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Articolo metodologico

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum

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DOI:

10.3791/64285

⸱

3 agosto 2022

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa Cladonema. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero con un marcatore di cellule staminali consente il rilevamento di cellule staminali e la marcatura con 5-etinil-2'-deossiuridina consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Insieme, possono essere rilevate cellule staminali che proliferano attivamente.

Abstract

Gli cnidiari, tra cui anemoni di mare, coralli e meduse, mostrano morfologie e stili di vita diversi che si manifestano in polipi sessili e meduse che nuotano liberamente. Come esemplificato in modelli consolidati come Hydra e Nematostella, le cellule staminali e/o le cellule proliferative contribuiscono allo sviluppo e alla rigenerazione dei polipi cnidariani. Tuttavia, i meccanismi cellulari sottostanti nella maggior parte delle meduse, in particolare allo stadio di medusa, sono in gran parte poco chiari e, quindi, lo sviluppo di un metodo robusto per identificare specifici tipi di cellule è fondamentale. Questo articolo descrive un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum. Cladonema medusae possiede tentacoli ramificati che crescono continuamente e mantengono la capacità rigenerativa durante la loro fase adulta, fornendo una piattaforma unica con cui studiare i meccanismi cellulari orchestrati da cellule proliferanti e / o staminali. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero (FISH) che utilizza un marcatore di cellule staminali consente la rilevazione di cellule staminali, mentre la marcatura a impulsi con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), un marcatore di fase S, consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Combinando sia l'etichettatura FISH che EdU, possiamo rilevare cellule staminali che proliferano attivamente su animali fissi e questa tecnica può essere ampiamente applicata ad altri animali, comprese le specie di meduse non modello.

Introduzione

Cnidaria è considerato un phylum metazoico basalmente ramificato contenente animali con nervi e muscoli, ponendoli in una posizione unica per comprendere l'evoluzione dello sviluppo animale e della fisiologia 1,2. Gli Cnidari sono classificati in due gruppi principali: gli antozoi (ad esempio, anemoni di mare e coralli) possiedono solo larve di planula e stadi di polipo sessili, mentre i Medusozoi (membri di Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa e Cubozoa) assumono tipicamente la forma di meduse che nuotano liberamente, o meduse, così come larve di planula e polipi. Gli Cnidari mostrano comunemente un'elevata capacità rigenerativa e i loro meccanismi cellulari sottostanti, in particolare il possesso di cellule staminali adulte e cellule proliferative, hanno attirato molta attenzione 3,4. Inizialmente identificate in Hydra, le cellule staminali idrozoiche si trovano negli spazi interstiziali tra le cellule epiteliali ectodermiche e sono comunemente indicate come cellule interstiziali o cellulei-3.

Le cellule i-idrozoiche condividono caratteristiche comuni che includono la multipotenza, l'espressione di marcatori di cellule staminali ampiamente conservati (ad esempio, Nanos, Piwi, Vasa) e il potenziale di migrazione 3,5,6,7,8. Come cellule staminali funzionali, le cellule i-sono ampiamente coinvolte nello sviluppo, nella fisiologia e nelle risposte ambientali degli animali idrozoi, il che attesta la loro elevata capacità rigenerativa e plasticità3. Mentre le cellule staminali, simili alle cellule i, non sono state identificate al di fuori degli idrozoi, anche nella specie modello stabilita Nematostella, le cellule proliferative sono ancora coinvolte nel mantenimento e nella rigenerazione del tessuto somatico, così come la linea germinale9. Poiché gli studi sullo sviluppo e la rigenerazione cnidariana sono stati condotti prevalentemente su animali di tipo polipo come Hydra, Hydractinia e Nematostella, la dinamica cellulare e le funzioni delle cellule staminali nelle specie di meduse rimangono in gran parte non affrontate.

