencate nella Tabella 1, sterilizzarle con filtro e mantenerle a -20 °C.
  2. Preparare il tampone di estrazione dei polisomi (PEB, vedere Tabella 1) e tenerlo in ghiaccio.
    NOTA: I volumi indicati si riferiscono a sei campioni.
  3. Raffreddare la centrifuga a 4 °C e posizionare 2 mL di provette di microcentrifuga su ghiaccio.
  4. Pesare circa 0,2 g di noduli intatti in un piatto di pesata e trasferirli in un tubo da 2 ml preraffreddato.
    NOTA: eseguire rapidamente questo passaggio per evitare lo scongelamento dei campioni. In alternativa, è possibile utilizzare un volume stimato di noduli di 0,4-0,5 ml invece di 0,2 g.
  5. Aggiungere 1,2 ml di PEB, lasciare scongelare il campione per 2 minuti e omogeneizzare con una smerigliatrice di tessuto fino alla completa rottura e omogeneizzazione dei noduli.
    NOTA: Assicurarsi di macinare i noduli una volta scongelati in quanto saranno abbastanza morbidi da essere facilmente interrotti con le smerigliatrici di tessuto (vedere la tabella dei materiali) in tubi di microcentrifuga. I noduli congelati sono difficili da macinare. Inoltre, si consiglia di posizionare i tubi in un dispositivo di raffreddamento da banco (0 °C) per una corretta omogeneizzazione mantenendo i campioni freschi.
  6. Incubare i campioni su ghiaccio agitando delicatamente per 10 minuti o fino a quando tutti i campioni sono stati elaborati.
  7. Centrifugare a 16.000 × g per 15 minuti a 4 °C per pellettare i detriti. Recuperare il surnatante e ripetere la fase della centrifuga.
  8. Recuperare accuratamente l'estratto citosolico chiarificato e trasferire un'aliquota da 200 μL in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL per l'isolamento TOTALE (campioni TOTALI; vedere paragrafo 7).

5. Preparazione dei cuscini di saccarosio

NOTA: Questo protocollo utilizza un cuscino di saccarosio a due strati (12% e 33,5%) in provette da ultracentrifuga da 13,2 ml (vedere la tabella dei materiali). Tutte le soluzioni sono preparate con acqua ultrapura sterile.

  1. Preparare le soluzioni di brodo di saccarosio e sale.
    1. Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio 2 M (68,5%, Tabella 1).
    2. Preparare una soluzione salina 10x (Tabella 1).
  2. Preparare i due strati del cuscino di saccarosio come descritto nella tabella 2. Vedere la Tabella 1 per la composizione delle soluzioni madre di antibiotici (CHX e CHL).
    NOTA: I volumi indicati sono per sei cuscini.
  3. Versare 4,5 mL dello strato di saccarosio al 33,5% nelle provette della centrifuga. Quindi, aggiungere 4,5 ml dello strato al 12% con attenzione e lentamente con una micropipetta P1000. Mettere i tubi sul ghiaccio fino all'aggiunta dell'estratto citosolico chiarificato.

6. Purificazione dei polisomi

  1. Caricare 1 mL dell'estratto citosolico chiarificato (punto 4.8) sopra il cuscino di saccarosio mediante pipettaggio accurato sulla parete laterale del tubo.
  2. Trasferire i tubi dell'ultracentrifuga in secchi preraffreddati e centrifugare a 217.874 × g (35.000 giri/min nel rotore di riferimento [vedere la tabella dei materiali]) per 2 ore a 4 °C.
  3. Eliminare l'estratto citosolico rimanente e il cuscino di saccarosio e risospendere il pellet polisomiale con 200 μL di RB preraffreddato (precedentemente preparato secondo la Tabella 1).
  4. Incubare per 30 minuti su ghiaccio e quindi trasferire la risospensione polisomiale in tubi preraffreddati da 1,5 ml. Procedere con l'estrazione dell'RNA (campioni PAR).

7. Estrazione dell'RNA e controllo di qualità

NOTA: questo passaggio viene eseguito per i campioni TOTAL (passaggio 4.8) e PAR (passaggio 6.4).

  1. Preparare il 75% di EtOH con acqua ultrapura sterile e raffreddarlo a -20 °C. Inoltre, raffreddare il cloroformio e l'isopropanolo a -20 °C.
  2. Omogeneizzare i campioni con 750 μL del reagente di isolamento dell'RNA e incubare per 5 minuti a RT.
  3. Aggiungere 200 μL di cloroformio freddo e agitare vigorosamente i tubi per 15 s. Incubare a RT per 10 min.
  4. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per la separazione di fase. Trasferire 500 μL della fase acquosa superiore in un tubo pulito senza disturbare la fase organica rosa e aggiungere 375 μL di isopropanolo freddo e 0,5 μL di glicogeno privo di RNasi (vedere la tabella dei materiali). Mescolare accuratamente pipettando su e giù.
    NOTA: Il glicogeno è un vettore utilizzato come co-precipitante per aumentare il recupero dell'acido nucleico dalla precipitazione dell'alcol.
  5. Incubare la miscela per 10 minuti a 4 °C e centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti. Scartare il surnatante.
  6. Lavare il precipitato di RNA con 1 mL di freddo 75% EtOH. Mescolare per breve vortice.
    NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a -20 °C durante la notte.
  7. Centrifugare a 7.500 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere accuratamente il surnatante con una micropipetta e asciugare all'aria il pellet di RNA.
  8. Sciogliere il pellet in 50 μL di acqua priva di RNasi e incubare a 65 °C per 5 minuti.
  9. Valutare la concentrazione e l'integrità dell'RNA con elettroforesi capillare18 altamente sensibile (vedere la Tabella dei Materiali) e/o elettroforesi su un gel di agarosio19 privo di RNasi al 2% (vedere la Tabella dei Materiali).
    NOTA: Se i campioni di RNA non verranno utilizzati immediatamente o verranno inviati alla struttura di sequenziamento per la preparazione della libreria RNA-seq, si consiglia di utilizzare EtOH per precipitarli.

