Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

L'editing del genoma nei topi vivi è stato notevolmente semplificato ed è diventato accessibile e più conveniente dall'emergere dell'editing CRISPR ^1,2,3. I primi tentativi di modifica animale hanno utilizzato la microiniezione per fornire mRNA / sgRNA CRISPR Cas9 in embrioni in stadio pronucleare ^4,5,6. Mentre la microiniezione è abbastanza efficace, la quantità di pratica richiesta per padroneggiarla completamente potrebbe non essere appropriata per tirocinanti e studenti e richiede anche attrezzature costose che un laboratorio finanziato modestamente non è in grado di permettersi. La microiniezione viene normalmente eseguita da tecnici esperti in strutture transgeniche con orari e prezzi di servizio che sono limitanti per molti ricercatori. Un approccio più accessibile è quello dell'elettroporazione, che si è dimostrata abbastanza efficace per la consegna di mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 in embrioni in stadio pronucleare⁷. Ulteriori miglioramenti nelle strategie di editing e consegna del genoma CRISPR hanno suggerito che gli RNP pre-assemblati già impegnati con sgRNA possono essere un mezzo efficace per ridurre il mosaicismo⁸.

La logica alla base dello sviluppo e dell'uso di questo protocollo era quella di aggirare molte delle limitazioni e degli ostacoli associati alla microiniezione. Come suggerisce il nome, un metodo semplice, interno ed economico che potrebbe determinare rapidamente se vale la pena utilizzare progetti di sgRNA non testati durante un esperimento di microiniezione sarebbe una fase di controllo della qualità di primo passaggio molto conveniente (Figura 1). Mentre questo metodo non può sostituire la microiniezione per strategie più complesse, come l'introduzione di lunghe sequenze di DNA del donatore per risultati basati sulla ricombinazione, è ideale per strategie meno complesse come piccole delezioni o inserzioni e geni di marcatura. Questo metodo è appropriato per i ricercatori con competenze di base di manipolazione embrionale che hanno semplici esigenze di editing, vorrebbero testare la loro ipotesi entro il periodo di tempo dello sviluppo preimpianto o preferiscono testare gli sgRNA negli embrioni prima di fissare un appuntamento con uno specialista di microiniezione. Qui, i reagenti di editing vengono consegnati transitoriamente in embrioni in stadio pronucleare come RNP Cas9 / sgRNA tramite elettroporazione (una serie di impulsi elettrici) per massimizzare l'efficienza diminuendo il mosaicismo⁸. Utilizzando un metodo di genotipizzazione embrionale, i risultati di editing sono disponibili in circa 1 settimana⁹, riducendo così la necessità di varie applicazioni di microiniezione a un costo significativamente ridotto.

L'efficacia di questo metodo raggiunge il picco allo stadio embrionale pronucleare, quando l'embrione non ha ancora fuso i pronuclei materno e paterno o è entrato nella fase S (Figura 2). La superovulazione viene utilizzata per massimizzare il numero di zigoti, ma produce sia zigoti pronucleari che uova non fecondate. Gli zigoti sani possono anche essere preselezionati prima dell'elettroporazione per aumentare l'efficienza complessiva. Poiché altri protocolli di elettroporazione hanno modificato in modo efficiente gli zigoti senza la necessità di includere un passo simile 7,10,11,12,13,14,15^, un passo opzionale di questo protocollo è la leggera erosione della zona pellucida (ZP). La ZP è uno strato glicoproteico che aiuta il legame degli spermatozoi, la risposta degli acrosomiali e la fecondazione che circondano gli embrioni in stadio pronucleare. Nella nostra esperienza, abbiamo scoperto che una delicata erosione a base acida della ZP fornisce una consegna affidabile dell'elettroporazione Cas9 RNP con un impatto solo marginale sulla vitalità.

