Il saggio di legatura di prossimità consente l'individuazione, la localizzazione e la quantificazione della metilazione della proteina arginina nel tessuto fisso

Summary

Il saggio di legatura di prossimità è una tecnica molto utile per localizzare e quantificare la metilazione dell'arginina di una data proteina quando il residuo di arginina modificato è sconosciuto e/o se non è disponibile alcun anticorpo specifico.

Abstract

La metilazione dell'arginina sta emergendo come una modificazione post-traduzionale chiave coinvolta in una vasta gamma di processi biologici. Il suo studio nei tessuti è spesso limitato dalla mancanza di un anticorpo specifico che riconosca il residuo di arginina bersaglio. Il saggio di legatura di prossimità (PLA) è stato originariamente sviluppato per studiare le interazioni proteina/proteina. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo PLA dedicato alla rilevazione della metilazione dell'arginina che abbiamo applicato al recettore dei glucocorticoidi (GR). Avendo precedentemente dimostrato che PRMT5 dimetila i GR nelle cellule, abbiamo utilizzato il PLA con un anticorpo dimetilico pan simmetrico e un anticorpo anti-GR per misurare la metilazione del GR nei tumori della mammella. Dimostriamo che il PLA offre un approccio unico per misurare la metilazione dell'arginina di una proteina bersaglio, anche quando il sito di metilazione non è stato identificato. Questa tecnica potrebbe essere estesa ad altre modifiche post-traduzionali laddove siano disponibili anticorpi pan efficaci. Quindi, descriviamo in dettaglio la tecnologia PLA utilizzata per rilevare la metilazione dell'arginina nei tessuti fissati utilizzando la GR come esempio.

Introduction

La metilazione dell'arginina da parte della proteina arginina metiltransferasi (PRMT) è un'abbondante modificazione post-traduzionale (PTM) coinvolta in numerosi processi biologici. I PRMT catalizzano il trasferimento di gruppi metilici dalla S-adenosil metionina ai residui di arginina. La famiglia PRMT comprende nove membri classificati in base al tipo di metilazione che svolgono. Tutti i membri eseguono la monometilazione (MMA). I PRMT di tipo 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 e 8) catalizzano la dimetilazione asimmetrica (ADMA), mentre i tipi 2 (PRMT5 e 9) catalizzano la dimetilazione simmetrica (SDMA) e il tipo 3 (PRMT7) generano solo MMA¹. Metilando numerosi substrati, i diversi PRMT regolano un'ampia varietà di importanti processi cellulari come la riparazione del DNA, la regolazione trascrizionale, la risposta immunitaria, l'elaborazione dell'RNA e la trasduzione del segnale ^2,3. Ciò è particolarmente vero per la segnalazione degli ormoni steroidei, in cui i PRMT modificano l'attività dei recettori steroidei metilando non solo i recettori stessi, ma anche i loro regolatori o istoni².

La metilazione dell'arginina è ampiamente studiata nel cancro, poiché la maggior parte dei PRMT ha dimostrato di essere sovraespressa nel cancro rispetto ai tessuti normali e la loro espressione è spesso associata a una prognosi infausta ^4,5. Il rilevamento della metilazione dell'arginina in vivo è essenziale per comprendere le funzioni cellulari associate a questa modifica. Ciò si ottiene convenzionalmente conducendo l'immunoistochimica (IHC) con un anticorpo specifico che riconosce il residuo di arginina metilata. Tuttavia, questo metodo è molto limitato in quanto si basa sull'identificazione del residuo di arginina modificato e si basa sull'efficacia dell'anticorpo utilizzato. Il saggio di ligazione di prossimità in situ (PLA) è stato inizialmente sviluppato per studiare le interazioni proteina/proteina in cellule o tessuti fissati⁶. È interessante notare che questa tecnologia può essere utilizzata anche per rilevare i PTM utilizzando un anticorpo pan contro la modifica di interesse, nonché un anticorpo che riconosce la proteina bersaglio. Il nostro team ha precedentemente adattato questa tecnica per studiare la metilazione del recettore alfa degli estrogeni (ERα), utilizzando un anticorpo anti-ERα e un anticorpo che riconosce specificamente il sito di metilazione sull'arginina 260⁷. Da notare che questa tecnica può essere estesa agli anticorpi che riconoscono un tipo speciale di metilazione anche quando il residuo metilato è sconosciuto. In effetti, diverse aziende forniscono anticorpi pan che riconoscono specificamente MMA, ADMA o SDMA che possono essere utilizzati con successo per studiare la metilazione delle proteine in vivo.

