Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa Cladonema. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero con un marcatore di cellule staminali consente il rilevamento di cellule staminali e la marcatura con 5-etinil-2'-deossiuridina consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Insieme, possono essere rilevate cellule staminali che proliferano attivamente.
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Articolo metodologico
Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli cnidiari, tra cui anemoni di mare, coralli e meduse, mostrano morfologie e stili di vita diversi che si manifestano in polipi sessili e meduse che nuotano liberamente. Come esemplificato in modelli consolidati come Hydra e Nematostella, le cellule staminali e/o le cellule proliferative contribuiscono allo sviluppo e alla rigenerazione dei polipi cnidariani. Tuttavia, i meccanismi cellulari sottostanti nella maggior parte delle meduse, in particolare allo stadio di medusa, sono in gran parte poco chiari e, quindi, lo sviluppo di un metodo robusto per identificare specifici tipi di cellule è fondamentale. Questo articolo descrive un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum. Cladonema medusae possiede tentacoli ramificati che crescono continuamente e mantengono la capacità rigenerativa durante la loro fase adulta, fornendo una piattaforma unica con cui studiare i meccanismi cellulari orchestrati da cellule proliferanti e / o staminali. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero (FISH) che utilizza un marcatore di cellule staminali consente la rilevazione di cellule staminali, mentre la marcatura a impulsi con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), un marcatore di fase S, consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Combinando sia l'etichettatura FISH che EdU, possiamo rilevare cellule staminali che proliferano attivamente su animali fissi e questa tecnica può essere ampiamente applicata ad altri animali, comprese le specie di meduse non modello.
Introduzione
Cnidaria è considerato un phylum metazoico basalmente ramificato contenente animali con nervi e muscoli, ponendoli in una posizione unica per comprendere l'evoluzione dello sviluppo animale e della fisiologia 1,2. Gli Cnidari sono classificati in due gruppi principali: gli antozoi (ad esempio, anemoni di mare e coralli) possiedono solo larve di planula e stadi di polipo sessili, mentre i Medusozoi (membri di Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa e Cubozoa) assumono tipicamente la forma di meduse che nuotano liberamente, o meduse, così come larve di planula e polipi. Gli Cnidari mostrano comunemente un'elevata capacit....
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Protocollo
NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo.
1. Sintesi della sonda
- Estrazione dell'RNA
- Posizionare tre meduse di Cladonema vive coltivate in acqua di mare artificiale (ASW) in una provetta da 1,5 ml utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 ml con la punta tagliata e rimuovere quanto più ASW possibile.
NOTA: ASW si prepara sciogliendo una miscela di sali minerali in acqua di rubinetto con neutralizzatore di cloro; il peso specifico finale (S.G.) è 1,018 o le parti per mi....
- Posizionare tre meduse di Cladonema vive coltivate in acqua di mare artificiale (ASW) in una provetta da 1,5 ml utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 ml con la punta tagliata e rimuovere quanto più ASW possibile.
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Risultati
I tentacoli Cladonema sono stati usati come modello per studiare i processi cellulari di morfogenesi e rigenerazione15,16,17. La struttura del tentacolo è composta da un tubo epiteliale in cui le cellule staminali, o i-cellule, si trovano nella regione prossimale, chiamata bulbo tentacolare, e nuovi rami vengono aggiunti sequenzialmente alla parte posteriore della regione distale del bulbo lungo il lato assiale (
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Discussione
Le cellule proliferanti e le cellule staminali sono importanti fonti cellulari in vari processi come la morfogenesi, la crescita e la rigenerazione21,22. Questo articolo descrive un metodo per co-colorare il marcatore di cellule staminali Nanos1 mediante marcatura FISH e EdU in Cladonema medusae. Lavori precedenti che utilizzano l'etichettatura EdU o BrdU hanno suggerito che le cellule proliferative si localizzano nei bulbi tentacolari
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da AMED con il numero di sovvenzione JP22gm6110025 (a Y.N.) e dal JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (a Y.N.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanolo | Wako | 137-06862 | |
| Pipetta di trasferimento da 3,1 mL | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 primer | 5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3' | ||
| Cladonema pacificum Nanos1 innesco | 5'-CGACGTCCAATTTTACGTGCT -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi primer | 5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi innesco | 5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3' | ||
| Kit di proliferazione cellulare Click-iT EdU per imaging, colorante Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C10337 | Kit EdU |
| Coroline off | GEX Co. ltd | Neutralizzatore di cloro | N/A |
| Kit di rilevamento dell'acido nucleico DIG Reagente bloccante | Roche | 11175041910 | tampone bloccante |
| Miscela di marcatura dell'RNA DIG | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS cella competente DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | cellula competente |
| Kit di estrazione Gel / PCR genico | veloce Gene veloce | FG-91302 | kit di estrazione su gel |
| Mini kit di plasmidi genici veloci | Gene veloce | FG-90502 | miniprep plasmidico |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Sale sodico di eparina da suino | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropil-beta;-D(-)-tiogalattopiranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | piastra di agar |
| LB Brodo Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medio |
| Acido maleico | Wako | 134-00495 | |
| mini colonne di RNA a rotazione rapida | Roche | 11814427001 | colonna di pulizia |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| Spettrofotometro UV-Vis a microvolume NanoDrop OneC con Wi-Fi | Thermo Scientific | Spettrofotometro | ND-ONEC-W |
| Poliossietilene (20) Monolaurato di sorbitano (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | omogeneizzatore |
| Proteinasi K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| Inibitore della RNasi | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | kit di isolamento dell'RNA totale |
| RQ1 Dnase senza RNasi | Promega | M6101 | |
| Soluzione salina Citrato di sodio Tampone 20x polvere (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A miscela | di sali minerali |
| T3 RNA polimerasi | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polimerasi | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Ibridatore |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polimerasi |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st filamento cDNA Kit di sintesi | TaKaRa | 6210A | |
| cDNA Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vettore |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tecnica di amplificazione del segnale di tiramide (TSA) |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | microscopio confocale a scansione laser |
Riferimenti
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire....
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Ristampe e permessi
