Presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura e l'imaging di embrioni di topo che consente l'imaging 3D + tempo delle cellule progenitrici cardiache. Questo video-toolkit affronta le competenze chiave necessarie per immagini live di successo altrimenti difficili da acquisire da pubblicazioni di solo testo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Imaging dal vivo dei primi progenitori cardiaci nell'embrione di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
I primi passi dello sviluppo del cuore implicano drastici cambiamenti nel comportamento e nella differenziazione cellulare. Mentre l'analisi degli embrioni fissi consente di studiare in dettaglio specifiche fasi di sviluppo in un'istantanea fissa, l'imaging dal vivo cattura eventi morfogenetici dinamici, come la migrazione cellulare, i cambiamenti di forma e la differenziazione, visualizzando l'embrione mentre si sviluppa. Questo integra l'analisi fissa e amplia la comprensione di come gli organi si sviluppano durante l'embriogenesi. Nonostante i suoi vantaggi, l'imaging dal vivo è raramente utilizzato nei modelli murini a causa delle sue sfide tecniche. I primi embrioni di topo sono sensibili se coltivati ex vivo e richiedono una manipolazione efficiente. Per facilitare un uso più ampio dell'imaging dal vivo nella ricerca sullo sviluppo del topo, questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la microscopia viva a due fotoni che consente l'acquisizione a lungo termine negli embrioni di topo. Oltre al protocollo, vengono forniti suggerimenti sulla gestione degli embrioni e sull'ottimizzazione della coltura. Ciò aiuterà a comprendere gli eventi chiave nell'organogenesi precoce del topo, migliorando la comprensione della biologia dei progenitori cardiovascolari.
Introduzione
Il cuore si forma presto durante l'embriogenesi per iniziare a pompare sostanze nutritive all'intero embrione, mentre continua a svilupparsi1. Negli embrioni di topo, un giorno e mezzo dopo l'inizio della gastrulazione, un organo cardiaco rudimentale si assembla al polo anteriore 2,3. Allo stadio Early Streak (ES), i progenitori cardiaci nell'ingresso dell'epiblasto attraverso la striscia primitiva fino allo strato mesodermico nascente 4,5,6 e iniziano a migrare verso il polo anteriore, dove si differenziano per form....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale CNIC, dalla Comunità di Madrid (Riferimento PROEX 220/15) e conformi alla Direttiva UE 2010/63UE e alla Raccomandazione 2007/526/CE relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali e ad altri scopi scientifici, applicata dalla legge spagnola ai sensi del Real Decreto 1201/2005.
Questo protocollo include l'uso di due maschi della linea di topi transgenici fluorescenti che riportano l'attività NOTCH Tg (CBF: H2BVenus,+)18. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su materiali, an....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Abbiamo usato il protocollo per visualizzare l'attivazione della segnalazione NOTCH nei primi progenitori cardiaci in procinto di differenziarsi in cellule endoteliali durante la morfogenesi primitiva del tubo cardiaco. Per questo, abbiamo incrociato topi selvatici C57BL / 6-N con topi Tg (CBF: H2BVenus, +)18 per ottenere embrioni che riportavano attività NOTCH attraverso la proteina fluorescente gialla Venere. A E7.5, la fluorescenza di Venere è presente in tutto l'ectoderma neurale, con alcuni n.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I primi progenitori del cuore si organizzano in un tubo cardiaco primitivo che inizia a battere mentre si sta ancora formando. Capire come avviene questo processo è la chiave per individuare l'ampio spettro di difetti cardiaci congeniti a specifici eventi morfogenetici. Per questo, l'imaging dal vivo offre l'opportunità di studiare lo sviluppo embrionale normale e difettoso con una maggiore risoluzione temporale. Ciò è particolarmente utile per studiare le cellule progenitrici cardiache precoci mentre passano rapidamente.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il Dr. Kenzo Ivanovitch per il precedente lavoro su questo metodo e il gruppo del Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Giappone) per aver fornito le competenze iniziali sul montaggio degli embrioni. Questo studio è stato supportato da Grant PGC2018-096486-B-I00 del Ministerio de Ciencia e Innovación spagnolo e Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 dal programma Horizon 2020 dell'UE a MT e Grant 1380918 dal programma operativo FEDER Andalucía 2014-2020 a JND. MS è stata sostenuta da una borsa di dottorato della Fondazione La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) e dalla borsa di studio itinerante The Company of Biologists (DEVTF....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #55 Pinze | Dumont | 11295-51 | |
| Piatto da 35 mm con fondo in vetro vetrino 14 mm Diametro | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Tavolo morsa da 35 mm | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| Provette da 50 mL | BD Falcon | 352070 | |
| Acqua | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | con L-Glutammina, senza Glucosio, senza Na Piruvato |
| Fetale Siero Bovino | Invitrogen | 10438-026 | |
| Topi transgenici reporter fluorescenti (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM per l'imaging di cellule vive |
| Grasso siliconico per alto vuoto | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Supporto per fili | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Microscopio verticale | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser sintonizzato a 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors dotato dei set di filtri ciano-giallo (BP450-500/BP520-560), verde-rosso (BP500-520/BP570-610) e giallo-rosso (BP520-560/BP645-710) | Zeiss | ||
| Oggetto: 20x immersione in acqua 1.0 NA, lunga distanza di lavoro | Zeiss | ||
| Pipette P1000 e P200 Olio di | |||
| paraffina | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillina-streptomicina | Invitrogen | 15070-063 | (la concentrazione finale dovrebbe essere 50 μ g/mL di penicillina e 50 μ g/mL streptomicina) |
| Piastre di Petri 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Puntali | |||
| Polimetilmetacrilato | Riutilizzato da vecchie apparecchiature di laboratorio | ||
| Siero di ratto coltura embrione, ratti maschi SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set di multe da 160 mm | RS PRO | 541-6933 | |
| Capillari in vetro standard da 1,0 mm | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0,22 μ m filtro per siringa | Corning | 431218 | |
| Siringa sterile da 5 mL | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Aghi di | |||
| Omogeneizzatore ad ultrasuoni (sonicatore) | Bandelin | BASO_17021 |
Riferimenti
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113(2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