Qui, come prova di concetto, presentiamo un'analisi dettagliata della metilazione GR utilizzando l'anticorpo SDMA nei tumori mammari umani, dal disegno sperimentale all'analisi dei dati.

Protocol

Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun paziente. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale del Centro di Ricerca sul Cancro di Lione.

1. Scelta degli anticorpi

1. Utilizzare anticorpi primari convalidati da IHC o immunofluorescenza (IF).
   NOTA: Gli anticorpi primari selezionati per lo studio sono cruciali per il successo del PLA e più in particolare nei tessuti fissati. L'utilizzo di un anticorpo convalidato da IHC o IF aumenterà il tasso di successo dell'esperimento. L'ottimizzazione e la specificità degli anticorpi sono necessarie prima di condurre esperimenti, idealmente eseguendo esperimenti di controllo in cellule invalidate per l'espressione della proteina di interesse e utilizzando un inibitore specifico per l'attività enzimatica della metiltransferasi coinvolta. Qui le condizioni sono state precedentemente ottimizzate¹⁰.

2. Preparazione del pellet della linea cellulare incorporata in paraffina

NOTA: I campioni vengono incorporati in un gel e quindi inseriti in un processore di tessuti automatizzato per la disidratazione del campione e l'inclusione della paraffina.

1. Preparare il pellet cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando la dissociazione della tripsina.
   NOTA: Non raschiare per raccogliere le cellule.
2. Risospendere il pellet cellulare in 1,5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Centrifugare le celle a temperatura ambiente (RT) a 200 x g. Aspirare il surnatante PBS.
4. Risospendere il pellet in 1 mL di formalina al 4% e conservare le provette a 4 °C per 3 ore.
5. Lavare le celle in soluzione salina tamponata Tris 1X (TBS).
   NOTA: Non utilizzare una soluzione a base di fosfati in quanto depolimerizza il gel.
6. Aggiungere 1 mL di TBS e omogeneizzare per 30 s mediante vortex. Centrifugare per 5 minuti a 200 x g e rimuovere il surnatante.
7. Ripetere i passaggi da 2.5 a 2.7 due volte.
8. Eseguire l'inclusione del tessuto nel processatore automatico di tessuti seguendo il programma specifico:
   Formalina 1 h 37 °C
   Acqua distillata 2 min RT
   EtOH 70% 40 min 45 °C
   EtOH 80% 40 min 45 °C
   EtOH 95% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   Xilene 40 min 45 °C
   Xilene 40 min 45 °C
   Xilene 40 min 45 °C
   Paraffina 1 h 60 °C
   Paraffina 1 h 60 °C
   Paraffina 1 h 30 min 60 °C

3. Fissazione dei tessuti e preparazione dei vetrini

1. Fissare i tessuti in formalina al 4% per 24 ore prima dell'inclusione.
2. Tagliare sezioni seriali spesse 3 μm dei blocchi contenenti tessuti con un microtomo.
3. Condurre la deparaffinazione con l'autocoloratore incubando in sequenza i vetrini in xilene (10 min) due volte, etanolo al 100% (5 min), etanolo al 95% (5 min) e acqua (5 min).
4. Eseguire il recupero dell'epitopo indotto dal calore in 10 mM di tampone citrato utilizzando un bagno d'acqua a 98 °C per 40 minuti al pH appropriato (solitamente 6-9).
   NOTA: I due anticorpi devono funzionare allo stesso pH affinché il metodo abbia successo. Sono stati eseguiti diversi test prima di stabilire il pH ottimale utilizzato nel presente documento. Gli anticorpi utilizzati in questo studio sono gli anticorpi SDMA e gli anticorpi GR.
5. Lasciare raffreddare i vetrini per 20 minuti, quindi lavarli in 1x PBS per 20 minuti.

4. Esperimento IHC

NOTA: Gli esperimenti IHC vengono eseguiti utilizzando lo strumento di ricerca Discovery XT (Table of Materials) per l'automazione e la riproducibilità.