La medusa idrozoica Clytia hemisphaerica , una specie di medusa cosmopolita con diversi habitat in tutto il mondo, tra cui il Mar Mediterraneo e il Nord America, è stata utilizzata come animale modello sperimentale in diversi studi evolutivi e sullo sviluppo10. Con le sue piccole dimensioni, la facilità d'uso e le uova di grandi dimensioni, Clytia è adatto per la manutenzione in laboratorio, nonché per l'introduzione di strumenti genetici come i metodi di transgenesi e knockout recentemente stabiliti11, aprendo l'opportunità di un'analisi dettagliata dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della biologia delle meduse. Nel tentacolo di Clytia medusa, le cellule I sono localizzate nella regione prossimale, chiamata bulbo, e i progenitori come i nematoblasti migrano verso la punta distale differenziandosi in tipi cellulari distinti, compresi i nematociti12.

Durante la rigenerazione del Clytia manubrium, l'organo orale delle meduse, le cellule Nanos1+ i-che sono presenti nelle gonadi migrano nella regione in cui il manubrio viene perso in risposta al danno e partecipano alla rigenerazione del manubrio7. Questi risultati supportano l'idea che le cellule i-in Clytia si comportano anche come cellule staminali funzionali coinvolte nella morfogenesi e nella rigenerazione. Tuttavia, dato che le proprietà delle cellule i-differiscono tra animali rappresentativi di tipo polipo come Hydra e Hydractinia3, è possibile che le caratteristiche e le funzioni delle cellule staminali siano diversificate tra le specie di meduse. Inoltre, con l'eccezione di Clytia, le tecniche sperimentali sono state limitate per altre meduse, e la dinamica dettagliata delle cellule proliferative e delle cellule staminali è sconosciuta13.

La medusa idrozoica Cladonema pacificum è un organismo modello emergente che può essere conservato in un ambiente di laboratorio senza pompa dell'acqua o sistema di filtrazione. Il Cladonema medusa ha tentacoli ramificati, una caratteristica comune nella famiglia Cladonematidae, e un organo fotorecettore chiamato ocello sullo strato ectodermico vicino al bulbo14. Il processo di ramificazione dei tentacoli si verifica in un nuovo sito di ramificazione che appare lungo il lato adassiale del tentacolo. Nel corso del tempo, i tentacoli continuano ad allungarsi e ramificarsi, con i rami più vecchi spinti verso la punta15. Inoltre, i tentacoli Cladonema possono rigenerarsi entro pochi giorni dall'amputazione. Studi recenti hanno suggerito il ruolo delle cellule proliferanti e delle cellule staminali nella ramificazione e rigenerazione dei tentacoli in Cladonema16,17. Tuttavia, mentre l'ibridazione convenzionale in situ (ISH) è stata utilizzata per visualizzare l'espressione genica in Cladonema, a causa della sua bassa risoluzione, è attualmente difficile osservare in dettaglio la dinamica delle cellule staminali a livello cellulare.

Questo articolo descrive un metodo per visualizzare cellule staminali simili a Cladonema mediante FISH e co-colorazione con EdU, un marker di proliferazione cellulare18. Visualizziamo il pattern di espressione di Nanos1, un marcatore di cellule staminali 5,17, di FISH, che consente l'identificazione della distribuzione delle cellule staminali a livello di singola cellula. Inoltre, la co-colorazione dell'espressione di Nanos1 con l'etichettatura EdU consente di distinguere le cellule staminali che proliferano attivamente. Questo metodo per monitorare sia le cellule staminali che le cellule proliferative può essere applicato a una vasta gamma di aree di indagine, tra cui la ramificazione dei tentacoli, l'omeostasi dei tessuti e la rigenerazione degli organi in Cladonema, e un approccio simile può essere applicato ad altre specie di meduse.

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Protocollo

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo.

