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Il saggio di legatura di prossimità consente l'individuazione, la localizzazione e la quantificazione della metilazione della proteina arginina nel tessuto fisso

DOI:

10.3791/64294

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université de Lyon, 2Inserm U1052, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3CNRS UMR5286, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 4Pathology Department, Centre Leon Bérard, 5Plateforme Anatomopathologie Recherche

In This Article

Summary

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Il saggio di legatura di prossimità è una tecnica molto utile per localizzare e quantificare la metilazione dell'arginina di una data proteina quando il residuo di arginina modificato è sconosciuto e/o se non è disponibile alcun anticorpo specifico.

Abstract

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La metilazione dell'arginina sta emergendo come una modificazione post-traduzionale chiave coinvolta in una vasta gamma di processi biologici. Il suo studio nei tessuti è spesso limitato dalla mancanza di un anticorpo specifico che riconosca il residuo di arginina bersaglio. Il saggio di legatura di prossimità (PLA) è stato originariamente sviluppato per studiare le interazioni proteina/proteina. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo PLA dedicato alla rilevazione della metilazione dell'arginina che abbiamo applicato al recettore dei glucocorticoidi (GR). Avendo precedentemente dimostrato che PRMT5 dimetila i GR nelle cellule, abbiamo utilizzato il PLA con un anticorpo dimetilico pan simmetrico e un anticorpo anti-GR per misurare la metilazione del GR nei tumori della mammella. Dimostriamo che il PLA offre un approccio unico per misurare la metilazione dell'arginina di una proteina bersaglio, anche quando il sito di metilazione non è stato identificato. Questa tecnica potrebbe essere estesa ad altre modifiche post-traduzionali laddove siano disponibili anticorpi pan efficaci. Quindi, descriviamo in dettaglio la tecnologia PLA utilizzata per rilevare la metilazione dell'arginina nei tessuti fissati utilizzando la GR come esempio.

Introduction

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La metilazione dell'arginina da parte della proteina arginina metiltransferasi (PRMT) è un'abbondante modificazione post-traduzionale (PTM) coinvolta in numerosi processi biologici. I PRMT catalizzano il trasferimento di gruppi metilici dalla S-adenosil metionina ai residui di arginina. La famiglia PRMT comprende nove membri classificati in base al tipo di metilazione che svolgono. Tutti i membri eseguono la monometilazione (MMA). I PRMT di tipo 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 e 8) catalizzano la dimetilazione asimmetrica (ADMA), mentre i tipi 2 (PRMT5 e 9) catalizzano la dimetilazione simmetrica (SDMA) e il tipo 3 (PRMT7) generano solo MMA

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Protocol

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Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun paziente. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale del Centro di Ricerca sul Cancro di Lione.

1. Scelta degli anticorpi

  1. Utilizzare anticorpi primari convalidati da IHC o immunofluorescenza (IF).
    NOTA: Gli anticorpi primari selezionati per lo studio sono cruciali per il successo del PLA e più in particolare nei tessuti fissati. L'utilizzo di un anticorpo convalidato da IHC o IF aumenterà il tasso di successo dell'esperimento. L'ottimizzazione e la specificità degli anticorpi sono necess....

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Results

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Utilizzando la procedura sopra descritta, è possibile rilevare e quantificare la metilazione di una proteina di interesse. Qui, mostriamo l'esempio della metilazione del GR da parte di PRMT5. Gli anticorpi e le condizioni sperimentali per il PLA sono stati precedentemente applicati alle cellule10. In breve, gli anticorpi primari che hanno come bersaglio GR e SDMA sono riconosciuti da sonde di prossimità coniugate con oligonucleotidi complementari. Quindi, l'ibridazione di una sonda circolare di DN.......