1. Per evitare l'estinzione della perossidasi, utilizzare l'inibitore incluso nel kit di diaminobenzidina (DAB).
2. Incubare i vetrini con i due anticorpi primari diluiti nel diluente anticorpale per 60 minuti.
3. Incubare i vetrini con l'anticorpo secondario anti-perossidasi di rafano di coniglio (HRP) per 16 minuti o con l'anticorpo anti-topo per 30 minuti.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare un kit commerciale di diaminobenzidina (DAB) (Tabella dei materiali) per il rilevamento dell'IHC.
4. Applicare ematossilina (100 μL/vetrino per 8 min) e azzurramento (100 μL/vetrino per 4 min) sui campioni per colorare i nuclei.
5. Lavare i vetrini in acqua tiepida e sapone, quindi disidratarli utilizzando un autostainer e montarli su una pantofola coprioggetti automatizzata utilizzando un mezzo di montaggio.

5. Reazioni del saggio di legatura di prossimità

NOTA: Tutti i reagenti utilizzati sono inclusi nei kit PLA (Table of Materials). Si consiglia di utilizzare 40 μL di reagente per 1 cm² di tessuto. Tutte le incubazioni devono essere eseguite in un ambiente umido per evitare un'eccessiva evaporazione. Non lasciare che il campione si asciughi, poiché ciò potrebbe causare rumori di fondo. Si consiglia di utilizzare 1x tampone A (tampone di lavaggio in situ , Tabella dei materiali) per i lavaggi nei barattoli. Dovrebbe esserci un volume minimo di 70 mL nei barattoli quando si incubano i campioni sotto agitazione. I campioni devono essere conservati a RT prima dell'uso.