1. Sintesi della sonda

  1. Estrazione dell'RNA
    1. Posizionare tre meduse di Cladonema vive coltivate in acqua di mare artificiale (ASW) in una provetta da 1,5 ml utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 ml con la punta tagliata e rimuovere quanto più ASW possibile.
      NOTA: ASW si prepara sciogliendo una miscela di sali minerali in acqua di rubinetto con neutralizzatore di cloro; il peso specifico finale (S.G.) è 1,018 o le parti per mille (ppt) sono ~27.
    2. Congelare i tubi da 1,5 mL in azoto liquido per inibire l'attività della RNasi. Aggiungere 30 μL di tampone di lisi dal kit di isolamento dell'RNA totale in cui è stato aggiunto 2-mercaptoetanolo (1 μL/100 μL di tampone di lisi) e omogeneizzare i campioni nel tampone di lisi usando un omogeneizzatore.
      NOTA: Per evitare il trabocco del tampone e del campione dalle provette, si raccomanda l'omogeneizzazione con una piccola quantità di tampone di lisi.
    3. Aggiungere 570 μL di tampone di lisi ed estrarre l'RNA totale seguendo il protocollo del kit di isolamento dell'RNA totale (Figura 1).
    4. Misurare la concentrazione dell'RNA estratto utilizzando uno spettrofotometro e conservare a -80 °C fino all'uso.
  2. Sintesi del cDNA
    1. Utilizzando un kit, sintetizzare il cDNA usando l'RNA totale estratto dalle meduse come modello (Figura 1 e Tabella 1).
    2. Incubare a 65 °C per 5 min.
    3. Raffreddare rapidamente sul ghiaccio.
    4. Eseguire la sintesi del cDNA con la miscela del punto 1.2.1 (Tabella 1). Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare a 42 °C per 60 minuti.
    5. Incubare a 95 °C per 5 min.
    6. Raffreddare rapidamente sul ghiaccio.
    7. Misurare la concentrazione del cDNA sintetizzato utilizzando uno spettrofotometro e conservare a -20 °C o al di sotto di -20 °C fino all'uso.
  3. Sintesi del prodotto PCR
    1. Per creare un modello PCR, progettare il primer specifico utilizzando Primer-BLAST. Ricavare la sequenza di riferimento dai dati NCBI o dai dati RNA-seq.
      NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i primer utilizzati in questo protocollo.
    2. Per amplificare la sequenza target, eseguire la clonazione TA, che non richiede l'uso di enzimi di restrizione. Per ottenere un prodotto PCR in cui viene aggiunta un'adenina all'estremità 3', utilizzare le seguenti impostazioni: 98 °C per 2 min; 35 cicli di 98 °C per 10 s, 55-60 °C per 30 s, 72 °C per 1 min. Utilizzare Taq DNA polimerasi per le reazioni (Tabella 1).
      NOTA: Per determinare le condizioni della PCR, seguire il protocollo che accompagna la DNA polimerasi da utilizzare, che generalmente fornisce una temperatura di ricottura raccomandata e un tempo di estensione.
    3. Eseguire il prodotto PCR attraverso un gel di agarosio all'1% e tagliare la banda di interesse. Estrarre i prodotti PCR dai gel tagliati utilizzando un kit di estrazione del gel.
  4. Legatura
    1. Legare il prodotto PCR al vettore con sporgenze di timina 3' mescolando i reagenti (Tabella 1) e incubando a 37 °C per 30 minuti (Figura 1).
      NOTA: Il rapporto molecolare di vector:PCR dovrebbe essere 1:>3. La dimensione del vettore pTA2 è di circa 3 kb. Se il prodotto PCR (inserto) è A (kb) e B (ng/μL), il volume dell'inserto (X nella tabella 1) da prelevare può essere calcolato da ([50 ng di vettore × A kb di inserto])/(3 kb di × vettoriale [ 1/3]) = 50· Un ng di inserto. Se la concentrazione dell'inserto è B ng/μL, il volume prelevato è 50· A/B μL dell'inserto.
  5. Trasformazione e placcatura
    1. Per la trasformazione, scongelare le cellule competenti sul ghiaccio e distribuirle in aliquote da 20 μL ciascuna. Aggiungere 1 μL dei plasmidi contenenti il prodotto PCR (meno del 5% del volume cellulare competente) e vortice per 1 s. Incubare su ghiaccio per 5 minuti, quindi incubare a 42 °C per 45 s e vortice per 1 s.
    2. Aggiungere 180 μL di brodo Super Optimal con terreno di repressione dei cataboliti (SOC) (un terreno di coltura batterica ricco di nutrizione) alle cellule competenti e incubare a 37 °C per 30 minuti. Dopo 30 minuti, distribuire le cellule competenti su una piastra di agar contenente ampicillina, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galatto-piranoside (X-gal) e isopropil-β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare a 37 °C per 12-16 ore (Figura 1).
      NOTA: X-gal e IPTG vengono utilizzati per selezionare colonie blu e bianche.
  6. Coltura liquida
    1. Scegli una colonia bianca tra le colonie bianche e blu sul piatto. Aggiungere a 3-5 ml di terreno LB con ampicillina e incubare su un agitatore per 12-16 ore a 37 °C (Figura 1).
  7. Miniprep
    1. Estrarre il plasmide dal mezzo LB utilizzando un miniprep plasmidico (Figura 1).
    2. Quantificare la concentrazione del plasmide utilizzando uno spettrofotometro.
  8. Leggi la sequenza.
    1. Per leggere la sequenza di DNA del plasmide, inviare il plasmide per il sequenziamento Sanger e quindi utilizzare un software per allinearlo con la sequenza genoma / trascrittoma per confermare se la sequenza target è sintetizzata correttamente e valutare in quale direzione la sequenza target è inserita nel plasmide (da 5' a 3' o da 3' a 5').
      NOTA: Se la sequenza bersaglio viene inserita nel plasmide nella direzione da 5' a 3' dal sito di legame della RNA polimerasi vicino all'estremità 3', una sonda antisenso può essere generata mediante trascrizione in vitro . Se la sequenza target viene inserita nella direzione inversa da 3' a 5', è possibile generare una sonda di rilevamento (controllo negativo). Se si utilizzano vettori come pTA2, è possibile utilizzare due siti di legame di trascrizione a seconda dello scopo.
  9. Trascrizione in vitro
    1. Preparare il modello di DNA dal plasmide creato eseguendo la PCR utilizzando primer al di fuori del sito di legame della RNA polimerasi (ad esempio, siti di legame T7 / T3) nel plasmide (Figura 1).
      NOTA: I primer universali come il primer forward M13-20 e il primer inverso M13 possono essere utilizzati per preparare un modello di DNA che include siti di legame della RNA polimerasi.
    2. Purificare la dima dopo l'amplificazione PCR utilizzando un kit di estrazione gel/PCR.
    3. Mescolare i reagenti mostrati di seguito ed eseguire la reazione di trascrizione a 37 °C per 3 ore (Figura 1 e Tabella 1).
    4. Aggiungere 1,5 μL di DNasi e incubare a 37 °C per 30 min.
    5. Aggiungere 10 μL di acqua priva di RNasi e purificare la sonda dalla soluzione della reazione di trascrizione utilizzando una colonna di pulizia.
    6. Controllare la dimensione dell'RNA sintetizzato caricando 1 μL su un gel di agarosio all'1% e determinare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro.
      NOTA: Le sonde di RNA sintetizzato devono avere una concentrazione di almeno 100 ng/μL.
    7. Aggiungere 30 μL di formammide per conservarla a una temperatura pari o inferiore a -20 °C.