Abbiamo osservato tassi di rilascio di RNP fino al 100% di efficienza tramite elettroporazione in ceppi di topo che sono comunemente usati nella ricerca come C57BL / 6J e C57BL / 6N ^9,16. Gruppi indipendenti hanno anche sviluppato procedure basate sull'elettroporazione con efficienze superiori o corrispondenti alla microiniezione 11,12,13,14,15,17, con protocolli di elettroporazione che funzionano bene nel ratto^18,19, nel maiale 20,21,22 e nella mucca ²³ , quindi suggeriamo ai lettori di confrontare i protocolli per trovare le condizioni che meglio si adattano alle loro esigenze sperimentali e di attrezzature. Il sistema qui descritto utilizza materiali e attrezzature comuni, che richiedono solo abilità di manipolazione embrionale di base. Questa tecnica è efficace per una serie di strategie di editing, rendendo questo metodo ampiamente accessibile alla comunità di ricerca.

La progettazione di piccoli RNA guida ideali (sgRNA) è essenziale per un editing efficiente. Raccomandiamo lo screening di due o tre strategie di sgRNA per sito bersaglio direttamente negli embrioni di topo, specialmente se si desidera generare linee di topo. Una volta progettati, si raccomandano metodi privi di clonazione come la trascrizione in vitro (IVT) per produrre sgRNA di alta qualità³. Gli RNP e gli sgRNA sono mescolati con 30-50 embrioni in stadio pronucleare processati ed esposti a una serie di impulsi elettrici per prima permeabilizzare temporaneamente la ZP e la membrana cellulare, con impulsi successivi per mantenere i pori aperti ed elettroforese gli RNP attraverso lo zigote²⁴. Dopo l'ottimizzazione, abbiamo scoperto che sei impulsi da 3 ms a 30 V per embrioni di massa (~ 50) erano ottimali per l'efficacia e la vitalità dell'editing, fornendo una consegna altamente efficiente di Cas9 / sgRNA RNP ^9,16,25. Gli eventi di editing nella morula di topo possono essere confermati utilizzando una varietà di strategie di convalida comuni per l'editing CRISPR, come il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP), la digestione dell'endonucleasi T7 e il sequenziamento Sanger della regione di interesse²⁶.

Il metodo attuale è più appropriato per semplici schemi di editing (Figura 3), come inserimento/delezioni (indel), delezioni di dimensioni esone dell'ordine di 500-2000 bp e la consegna di mutazioni puntiformi e piccole inserzioni come tag C- o N-terminali (ad esempio, FLAG, HA o V5)^9,16,27. Il potenziale per l'editing del genoma complesso, come grandi inserzioni di tag fluorescenti o alleli condizionali, rimane incerto ed è attualmente al centro dei prossimi miglioramenti.

Questo metodo è facilmente padroneggiabile e può essere utilizzato per testare rapidamente gli sgRNA in embrioni di topo in coltura in 1 settimana⁹ (Figura 1). Presentato in questo lavoro è un protocollo in sei fasi, che include 1) progettazione di sgRNA; 2) sintesi di sgRNA; 3) superovulazione e accoppiamento; 4) coltura, raccolta e trattamento di embrioni; 5) assemblaggio RNP ed elettroporazione; 6) coltura embrionale e genotipizzazione. Vengono fornite informazioni su tutti i materiali utilizzati (Tabella dei materiali). Come controllo positivo, i reagenti per modificare il locus della tirosinasi (Tyr) ^9,16 sono stati inclusi nella tabella supplementare 1.

Tutta la cura e l'uso degli animali in questo protocollo hanno aderito alle politiche dell'Animal Welfare Act della Guida ILAR per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e hanno seguito le linee guida dell'AVMA per l'eutanasia e le linee guida e le politiche del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della Pennsylvania. Il protocollo di cura e utilizzo degli animali è stato esaminato e approvato dall'Università della Pennsylvania IACUC per questo progetto. Per una questione di conformità e cautela, si prega di cercare tutte le autorizzazioni necessarie prima di tentare questo protocollo.