1. Tempra della perossidasi
   1. Delimitare l'area di reazione utilizzando una penna idrofobica per evitare un'eccessiva evaporazione della soluzione durante l'esperimento. Aggiungere una goccia di soluzione di perossido di idrogeno per 1 cm² di ciascun campione. Incubare per 5 minuti a RT.
      NOTA: Si consiglia di ottimizzare il tempo di incubazione in base ai campioni/anticorpi utilizzati.
2. Inceppamento
   1. Far gocciolare delicatamente il tampone A sui campioni e lavare nel tampone A a 50 giri/min sotto agitazione per 5 minuti a RT.
   2. Picchiettare il tampone A rimanente e aggiungere una goccia per 1 cm² di soluzione bloccante (inclusa nel kit PLA). Incubare per 30 minuti a 37 °C.
3. Incubazione degli anticorpi primari
   1. Diluire i due anticorpi primari a concentrazioni adeguate nel diluente anticorpale.
   2. Rimuovere la soluzione bloccante dai vetrini e aggiungere immediatamente la soluzione di anticorpi primari (inclusa nel kit PLA). Incubare per 1 ora in camera di umidità a 37 °C.
4. Incubazione di sonde PLA
   1. Diluire la sonda PLA PLUS (1:5) con la sonda PLA meno (1:5) nel diluente anticorpale.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare 8 μL di sonda PLA meno il materiale di produzione (5x), 8 μL di sonda PLA più il materiale di base (5x) e 24 μL di diluente anticorpale per una reazione di 40 μL.
   2. Far gocciolare delicatamente il tampone A sui campioni e lavare nel tampone A a 50 giri/min per 5 minuti a RT.
   3. Staccare il tampone A rimanente e applicare la soluzione della sonda PLA (inclusa nel kit PLA) ai campioni. Incubare per 1 ora a 37 °C.
5. Legatura
   1. Scongelare il tampone di legatura (incluso nel kit PLA) prima dei passaggi seguenti.
   2. Far gocciolare delicatamente il tampone A sui campioni e lavare nel tampone A a 50 giri/min per 5 minuti a RT.
   3. Diluire il tampone di legatura 5x (1:5) (incluso nel kit PLA) in acqua ad alta purezza. Aggiungere la ligasi (1:40) (inclusa nel kit PLA) immediatamente prima di aggiungerla al campione.
      NOTA: Si consiglia di aggiungere 8 μl del tampone di legatura 5x a 31 μl di acqua ad alta purezza per una reazione di 40 μl. Quindi aggiungere 1 μL di ligasi.
   4. Prelevare il tampone A rimanente e applicare la soluzione di ligasi sui campioni. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
6. Amplificazione
   1. Scongelare il tampone di amplificazione prima dei passaggi seguenti.
   2. Far gocciolare delicatamente il tampone A sui campioni e lavare nel tampone A a 50 giri/min per 2 minuti a RT.
   3. Diluire il tampone di amplificazione 5x (1:5) (incluso nel kit PLA) in acqua ad alta purezza. Aggiungere la polimerasi (1:80) (inclusa nel kit PLA) immediatamente prima di gocciolarla delicatamente sul campione.
      NOTA: Si consiglia di aggiungere 8 μl del tampone di legatura 5x a 31,5 μl di acqua ad alta purezza per una reazione di 40 μl. Quindi aggiungere 0,5 μl di ligasi.
   4. Staccare il tampone A rimanente e applicare la soluzione di amplificazione sui campioni. Incubare per 2 ore a 37 °C.
7. Scoperta
   1. Far gocciolare delicatamente il tampone A sui campioni e lavare nel tampone A a 50 giri/min per 2 minuti a RT.
   2. Diluire il tampone a campo chiaro di rilevamento 5x (1:5) (incluso nel kit PLA) in acqua ad alta purezza.
      NOTA: Si consiglia di aggiungere 8 μl del tampone di rilevamento 5x a 32 μl di acqua ad alta purezza per una reazione di 40 μl.
   3. Staccare il tampone A rimanente e applicare la soluzione di rilevamento ai campioni. Incubare per 1 ora a RT.
8. Sviluppo del substrato
   1. Far gocciolare delicatamente il tampone A sui campioni e lavare nel tampone A a 50 giri/min per 2 minuti a RT.
   2. Diluire la soluzione del substrato diluendo i reagenti del substrato A (1:70), B (1:100), C (1:100) e D (1:50) (inclusi nel kit PLA) in acqua ad alta purezza.
      NOTA: Si consiglia di aggiungere 0,6 μL di substrato A, 0,4 μL di substrato B, 0,4 μL di substrato C e 0,8 μL di substrato D in 37,8 μL di acqua ad alta purezza per una reazione di 40 μL.
   3. Staccare il tampone A rimanente e applicare la soluzione di amplificazione sui campioni. Incubare per 10 minuti a RT.
9. Colorazione nucleare
   1. Far gocciolare delicatamente l'acqua distillata sui campioni e lavarli in acqua distillata a 50 giri/min per 2 minuti a RT.
   2. Togliete l'acqua distillata rimanente. Aggiungere una goccia di colorante nucleare (incluso nel kit PLA) a ciascun campione di 1 cm² e incubare per 2 minuti a RT.
   3. Sciacquare i vetrini sotto l'acqua corrente del rubinetto per 10 minuti per far maturare la macchia e ottenere una colorazione blu. Non utilizzare acqua stagnante del rubinetto.
10. Disidratazione
    1. Incubare i vetrini in una soluzione contenente etanolo al 96% due volte per 2 minuti. Quindi incubare i vetrini in una soluzione contenente etanolo al 99,7% due volte per 2 minuti.
    2. Incubare i vetrini in xilene per 10 minuti. Quindi trasferire i vetrini nello xilene fresco.
11. Montaggio delle guide
    1. Utilizzare un volume minimo di terreno di montaggio non acquoso e applicare un vetrino coprioggetti sulla parte superiore del campione, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria sotto i vetrini.
    2. Lasciare asciugare i vetrini prima di analizzarli su un microscopio a campo chiaro.

6. Imaging per la localizzazione

1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio verticale.
   NOTA: In questo studio, l'imaging dei vetrini è stato eseguito con un microscopio verticale a campo chiaro (Tabella dei materiali). Le immagini sono state acquisite in condizioni identiche con un ingrandimento di 40x per almeno 10 campi visivi scelti casualmente in modo automatizzato. Si consiglia di analizzare un minimo di 500 cellule per condizione.

7. Analisi per la quantificazione

NOTA: La quantificazione dei campioni è stata eseguita utilizzando il software ImageJ⁸. Per^{le analisi successive} è stato utilizzato FIJI, una distribuzione ImageJ che include ImageJ e altri plug-in preinstallati.