2. Incorporazione e fissazione di EdU

  1. Introdurre Cladonema medusae (5-10 animali per tubo) in provette da 1,5 mL utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,5 mL e aggiungere ASW fino ad un volume totale di 500 μL. Aggiungere 7,5 μL di soluzione madre EdU da 10 mM e incubare i campioni per 1 ora a 22 °C (Figura 2). La concentrazione finale di EdU è di 150 μM.
    NOTA: Utilizzare meduse di 5-7 giorni per monitorare la formazione del terzo ramo (Figura 3A). Il giorno in cui le meduse si staccano dal polipo viene conteggiato come giorno 1, e il giorno 5, le meduse iniziano tipicamente a mostrare un terzo ramo sui loro tentacoli principali.
  2. Dopo 1 ora, rimuovere il più possibile ASW contenente EdU.
  3. Per anestetizzare le meduse, aggiungere il 7% di MgCl 2 in H2 O e incubare per 5 minuti.
  4. Rimuovere il 7% di MgCl 2 in H 2 Oe fissare le meduse durante la notte (O.N.) a 4 °C con paraformaldeide (PFA) al 4% in ASW (Figura 2).
    NOTA: Quando si esegue FISH senza incorporazione di EdU, i campioni possono essere fissati in modo simile a quelli trattati con EdU dopo l'anestetizzazione (fasi 2.3-2.4).

