Il saggio di legatura di prossimità è una tecnica molto utile per localizzare e quantificare la metilazione dell'arginina di una data proteina quando il residuo di arginina modificato è sconosciuto e/o se non è disponibile alcun anticorpo specifico.
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Articolo metodologico
Il saggio di legatura di prossimità consente l'individuazione, la localizzazione e la quantificazione della metilazione della proteina arginina nel tessuto fisso
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La metilazione dell'arginina sta emergendo come una modificazione post-traduzionale chiave coinvolta in una vasta gamma di processi biologici. Il suo studio nei tessuti è spesso limitato dalla mancanza di un anticorpo specifico che riconosca il residuo di arginina bersaglio. Il saggio di legatura di prossimità (PLA) è stato originariamente sviluppato per studiare le interazioni proteina/proteina. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo PLA dedicato alla rilevazione della metilazione dell'arginina che abbiamo applicato al recettore dei glucocorticoidi (GR). Avendo precedentemente dimostrato che PRMT5 dimetila i GR nelle cellule, abbiamo utilizzato il PLA con un anticorpo dimetilico pan simmetrico e un anticorpo anti-GR per misurare la metilazione del GR nei tumori della mammella. Dimostriamo che il PLA offre un approccio unico per misurare la metilazione dell'arginina di una proteina bersaglio, anche quando il sito di metilazione non è stato identificato. Questa tecnica potrebbe essere estesa ad altre modifiche post-traduzionali laddove siano disponibili anticorpi pan efficaci. Quindi, descriviamo in dettaglio la tecnologia PLA utilizzata per rilevare la metilazione dell'arginina nei tessuti fissati utilizzando la GR come esempio.
Introduzione
La metilazione dell'arginina da parte della proteina arginina metiltransferasi (PRMT) è un'abbondante modificazione post-traduzionale (PTM) coinvolta in numerosi processi biologici. I PRMT catalizzano il trasferimento di gruppi metilici dalla S-adenosil metionina ai residui di arginina. La famiglia PRMT comprende nove membri classificati in base al tipo di metilazione che svolgono. Tutti i membri eseguono la monometilazione (MMA). I PRMT di tipo 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 e 8) catalizzano la dimetilazione asimmetrica (ADMA), mentre i tipi 2 (PRMT5 e 9) catalizzano la dimetilazione simmetrica (SDMA) e il tipo 3 (PRMT7) generano solo MMA
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Protocollo
Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun paziente. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale del Centro di Ricerca sul Cancro di Lione.
1. Scelta degli anticorpi
- Utilizzare anticorpi primari convalidati da IHC o immunofluorescenza (IF).
NOTA: Gli anticorpi primari selezionati per lo studio sono cruciali per il successo del PLA e più in particolare nei tessuti fissati. L'utilizzo di un anticorpo convalidato da IHC o IF aumenterà il tasso di successo dell'esperimento. L'ottimizzazione e la specificità degli anticorpi sono necess....
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Risultati
Utilizzando la procedura sopra descritta, è possibile rilevare e quantificare la metilazione di una proteina di interesse. Qui, mostriamo l'esempio della metilazione del GR da parte di PRMT5. Gli anticorpi e le condizioni sperimentali per il PLA sono stati precedentemente applicati alle cellule10. In breve, gli anticorpi primari che hanno come bersaglio GR e SDMA sono riconosciuti da sonde di prossimità coniugate con oligonucleotidi complementari. Quindi, l'ibridazione di una sonda circolare di DN.......
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Discussione
La metilazione dell'arginina, come altri PTM, contribuisce alla regolazione fine delle funzioni proteiche. Tuttavia, il suo impatto è sottovalutato a causa della difficoltà di valutare queste modifiche, principalmente a causa della mancanza di strumenti. Ciò è particolarmente vero quando si studia la metilazione in vivo, dove l'unico modo per misurare la metilazione dell'arginina è possedere anticorpi specifici che riconoscano il residuo metilato della proteina di interesse. Ciò.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse
Ringraziamenti
Ringraziamo B. Manship per la correzione delle bozze del manoscritto. Ringraziamo Laura Francols, Clémentine Le Nevé, Piattaforma di patologia di ricerca (CRCL) per l'assistenza tecnica. La figura 1 è stata creata utilizzando Servier Medical Art. Questo studio è stato sostenuto dalla Ligue Inter-régionale contre le Cancer e dall'Associazione: "Le Cancer du sein, parlons-en".