1. Per determinare il numero di punti:
   1. Apri l'immagine.
   2. Eseguire la deconvoluzione del colore. Per questo, fai clic su Colori > immagine > Deconvoluzione colore.
   3. Selezionare l'immagine: - (color_1) nel nome del file.
   4. Utilizzare il comando Trova Maxima per determinare il numero di punti (Elabora > Trova Maxima).
2. Per determinare il numero di celle:
   1. Apri l'immagine.
   2. Eseguire la deconvoluzione del colore. Per questo, fai clic su Immagine > colori > Deconvoluzione del colore.
   3. Selezionare l'immagine: - (color_1) nel nome del file.
   4. Trova una soglia che mostri il numero massimo di nuclei. Per questo, fai clic su Immagine > Luminosità/Contrasto > Soglia.
   5. Riempi i buchi facendo clic su Elabora > binario > riempi i buchi.
   6. Utilizzare il comando spartiacque per dividere i componenti collegati in componenti separati. Fare clic su Elabora > binario > spartiacque.
   7. Analizza le particelle per determinare il numero di nuclei facendo clic su Analizza > Analizza particelle.

Results

Utilizzando la procedura sopra descritta, è possibile rilevare e quantificare la metilazione di una proteina di interesse. Qui, mostriamo l'esempio della metilazione del GR da parte di PRMT5. Gli anticorpi e le condizioni sperimentali per il PLA sono stati precedentemente applicati alle cellule¹⁰. In breve, gli anticorpi primari che hanno come bersaglio GR e SDMA sono riconosciuti da sonde di prossimità coniugate con oligonucleotidi complementari. Quindi, l'ibridazione di una sonda circolare di DN...

Discussion

La metilazione dell'arginina, come altri PTM, contribuisce alla regolazione fine delle funzioni proteiche. Tuttavia, il suo impatto è sottovalutato a causa della difficoltà di valutare queste modifiche, principalmente a causa della mancanza di strumenti. Ciò è particolarmente vero quando si studia la metilazione in vivo, dove l'unico modo per misurare la metilazione dell'arginina è possedere anticorpi specifici che riconoscano il residuo metilato della proteina di interesse. Ciò...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vetrini di adesione TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anticorpo anti-GR (topo)	Santa Cruz	sc393232
anticorpo anti-GR (topo)	santa cruz	sc393232
anticorpo anti-PRMT5 (coniglio)	Merck	07-405
anticorpo anti-SDMA (coniglio)	CST	13222
Automate d'inclusione	Leica	ASP 6025	Infiltrazione di paraffina e preparazione del blocco
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassette Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrato Tampone pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Diluente per anticorpi Dako	Dako Agilent	S202230-2	diluente anticorpale
Discovery ChromoMap Kit per diaminobenzidina (DAB)	Roche	760-159	Kit per diaminobenzidina (DAB)
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu. Kit PLA sonda anti-topo meno	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA (sonda anti-coniglio meno)
Reagenti per rilevamento in situ Duolink in campo chiaro	PLA DUO92012 Sigma-Aldrich		(reagenti per rilevamento in situ)
Sonda PLA in situ Duolink anti-coniglio più	PLA Sigma-Aldrich	DUO92002	(sonda anti-coniglio plus)
Tampone di lavaggio in situ Duolink in campo chiaro	Kit Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA (tampone di lavaggio in situ)
Etanolo 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Etanolo assoluto ≥ 99,8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, pronto all'uso, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalina
Vetrino coprioggetti completamente automatizzato	Leica	CV5030	Vetrino coprioggetti automatizzato
24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
Strumento IHC	Roche	DISCOVERY XT	Automazione di IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtomo	Thermo Scientific	Microm HM340E	Taglio dei tessuti anche in blocchi
Terreno di montaggio Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen per immunocolorazione	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Cera di paraffina tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Pipette monouso	Fisher Scientific	12583237
PBS Tampone 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Tampone di reazione 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche
Anticorpo secondario anti-topo	Abcam	ab133469
Anticorpo secondario OmniMap anti-coniglio HRP	Roche	760-4311
Centro di inclusione tissutale	MMF	EC 350
Xilene (miscela di isomeri) ≥ 98,5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscopio			verticale a campo chiaro