1. sgRNA e design oligo donatore opzionale

1. Progettazione di sgRNA
   1. Seleziona gli sgRNA candidati da qualsiasi algoritmo online ampiamente utilizzato, come Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)²⁸ o CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)²⁹. Poiché ogni piattaforma è unica, leggere attentamente le istruzioni per l'utente al fine di progettare sgRNA ideali. Per gli esperimenti in/del, selezionare da due a tre sgRNA da testare. Per le delezioni, vengono suggeriti sgRNA che fiancheggiano la regione bersaglio, ad esempio due sgRNA a monte del bersaglio e due sgRNA a valle del bersaglio.
      NOTA: Mentre vari algoritmi sgRNA online tengono conto dei fuori bersaglio per evitare progetti di sgRNA difettosi, lo strumento BLAST di NCBI è utile per confermare la qualità delle sequenze di sgRNA selezionate.
   2. Inserire 19-20 nucleotidi (nt) determinati dal passo precedente (1.1.1) nella regione variabile dell'oligo sgRNA (Tabella supplementare 1) e acquistare sgRNA sintetizzati come oligo di DNA personalizzati.
      NOTA: la purificazione della PAGINA non è necessaria.
2. (Facoltativo) Progettazione oligo del donatore per knock-in mediato da riparazione diretta dall'omologia (HDR).
   1. Progettare l'appropriato oligodesossinucleotide a singolo filamento (ssODN) in base al risultato sperimentale desiderato (mutazione puntiforme precisa, inserimento di loxP, inserimento di piccoli tag, ecc.), mantenendo la lunghezza totale a 100-200 nt con bracci di omologia di 50 nt o più che fiancheggiano la regione centrale.
   2. Per garantire una maggiore efficienza knock-in, progettare l'sgRNA in modo che sia complementare all'ssODN³⁰ e sostituire la sequenza del motivo adiacente del protospaziatore (PAM) con una mutazione silenziosa per prevenire il taglio ricorrente da parte dell'enzima Cas9.
   3. Ordina ssODN utilizzando l'opzione oligo personalizzata.

2. Sintesi di sgRNA

1. Generazione di modelli per la trascrizione in vitro (IVT)
   1. Per generare il modello di DNA per l'IVT sgRNA attraverso la PCR, preparare una reazione IVT in una provetta a striscia PCR priva di RNAsi. (cfr . tabella supplementare 2).
   2. Utilizzare le seguenti condizioni di termociclatore:
      95 °C per 2 min; 30 cicli di 95 °C per 2 min, 57 °C per 10 s e 72 °C per 10 s; poi 72 °C per 2 min
   3. Per verificare il successo della reazione PCR del modello di DNA sgRNA, elettroforesi 5 μL del prodotto combinati con 1 μL di colorante di carico 6x su un gel di agarosio al 2% (wt/vol).
      NOTA: la dimensione prevista del prodotto è di 127 bp. Qualsiasi reazione PCR residua può essere conservata a -20 °C per un massimo di 5 mesi.
2. Trascrizione in vitro (IVT) di sgRNA
   1. Per generare l'sgRNA, preparare la miscela di reazione (T7 IVT secondo le istruzioni del produttore) in un tubo PCR e mescolare i reagenti.
      NOTA: vedere la tabella supplementare 3 per l'esempio di impostazione della reazione. La reazione IVT è sensibile alla contaminazione da RNasi; pertanto, fare ogni sforzo per fornire un ambiente privo di RNasi.
   2. Per consentire l'inizio e il proseguimento della reazione, incubare la miscela di reazione IVT per >18 ore a 37 °C in un termociclatore o in un blocco termico.
   3. Per degradare il modello originale di DNA (fase 2.1.3), introdurre 1 μL di DNasi I (2 unità per reazione) e incubare la reazione per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
   4. Per promuovere il legame dell'RNA alle sfere di purificazione magnetica, combinare 129 μL di etanolo al 100% nella reazione, che ora sarà 150 μL.
   5. Per risospendere le perle di depurazione, che tendono a depositarsi durante lo stoccaggio, vortice l'aliquota per almeno 10 s.
   6. Per purificare gli sgRNA, aggiungere 100 μL delle sfere risospese (fase 2.2.5) alla reazione IVT (fase 2.2.4) e mescolare delicatamente pipettando su e giù 10x.
   7. Per consentire il rilegamento, lasciare riposare la miscela a RT per 5 minuti.
   8. Per isolare l'sgRNA dai prodotti di reazione non incorporati, posizionare la reazione sui supporti magnetici per 5 minuti a RT e attendere che si formi un piccolo pellet.
   9. Per lavare gli sgRNA, prima scartare accuratamente il surnatante e quindi aggiungere 200 μL di etanolo all'80% lontano dal pellet.
      NOTA: Durante la fase di lavaggio dell'etanolo all'80% (vol/vol), è fondamentale evitare di disturbare il pellet mediante pipettaggio, in quanto ciò ridurrà considerevolmente le concentrazioni di sgRNA. Invece, pipettare delicatamente l'etanolo all'80% in modo che il pellet sia immerso e rimuovere delicatamente il volume con una pipetta.
   10. Ripetere il passaggio precedente (punto 2.2.9) e asciugare all'aria il pellet per non più di 5-6 minuti o l'sgRNA sarà associato in modo permanente alle perle.
   11. Eluire l'sgRNA con 20μL di acqua priva di nucleasi pipettando il pellet 10x, incubandolo per 2 minuti a (RT), quindi riposizionandolo sul supporto magnetico per separare le perle dallo sgRNA ora purificato.
   12. Per valutare la qualità e la quantità dello sgRNA, utilizzare uno strumento come uno spettrofotometro o un bioanalizzatore. In alternativa, su un gel di agarosio al 2%, eseguire 2 μL di sgRNA, simile al punto 2.1.3.
       NOTA: La qualità è confermata da un'unica banda chiara. Il resto dello sgRNA può essere utilizzato immediatamente o conservato in condizioni di -80 °C.