3. Ibridazione fluorescente in situ

  1. Trattamento con proteinasi e post fissazione
    1. Rimuovere il PFA e lavare i campioni con PBS contenente lo 0,1% di Tween-20 (PBST) per 3 x 10 minuti. Utilizzare 300-500 μL di PBST per lavaggio.
      NOTA: Da questa fase alla fine dell'ibridazione, l'esperimento deve essere eseguito in un ambiente privo di RNasi, indossando guanti e una maschera. Il PBS 1x in questa fase deve essere realizzato con acqua trattata con DEPC. Dopo l'ibridazione, è possibile utilizzare 1x PBS realizzato con acqua senza trattamento DEPC. Alcuni protocolli ISH e FISH disidratano i campioni utilizzando passaggi di metanolo, il che consente di salvare i campioni fissi a -20 °C fino all'uso. Per evitare lavori superflui, il processo di disidratazione viene omesso da questo protocollo, in particolare perché i campioni possono essere conservati in PBST per un massimo di alcuni giorni.
    2. Dopo la fissazione, porre il campione in provette da 1,5 mL su uno shaker, ad eccezione della fase di incubazione dell'anticorpo O.N. anti-DIG-POD (fase 3.4.2). Dopo il lavaggio, aggiungere 10 mg/mL di soluzione madre di proteinasi K in PBST e incubare le meduse con proteinasi K (concentrazione finale: 10 μg/ml) a 37 °C per 10 minuti.
    3. Rimuovere la soluzione di proteinasi K e lavare i campioni per 2 x 1 minuto con PBST.
    4. Per postfissare le meduse, aggiungere il 4% di PFA in 1x PBS e incubare a 37 °C per 15 minuti.
    5. Rimuovere la soluzione di PFA e lavare i campioni per 2 x 10 minuti con PBST.
      NOTA: Se il gene bersaglio è altamente espresso con un segnale di fondo basso, i passaggi 3.1.2-3.1.5 possono essere saltati.
  2. Ibridazione
    1. Rimuovere il PBST e aggiungere il buffer di ibridazione (buffer HB, tabella 1). Incubare i campioni in HB Buffer per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Utilizzare 300-400 μL di tampone HB, che fornisce un volume sufficiente per un'ibridazione di successo.
      NOTA: HB Buffer, Wash Buffer 1 e Wash Buffer 2 sono preparati con 20x SSC stock. HB Buffer è conservato a una temperatura pari o inferiore a -20 °C e deve essere portato a RT prima dell'uso.
    2. Rimuovere il buffer HB e aggiungere un nuovo buffer HB. Preibridare a 55 °C per almeno 2 ore in un incubatore di ibridazione.
    3. Rimuovere il tampone HB e incubare con il tampone HB contenente le sonde memorizzate nella fase 1.9.7 (concentrazione finale della sonda: 0,5-1 ng/μL nel tampone HB). Ibridare a 55 °C per 18-24 ore (Figura 2) in un incubatore di ibridazione.
      NOTA: L'intensità e la specificità del segnale FISH possono variare a causa dell'espressione genica bersaglio, nonché della lunghezza e della specificità della sonda. Per aumentare l'intensità, è possibile regolare parametri come la durata dell'ibridazione (18-72 h) e la temperatura (50-65 °C) e testare diverse sonde. Per evitare segnali non specifici, il trattamento con proteinasi K (concentrazione e durata) può essere modificato19.
  3. Rimozione della sonda
    1. Rimuovere il buffer HB contenente le sonde, quindi aggiungere il buffer di lavaggio 1 (tabella 1). Lavare i campioni con Wash Buffer 1 per 2 x 15 minuti a 55 °C. Utilizzare 300-400 μL di tampone di lavaggio.
      NOTA: HB Buffer contenente sonde può essere utilizzato ripetutamente, fino a circa dieci volte. Invece di scartare, conservare il buffer HB usato contenente sonde a una temperatura pari o inferiore a -20 °C. Preriscaldare il tampone di lavaggio 1, il tampone di lavaggio 2, 2x SSC e PBST a 55 °C prima dell'uso.
    2. Rimuovere il buffer di lavaggio 1, quindi aggiungere il buffer di lavaggio 2 (tabella 1). Lavare i campioni con Wash Buffer 2 per 2 x 15 minuti a 55 °C.
    3. Rimuovere Wash Buffer 2, quindi aggiungere 2x SSC. Lavare i campioni con 2x SSC per 2 x 15 minuti a 55 °C.