8. Precipitazione dell'RNA

  1. Raffreddare la centrifuga e l'EtOH a 4 °C.
  2. Preparare l'acetato di sodio 3 M.
  3. Preparare il 70% di EtOH con acqua ultrapura sterile e raffreddarlo a -20 °C.
  4. Stimare il volume del campione. Aggiungere 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M, 3 volumi di EtOH freddo e 0,5 μL di glicogeno privo di RNasi. Mescolare accuratamente.
  5. Lasciare a -20 °C fino al momento del bisogno.
    NOTA: i campioni precipitati di RNA possono essere conservati fino a 1 anno a -80 °C.

9. Pipeline standard per l'analisi dell'espressione genica

  1. Esegui una media di 40 milioni di letture Illumina paired-end, con lunghezza di lettura >100 bp, per un'analisi sicura dei dati di trascrittoma e trascrittoma.
    NOTA: L'analisi standard dei dati RNA-seq include i seguenti passaggi 9.2-9.5.
  2. Eseguire l'ispezione di qualità di lettura utilizzando FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) o MultiQC20 multicampione.
  3. Rimuovi l'adattatore e le sequenze di bassa qualità utilizzando Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt 22, sickle23 o Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), tra gli altri.
  4. Se è disponibile un genoma di riferimento per la specie, eseguire la mappatura di lettura rispetto al riferimento, seguita dalla quantificazione dell'abbondanza, utilizzando Bowtie224, TopHat2 25 o Salmon 26 e featureCounts27, oltre ad altri strumenti open source.
  5. Eseguire analisi statistiche per l'identificazione differenziale dei geni espressi utilizzando edgeR28, DESeq229 o limma30, tra gli altri.
    NOTA: questi software open source possono essere utilizzati localmente, tramite la riga di comando. In alternativa, possono essere gestiti tramite un browser Web su un server pubblico, come Galaxy31 o GEOexplorer32, che offrono un'interfaccia utente grafica, in modo che non sia richiesta alcuna conoscenza della riga di comando per il loro utilizzo.

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Risultati

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La valutazione quantitativa e qualitativa delle frazioni TOTAL e PAR purificate con la procedura sopra menzionata è fondamentale per determinarne il successo, poiché per la maggior parte delle applicazioni a valle, come il sequenziamento dell'RNA, campioni di alta qualità sono fondamentali per la preparazione e il sequenziamento della libreria. Inoltre, l'integrità delle molecole di RNA consente la cattura di un'istantanea del profilo di espressione genica al momento della raccolta del campione18....

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Discussione

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Studiare la regolazione dell'espressione genica a livello traslazionale è fondamentale per comprendere meglio i diversi processi biologici poiché l'endpoint dell'espressione genica cellulare è l'abbondanza proteica13,14. Questo può essere valutato analizzando il translatoma del tessuto o dell'organismo di interesse per il quale la frazione polisomiale deve essere purificata e i suoi mRNA associati analizzati 3,4,34,35,36.

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dalla sovvenzione CSIC I + D 2020 n. 282, dalla sovvenzione FVF 2017 n. 210 e PEDECIBA (María Martha Sainz).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Crescita delle piante e inoculazione dei rizobi
Agitatore orbitaleDaihan ScientificModel SHO-1D
YEM-mediumAmrescoJ850 (estratto di lievito) 0122 (mannitolo)
Trattamento del deficit idrico
KNO3Merck
PorometroDecagone DispositivoModello SC-1
Bisturi
Preparazione di estratti citosolici
Brij L23Sigma-AldrichP1254
CentrifugaSigmaModello 2K15
CloranfenicoloSigma-AldrichC0378
CicloesimideSigma-AldrichC7698
DOCSigma-Aldrich30970
DTTSigma-AldrichD9779
EGTASigma-AldrichE3889
Igepal CA 360Sigma-AldrichI8896
KClMerck1.04936
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Smerigliatrice per tessuti in plasticaFisher Scientific12649595
PMSFSigma-AldrichP7626
PTESigma-AldrichP2393
TrisInvitrogen15504-020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Piatto di pesata Deltalab1911103
Preparazione di cuscini di saccarosio
SucroseInvitrogen15503022
rotore SW 40 TiUltracentrifuga Beckman-Coulter
ProvetteBeckman-CoulterOptima L-100K
344059Provette da 13,2 mL
Estrazione e controllo qualità dell'RNA
AgaroseThermo scientificR0492
BioanalizzatoreAgilentModello 2100. Nano saggio dell'RNA totale eucariote
CloroformioDI41191
EtanoloDorwilUN1170
IsopropanoloMallinckrodt3032-06
GlicogenoSigma10814-010
TRIzol LSAmbion102960028
Varie
Provette Falcon 15 mLBiologix10-0152
Puntali filtranti 10 &; LBioPointe Scientific321-4050
Puntali filtranti 1000 &; micro; LBioPointe Scientific361-1050
Puntali filtranti 20 &; micro; LBioPointe Scientific341-4050
Puntali filtranti 200 & micro; LTarsons528104
Provette per microcentrifuga 1,5 mLTarsons500010-N
Provette per microcentrifuga 2,0 mLTarsons500020-N
Azienda di sequenziamentoMacrogen
Sterile 250 mL palloneMarienfeld4110207
221295 per ultracentrifuga

Riferimenti

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