3. Superovulazione

1. Per fornire abbastanza embrioni per testare ogni disegno di sgRNA, superovulare da due a tre femmine C57BL / 6J che hanno tra 3-5 settimane, come descritto in precedenza⁹. Si raccomanda di elettropolare 20-30 embrioni per sgRNA per generare risultati sufficienti a confermare l'efficacia.
   NOTA: Se la fecondazione ha successo, aspettatevi 10-20 embrioni per accoppiamento.
2. Per indurre l'ovulazione, seguire questo programma di iniezione ormonale:
   1. Giorno 1: Somministrare 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG) (100 μL) attraverso un'iniezione intraperitoneale (IP) utilizzando una siringa da 26 G in topi femmina di 3-5 settimane.
   2. Giorno 3: Dopo 46-48 ore di iniezione di PMSG, iniettare 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) (100 μL) attraverso un'iniezione IP per indurre l'ovulazione.
   3. Per impostare l'allevamento, accoppiare le femmine 1: 1 con un maschio di allevamento affidabile subito dopo l'iniezione di hCG.
      NOTA: Per evitare che gli ormoni si degradino e perdano attività, eseguire iniezioni sotto 30 minuti di scongelamento.

4. Raccolta e trattamento degli embrioni

1. Raccolta di embrioni
   1. Per eutanasia le donne e recuperare il materiale necessario, come precedentemente descritto³¹, assicurati di confermare prima il metodo appropriato in conformità con le politiche istituzionali. Ad esempio, utilizzare asfissia da CO₂ , lussazione cervicale e / o altri metodi approvati.
      NOTA: Normalmente, >75% delle femmine stimolate dagli ormoni mostra tappi copulatori, indicando un accoppiamento riuscito.
   2. Per evitare che i peli rendano difficile la raccolta dei tessuti, posizionare le femmine eutanasizzate, sulla schiena e spruzzare etanolo al 70% (vol / vol) sulla regione dell'addome da aprire chirurgicamente.
      NOTA: Da questo punto in poi, si consiglia di eseguire le fasi chirurgiche in una cappa ventilata al fine di mantenere un ambiente asettico e ridurre il potenziale di contaminazione.
   3. Per aprire la cavità addominale e rimuovere gli ovidotti, tagliare lo strato di pelle / capelli (sottocutaneo) con forbici chirurgiche e individuare le ovaie (Figura 4), che si trovano vicino al rene e condividono una sezione di un cuscinetto adiposo. Gli ovidotti si trovano prossimalmente alle ovaie (Figura 4). Rimuovere chirurgicamente entrambi gli ovidotti dalla femmina e inserirli in singole goccioline da 50 μL di terreno M2+BSA (4 mg/mL BSA) (Figura 5A).
      NOTA: le istruzioni dettagliate per questa sezione della procedura possono essere visualizzate visivamente³¹ o seguite gradualmente⁹ utilizzando protocolli pubblicati in precedenza.
   4. Per rilasciare i complessi cumulo-ovocita (CoC) contenenti ovociti (Figura 4), utilizzare una pinza da dissezione per incidere l'ampolla dell'ovidotto durante la visualizzazione attraverso uno stereomicroscopio.
   5. Per ridurre la quantità di detriti (sangue, grasso, tessuto), trasferire e combinare ogni CoC in una singola goccia da 50 μL di materiale M2+BSA con una pipetta portatile impostata su 20-30 μL per evitare il trascinamento di detriti.
2. Rimozione delle cellule del cumulo