    4. Rimuovere 2x SSC, quindi aggiungere PBST preriscaldato. Lavare i campioni per 1 x 15 minuti con PBST a RT.
  4. Incubazione di anticorpi anti-DIG
    1. Rimuovere PBST e quindi aggiungere il buffer di blocco all'1%. Incubare i campioni per almeno 1 ora a RT agitando lentamente su un rocker.
      NOTA: preparare un tampone bloccante all'1% diluendo il 5% di tampone bloccante (Tabella 1). Controllare i campioni prima della successiva reazione anticorpale perché il campione tende ad attaccarsi alla parte posteriore del coperchio o alla parete a causa dell'agitazione.
    2. Dopo il blocco, rimuovere il buffer bloccante all'1%, aggiungere la soluzione anti-DIG-POD (1:500, in tampone bloccante all'1%) e incubare i campioni O.N. a 4 °C (Figura 2).
      NOTA: Fare attenzione a mantenere il tempo di incubazione entro 12-16 h per evitare il rilevamento di segnali non specifici.
  5. Rilevamento di sonda marcata DIG
    1. Rimuovere la soluzione anti-DIG-POD, quindi aggiungere Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, Tabella 1). Lavare i campioni con TNT per 3 x 10 minuti a RT.
      NOTA: L'uso della tecnica di amplificazione del segnale del tiramido (TSA) fornisce un'immagine a migliore risoluzione contro i reagenti marcati con perossidasi di rafano (ad esempio, anti-DIG-POD).
    2. Soluzione madre diluita di tiramide fluorescente coniugata con colorante (Cy5-tiramide) (1:50) nel tampone diluente di amplificazione per ottenere la soluzione attiva di Cy5-tyramide (Figura 2).
    3. Rimuovere quanto più TNT possibile, quindi aggiungere la soluzione attiva di Cy5-tyramide. Incubare i campioni per 10 minuti al buio.
    4. Lavare i campioni con PBST per 3 x 10 minuti al buio.
  6. Rilevamento di EdU
    NOTA: Il kit EdU rileva EdU incorporati come segnali fluorescenti (Figura 2).
    1. Per preparare il cocktail di rilevamento EdU, mescolare i componenti come mostrato nella Tabella 1. Utilizzare 100 μL di cocktail di rilevazione EdU per ogni campione.
      NOTA: Preparare 1x additivo tampone di reazione diluendo l'additivo tampone di reazione 10x con acqua ultrapura.
    2. Rimuovere PBST, quindi aggiungere il cocktail di rilevamento EdU. Incubare al buio per 30 min.
    3. Lavare con PBST per 3 x 10 minuti al buio.
  7. Colorazione del DNA
    1. Diluire Hoechst 33342 (1:500) in PBST per preparare la soluzione di Hoechst. Rimuovere la PBST e quindi aggiungere la soluzione di Hoechst. Incubare i campioni per 30 minuti al buio (Figura 2).
    2. Lavare i campioni con PBST per 3-4 x 10 minuti al buio.
  8. Montante
    1. Fare una banca sul vetrino per evitare che il campione venga schiacciato. Applicare del nastro adesivo sul vetrino e svuotare il centro.
    2. Trasferire le meduse sulla banca sul vetro vetrino utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 mL con la punta tagliata.
      NOTA: Fare attenzione a non lasciare che i tentacoli si sovrappongano.
    3. Rimuovere qualsiasi PBST con una pipetta P200, quindi aggiungere lentamente il 70% di glicerolo come mezzo di montaggio (Figura 2).
      NOTA: invece del 70% di glicerolo, è possibile utilizzare un mezzo di montaggio anti-sbiadimento per evitare che la fluorescenza si affievolisca.
    4. Posizionare delicatamente una copertina sulle meduse con una pinza e sigillare il lato della copertina con smalto trasparente.
    5. Mantenere i vetrini a 4 °C al buio se non si esegue immediatamente l'osservazione al microscopio.
  9. Imaging
    1. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser per acquisire immagini. Per una risoluzione a cella singola, utilizzare una lente dell'olio 40x o una lente per un ingrandimento maggiore.
    2. Dopo l'acquisizione delle immagini, aprire le immagini utilizzando il software ImageJ/FIJI e contare le celle positive per EdU+ e/o Nanos1+ dallo strumento multipunto20.