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Discussion

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La metilazione dell'arginina, come altri PTM, contribuisce alla regolazione fine delle funzioni proteiche. Tuttavia, il suo impatto è sottovalutato a causa della difficoltà di valutare queste modifiche, principalmente a causa della mancanza di strumenti. Ciò è particolarmente vero quando si studia la metilazione in vivo, dove l'unico modo per misurare la metilazione dell'arginina è possedere anticorpi specifici che riconoscano il residuo metilato della proteina di interesse. Ciò.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse

Acknowledgements

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Ringraziamo B. Manship per la correzione delle bozze del manoscritto. Ringraziamo Laura Francols, Clémentine Le Nevé, Piattaforma di patologia di ricerca (CRCL) per l'assistenza tecnica. La figura 1 è stata creata utilizzando Servier Medical Art. Questo studio è stato sostenuto dalla Ligue Inter-régionale contre le Cancer e dall'Associazione: "Le Cancer du sein, parlons-en".

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Vetrini di adesione TOMO 90°, x100VWR631-1239
anticorpo anti-GR (topo)Santa Cruzsc393232
anticorpo anti-GR (topo)santa cruzsc393232
anticorpo anti-PRMT5 (coniglio)Merck07-405
anticorpo anti-SDMA (coniglio)CST13222
Automate d'inclusioneLeicaASP 6025Infiltrazione di paraffina e preparazione del blocco
Autostainer XLLeicaST5010Autostainer
Cassette Q path macrostar III  x1500VWR720-2233
CC1Roche5279801001
Citrato Tampone pH 6 10x, 100 mLMMFF/T0050
Diluente per anticorpi DakoDako AgilentS202230-2diluente anticorpale
Discovery ChromoMap Kit per diaminobenzidina (DAB)Roche760-159Kit per diaminobenzidina (DAB)
Discovery WashRoche7311079001
Duolink insitu. Kit PLA sonda anti-topo menoSigma-AldrichDUO92004PLA (sonda anti-coniglio meno)
Reagenti per rilevamento in situ Duolink in campo chiaroPLA DUO92012 Sigma-Aldrich(reagenti per rilevamento in situ)
Sonda PLA in situ Duolink anti-coniglio piùPLA Sigma-AldrichDUO92002(sonda anti-coniglio plus)
Tampone di lavaggio in situ Duolink in campo chiaroKit Sigma-AldrichDUO82047PLA (tampone di lavaggio in situ)
Etanolo 96% VOL TECHNISOLV, 5 LVWR83804.360
Etanolo assoluto ≥ 99,8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 LVWR20821.365
EZ Prep 10xRoche5279771001
Formol, pronto all'uso, 5 LMMFF/40877-36Formalina
Vetrino coprioggetti completamente automatizzatoLeicaCV5030Vetrino coprioggetti automatizzato
24 x 40Dutscher100037
HematoxylinVentana760-2021
Strumento IHCRocheDISCOVERY XTAutomazione di IHC
LCSRoche5264839001
MicrotomoThermo ScientificMicrom HM340ETaglio dei tessuti anche in blocchi
Terreno di montaggio PertexHistolab00801-FR
PAP Pen per immunocolorazioneSigma-AldrichZ672548-1EA
Cera di paraffina tek III, 4 x 2, 5 kgSakura4511
Pasteur Pipette monousoFisher Scientific12583237
PBS Tampone 10x, 100 mLMMFF/T0020
Tampone di reazione 10xRoche5353955001
Ribo Wash 10xRoche5266262001
RiboCC1Roche
Anticorpo secondario anti-topoAbcamab133469
Anticorpo secondario OmniMap anti-coniglio HRPRoche760-4311
Centro di inclusione tissutaleMMFEC 350
Xilene (miscela di isomeri) ≥ 98,5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 LVWR28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscopioverticale a campo chiaro
Kit kit 5266297001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Malbeteau, L., et al. How protein methylation regulates steroid receptor function. Endocrine Reviews. 43 (1), 160-197 (2021).
  3. Guccione, E., Richard, S.

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Proximity Ligation AssayArginine MethylationProtein MethylationFixed TissuePost Translational ModificationGlucocorticoid ReceptorPRMT5 DimethylationPan Dimethyl AntibodyProtein LocalizationProtein Quantification
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