   1. Per iniziare la rimozione delle cellule cumuliformi dagli zigoti (Figura 4), trasferire CoC con il minor mezzo extra possibile a una goccia di 100 μL M2 + ialuronidasi (Figura 5B) e mescolare delicatamente pipettando i CoC fino a quando gli embrioni sono visibilmente separati dalle cellule cumuliformi molto più piccole. Assicurati di mantenere al minimo l'esposizione di M2 + ialuronidasi agli embrioni, poiché potrebbe influire sulla vitalità.
      NOTA: Si può preriscaldare (37 °C) o aggiungere altri 50 μL di M2+ialuronidasi se gli embrioni non si separano dalle cellule del cumulo entro 2 minuti.
   2. Per diluire la ialuronidasi ed eliminare le cellule cumuliformi sciolte dagli zigoti, utilizzare una pipetta azionata dalla bocca per spostare gli zigoti in una goccia fresca di 50 μL M2 + BSA.
      NOTA: la maggior parte dei passaggi oltre questo punto richiede l'uso di una pipetta azionata a bocca, se non diversamente specificato. Mentre il rischio di contaminazione da parte dell'utente è basso, si consiglia l'uso di un filtro dell'aria in linea per mantenere un ambiente asettico. Si prega di fare riferimento ai metodi precedentemente descritti per preparare e utilizzare questo strumento ^9,31.
   3. Utilizzando una pipetta orale, far passare gli embrioni attraverso almeno altre quattro o cinque goccioline M2+BSA da 50 μL per ridurre il numero di cellule cumuliformi.
3. (FACOLTATIVO) Diradamento della zona pellucida con soluzione acida di tirodro (AT).
   1. Per erodere la zona pellucida dell'embrione e ridurre ulteriori ostacoli fisici per la somministrazione del reagente, trasferire gli embrioni in una goccia preriscaldata (37 °C) da 100 μL di soluzione AT su una piastra di 60 mm (Figura 5C). Osservare continuamente gli zigoti usando uno stereomicroscopio fino a quando circa il 30% della zona pellucida viene eroso⁹. L'esposizione totale all'AT deve essere di 60-90 s. L'esposizione prolungata all'AT può dissolvere completamente la zona pellucida e compromettere la vitalità dell'embrione.
      NOTA: Per istruzioni dettagliate e immagini di questa sezione della procedura, fare riferimento^{ai metodi 9,16} pubblicati in precedenza.
   2. Per diluire l'AT, utilizzare una pipetta orale per far passare gli embrioni attraverso almeno quattro goccioline da 50 μL di M2+BSA.
   3. Per determinare se è stato elaborato un numero adeguato di embrioni, utilizzare uno stereomicroscopio per contare gli embrioni. A seconda del numero di topi femmina utilizzati, ci si può aspettare circa 10-20 zigoti vitali per femmina.
      NOTA: In questa fase, gli embrioni dovrebbero essere relativamente privi di detriti che impedirebbero la valutazione della quantità e della qualità. Ad esempio, se si utilizzano cinque femmine, il numero di zigote atteso sarebbe probabilmente compreso tra 50-100 e un contatore di cellule meccanico sarebbe appropriato per tenere traccia degli embrioni. È comune perdere circa il 10% -20% degli embrioni a causa della mancata fecondazione o dell'ovulazione di ovociti di bassa qualità. Durante la fase successiva, conservare brevemente gli embrioni in 50 μL di M2+BSA per non più di 30 minuti in un'incubatrice.