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Risultati

I tentacoli Cladonema sono stati usati come modello per studiare i processi cellulari di morfogenesi e rigenerazione15,16,17. La struttura del tentacolo è composta da un tubo epiteliale in cui le cellule staminali, o i-cellule, si trovano nella regione prossimale, chiamata bulbo tentacolare, e nuovi rami vengono aggiunti sequenzialmente alla parte posteriore della regione distale del bulbo lungo il lato assiale (

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Discussione

Le cellule proliferanti e le cellule staminali sono importanti fonti cellulari in vari processi come la morfogenesi, la crescita e la rigenerazione21,22. Questo articolo descrive un metodo per co-colorare il marcatore di cellule staminali Nanos1 mediante marcatura FISH e EdU in Cladonema medusae. Lavori precedenti che utilizzano l'etichettatura EdU o BrdU hanno suggerito che le cellule proliferative si localizzano nei bulbi tentacolari

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da AMED con il numero di sovvenzione JP22gm6110025 (a Y.N.) e dal JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (a Y.N.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-Mercaptoetanolo Wako137-06862
Pipetta di trasferimento da 3,1 mLThermo Scientific233-20S
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal)Wako029-15043
anti-DIG-PODRoche11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 primer5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3'
Cladonema pacificum Nanos1 innesco5'-CGACGTCCAATTTTACGTGCT -3'
Cladonema pacificum Piwi primer5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3'
Cladonema pacificum Piwi innesco5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3'
Kit di proliferazione cellulare Click-iT EdU per imaging, colorante Alexa Fluor 488Invitrogen C10337Kit EdU
Coroline offGEX Co. ltdNeutralizzatore di cloroN/A
Kit di rilevamento dell'acido nucleico DIG Reagente bloccanteRoche11175041910tampone bloccante 
Miscela di marcatura dell'RNA DIG Roche11277073910
DTT PromegaP117B
ECOS cella competente DH5αNIPPON GENE316-06233cellula competente
Kit di estrazione Gel / PCR genicoveloce Gene veloceFG-91302kit di estrazione su gel
Mini kit di plasmidi genici velociGene veloceFG-90502miniprep plasmidico
FormamideWako 068-00426
Sale sodico di eparina da suinoSIGMA-ALDRICH H3393-10KU
Isopropil-beta;-D(-)-tiogalattopiranoside (IPTG)Wako096-05143
LB AgarInvitrogen22700-025piastra di agar
LB Brodo BaseInvitrogen12780-052LB medio
Acido maleicoWako134-00495
mini colonne di RNA a rotazione rapidaRoche11814427001colonna di pulizia
NaClWako 191-01665
Spettrofotometro UV-Vis a microvolume NanoDrop OneC con Wi-FiThermo ScientificSpettrofotometroND-ONEC-W
Poliossietilene (20) Monolaurato di sorbitano (Tween-20)Wako 166-21115
PowerMasher 2nippi 891300omogeneizzatore
Proteinasi KNacarai Tesque 29442-14
Inibitore della RNasiTaKaRa2313A
RNeasy Mini kitQiagen 74004kit di isolamento dell'RNA totale
RQ1 Dnase senza RNasiPromegaM6101
Soluzione salina Citrato di sodio Tampone 20x polvere (20x SSC)TaKaRaT9172
SEA LIFEMarin TechN/A misceladi sali minerali
T3 RNA polimerasi Roche11031163001
T7 RNA polimerasiRoche10881767001
TAITEC HB-100TAITEC0040534-000Ibridatore
TaKaRa Ex Taq TaKaRaRR001ATaq DNA polimerasi
TaKaRa PrimeScript 2 1st filamento cDNA Kit di sintesiTaKaRa6210A
cDNA CloneTOYOBO TAK101pTA2 Vettore
tRNARoche10109541001
TSA Plus Cyanine 5AKOYA BiosciencesNEL745001KTtecnica di amplificazione del segnale di tiramide (TSA)
Zeiss LSM 880ZEISSN/Amicroscopio confocale a scansione laser
diretto inverso in avanti inverso bersaglio

Riferimenti

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