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini di adesione TOMO 90°, x100 | VWR | 631-1239 | |
| anticorpo anti-GR (topo) | Santa Cruz | sc393232 | |
| anticorpo anti-GR (topo) | santa cruz | sc393232 | |
| anticorpo anti-PRMT5 (coniglio) | Merck | 07-405 | |
| anticorpo anti-SDMA (coniglio) | CST | 13222 | |
| Automate d'inclusione | Leica | ASP 6025 | Infiltrazione di paraffina e preparazione del blocco |
| Autostainer XL | Leica | ST5010 | Autostainer |
| Cassette Q path macrostar III x1500 | VWR | 720-2233 | |
| CC1 | Roche | 5279801001 | |
| Citrato Tampone pH 6 10x, 100 mL | MMF | F/T0050 | |
| Diluente per anticorpi Dako | Dako Agilent | S202230-2 | diluente anticorpale |
| Discovery ChromoMap Kit per diaminobenzidina (DAB) | Roche | 760-159 | Kit per diaminobenzidina (DAB) |
| Discovery Wash | Roche | 7311079001 | |
| Duolink insitu. Kit PLA sonda anti-topo meno | Sigma-Aldrich | DUO92004 | PLA (sonda anti-coniglio meno) |
| Reagenti per rilevamento in situ Duolink in campo chiaro | PLA DUO92012 Sigma-Aldrich | (reagenti per rilevamento in situ) | |
| Sonda PLA in situ Duolink anti-coniglio più | PLA Sigma-Aldrich | DUO92002 | (sonda anti-coniglio plus) |
| Tampone di lavaggio in situ Duolink in campo chiaro | Kit Sigma-Aldrich | DUO82047 | PLA (tampone di lavaggio in situ) |
| Etanolo 96% VOL TECHNISOLV, 5 L | VWR | 83804.360 | |
| Etanolo assoluto ≥ 99,8%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 20821.365 | |
| EZ Prep 10x | Roche | 5279771001 | |
| Formol, pronto all'uso, 5 L | MMF | F/40877-36 | Formalina |
| Vetrino coprioggetti completamente automatizzato | Leica | CV5030 | Vetrino coprioggetti automatizzato |
| 24 x 40 | Dutscher | 100037 | |
| Hematoxylin | Ventana | 760-2021 | |
| Strumento IHC | Roche | DISCOVERY XT | Automazione di IHC |
| LCS | Roche | 5264839001 | |
| Microtomo | Thermo Scientific | Microm HM340E | Taglio dei tessuti anche in blocchi |
| Terreno di montaggio Pertex | Histolab | 00801-FR | |
| PAP Pen per immunocolorazione | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Cera di paraffina tek III, 4 x 2, 5 kg | Sakura | 4511 | |
| Pasteur Pipette monouso | Fisher Scientific | 12583237 | |
| PBS Tampone 10x, 100 mL | MMF | F/T0020 | |
| Tampone di reazione 10x | Roche | 5353955001 | |
| Ribo Wash 10x | Roche | 5266262001 | |
| RiboCC1 | Roche | ||
| Anticorpo secondario anti-topo | Abcam | ab133469 | |
| Anticorpo secondario OmniMap anti-coniglio HRP | Roche | 760-4311 | |
| Centro di inclusione tissutale | MMF | EC 350 | |
| Xilene (miscela di isomeri) ≥ 98,5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 28975.360 | |
| Zeiss Axio Imager M2 microscopio | verticale a campo chiaro |
Riferimenti
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Malbeteau, L., et al. How protein methylation regulates steroid receptor function. Endocrine Reviews. 43 (1), 160-197 (2021).
- Guccione, E., Richard, S.
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Ristampe e permessi