5. Assemblaggio RNP ed elettroporazione

1. Assemblaggio RNP
   1. Per assemblare il complesso RNP, utilizzare le tabelle di esempio allegate per combinare le miscele di reazione appropriate in base alla strategia di editing desiderata nel buffer RNP (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% glicerolo e 100 mM Tris (2-carbossietil)fosfina cloridrato [TCEP] in acqua priva di nucleasi)
      NOTA: TCEP è un agente riducente conveniente ma ha una breve emivita in soluzioni acquose; pertanto, aggiungere TCEP appena prima dell'assemblaggio complesso RNP.
      1. Per gli indels mediati da end join non omologhi (NHEJ), fare riferimento alla Tabella supplementare 4.
      2. Per l'editing mediato dalla riparazione diretta per omologia (HDR), fare riferimento alla Tabella supplementare 5.
      3. Per le delezioni ingegneristiche utilizzando sgRNA accoppiati, fare riferimento alla Tabella supplementare 6.
         1. Indipendentemente dalla strategia, combinare i reagenti desiderati a RT in una provetta PCR.
         2. Per consentire la formazione di complessi RNP, incubare la miscela per 10 minuti a 37 °C.
            NOTA: il complesso RNP può essere memorizzato in RT per un massimo di 1 ora.
2. Elettroporazione
   1. Per diluire la BSA prima dell'elettroporazione, far passare gli embrioni attraverso almeno due goccioline da 50 μL di media sierici ridotti.
      NOTA: BSA aumenta la resistenza durante l'elettroporazione e potrebbe danneggiare gli zigoti.
   2. Per preparare e miscelare gli zigoti (fase 4.3.2) con il complesso RNP (fase 5.1.1.2) per l'elettroporazione, pipettare in bocca 25-30 embrioni in una goccia da 10 μL di siero ridotto, quindi utilizzare una pipetta portatile per aggiungere 10 μL del complesso RNP (fase 5.1.1.2).
   3. Per diluire il glicerolo viscoso dal complesso RNP e omogeneizzare il campione, mescolare mediante pipettaggio 10x o fino a quando la miscela non mostra più segni di viscosità (pattern a vortice) utilizzando uno stereomicroscopio.
   4. Per preparare il campione per l'inserimento nell'elettroporatore, pipettare questa miscela di 20 μL di embrione + RNP in una cuvetta di elettroporazione da 0,1 cm evitando bolle.
   5. Per fornire i reagenti di editing nello zigote, elettroporare gli embrioni usando un protocollo ad onda quadra con queste condizioni: 30 V, 4-6 impulsi, lunghezza dell'impulso di 3 ms e intervalli di 100 impulsi.
   6. Per recuperare zigoti dalla cuvetta, utilizzare una pipetta manuale per erogare 50 μL di KSOM+BSA (1mg/mL BSA) nella parte superiore della cuvetta per lavare gli embrioni che potrebbero essersi depositati sul fondo. Pipettare delicatamente questa miscela e portarla su una piastra da 60 mm.
   7. Ripetere il punto 5.2.6 almeno 2x-3x e combinare ogni filo su una piastra di 60 mm fino al recupero della maggior parte degli embrioni.
      NOTA: Un recupero tipico è >90% degli embrioni originariamente caricati. Per garantire la sopravvivenza dell'embrione, testare l'incubatrice e controllare le date di scadenza per tutti i reagenti. Gli embrioni sono suscettibili a condizioni di coltura non ideali come temperatura, livello di CO₂ , umidità e pH.

6. Coltura embrionale e genotipizzazione

1. Coltura embrionale
   1. Per coltivare zigoti allo stadio desiderato, utilizzare una pipetta orale per trasferire 20-30 zigoti in una goccia di KSOM+BSA in una piastra di coltura pre-equilibrata e spostare gli embrioni nella goccia (Figura 5D). Incubare la piastra per una notte in 5% di CO₂, a 37 °C, con il 95% di umidità.
      NOTA: Pre-equilibrare posizionando una piastra di coltura preparata da 35 mm in un'incubatrice il giorno prima o almeno 4 ore prima dell'incubazione (Figura 5D).
   2. Per promuovere condizioni di crescita ideali, trasferire solo embrioni bicellulari il giorno seguente in una goccia fresca di miscela KSOM + BSA utilizzando uno stereomicroscopio e tornare all'incubatore. Assicurati di lasciare o scartare gli embrioni morti o non fecondati.
      NOTA: Gli embrioni in stadio nucleare crescono tipicamente in morule dopo 72 ore di coltura e blastocisti dopo 84 ore.
2. Genotipizzazione
   1. Per diluire i componenti del mezzo che potrebbero interferire con una reazione PCR, lavare gli embrioni di morula/blastocisti usando una pipetta orale passando attraverso due gocce di DPBS.
   2. Per caricare singoli embrioni per la lisi, trasferire singoli embrioni in un pozzetto di una striscia PCR a 8 pozzetti impostando una pipetta su 1 μL, quindi aggiungere 10 μL di tampone di lisi (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mM MgCl 2, 0,1 mg/mL gelatina, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20, 0,2 mg/mL proteinasi K in H₂ O privo di nucleasi).
      NOTA: Aggiungere la proteinasi K appena prima di preparare il tampone di lisi.
   3. Per lisare gli embrioni, programmare un termociclatore a 55 °C per 4 ore, quindi inattivare la proteinasi K con un'incubazione di 10 minuti a 95 °C.
      NOTA: in particolare per gli utenti alle prime armi, tentare un esperimento di modifica presso i loci Tyr . Questo flusso di lavoro è stato ottimizzato e può fungere da controllo positivo. Se necessario, conservare i lisati embrionali a 4 °C per 2-3 giorni o nel congelatore per un massimo di 2 settimane prima dell'analisi PCR. Prevenire ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
   4. Per aumentare le possibilità di successo dell'analisi di genotipizzazione, eseguire una strategia di PCR annidata amplificando frammenti di DNA leggermente più lunghi che fiancheggiano il sito bersaglio e regioni che verranno utilizzate per amplificare un frammento di DNA più preciso. Seguire le condizioni della tabella supplementare 7.
   5. Seguire le condizioni del termociclatore sotto indicate:
      95 °C per 2 min
      30+ cicli: 95 °C per 2 min, 60 °C per 10 s e 72 °C per 10 s
      72 °C per 2 min
   6. Per preparare il secondo stadio di una strategia di PCR annidata, effettuare una diluizione 1:10 del primo prodotto PCR (fase 6.2.5) e caricare 2 μL di questo nella successiva reazione PCR (con primer progettati per essere all'interno dell'amplicone precedente).
      NOTA: La prima reazione PCR deve essere diluita per ridurre il trascinamento dei primer fiancheggianti nella seconda reazione PCR. Preparare la PCR annidata seguendo i passaggi della Tabella supplementare 8.
   7. Posizionare la reazione PCR in un termociclatore utilizzando le seguenti condizioni cicliche:
      95 °C per 2 min
      30 cicli: 95 °C per 2 min, 60 °C per 10 s e 72 °C per 10 s
      72 °C per 2 min
      NOTA: Normalmente, >90% delle reazioni PCR ha successo quando la dimensione dell'amplicone è di 500 bp o inferiore.
   8. (Controllo opzionale) Per le mutazioni in/del mediate da NHEJ che utilizzano Tyr come controllo positivo, digerire 10 μL dei prodotti della PCR nidificata dalla fase 6.2.7 incubando a 37 °C per 4 ore usando 10 U di HinfI in una reazione di 20 μL (vedere Tabella supplementare 9). Su un gel di agarosio al 2%, eseguire il prodotto digerito per valutare l'editing e utilizzare un prodotto PCR non digerito come controllo di carico. Eseguire il gel a 135 V per 30 minuti.
      NOTA: L'uso di HinfI come enzima di restrizione appropriato è stato selezionato a causa di un sito HinfI convenientemente posizionato presente all'interno della regione bersaglio dell'sgRNA che si prevede venga ablato dopo un editing NHEJ di successo. Un metodo dettagliato e i risultati sono stati precedentemente descritti ^9,16.
   9. (Controllo opzionale) Per le mutazioni mediate da HDR usando Tyr come controllo positivo, digerire 10 μL dei prodotti PCR nidificati dalla fase 6.2.7 incubando a 37 °C per 4 ore usando 10 U di EcoRI in una reazione di 20 μL (vedere Tabella supplementare 10). Su un gel di agarosio al 2%, eseguire il prodotto digerito per valutare l'editing e utilizzare un prodotto PCR non digerito come controllo di carico. Eseguire il gel a 135 V per 30 minuti.
      NOTA: La scelta di EcoRI come enzima di restrizione diagnostica sfrutta la sequenza originale trovata nella regione bersaglio dell'sgRNA, dove, dopo aver raggiunto con successo l'HDR, il sito HinfI naturale viene sostituito con un sito EcoRI e viene forzata una mutazione frameshift che interferisce con il gene Tyr. Per l'analisi HDR, eseguire sia analisi NHEJ (passaggio 6.2.8) che HDR (passaggio 6.2.9) su ciascun campione poiché entrambi i risultati possono verificarsi e possono aiutare a determinare il mosaicismo. Un metodo dettagliato e i risultati sono stati precedentemente descritti ^9,16.

Questo metodo genera più di 100 μg di sgRNA (20 μL a concentrazione di >6.000 ng/L) per un efficiente assemblaggio di RNP Cas9/sgRNA. Il metodo di superovulazione di routine qui descritto produce tipicamente 10-20 embrioni vitali per femmina collegata. A causa degli errori di manipolazione e delle perdite tipiche associate alla manipolazione degli embrioni, si prevede che l'80% degli embrioni sia fecondato, vitale e in condizioni eccellenti dopo l'elettroporazione. Per aiutare i ricercatori a eseguire un esperimento di successo, abbiamo fornito una strategia di esempio per indirizzare il locus Tyr del topo come controllo positivo (Figura 6), compresi i disegni oligo (Figura 6A, Tabella supplementare 1) e strategie di genotipizzazione per eventi NHEJ e HDR (Figura 6B) (fase 6.2). Esempi dettagliati di successo e risultati sperimentali sono disponibili 9,16.

In un precedente tentativo di confrontare questo protocollo con la microiniezione, collettivamente, oltre 30 distinti tentativi di modifica che coinvolgono sette laboratori distinti per generare modelli murini hanno avuto tutti successo 9,16. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per studiare e riferire sul primo retrotrasposone essenziale nello sviluppo dei mammiferi27. Quando si utilizza una strategia semplice come la somministrazione di un singolo sgRNA, la consegna di RNP è stata fino al 100% incluso nei ceppi murini C57BL/6J e C57BL/6N, con formazione in/del che si è verificata al 50-100% e piccole sostituzioni a base di oligo che vanno dal 14% al 63%9,16 (Tabella 1). Quando si ingegnerizzano le delezioni genomiche, l'efficacia dell'editing può variare dal 3% al 100%, dove i fattori che contribuiscono includono la posizione genomica, la progettazione dello sgRNA e la dimensione della delezione (Tabella 2). Ad esempio, le eliminazioni inferiori a 1.000 bp hanno più successo di quelle superiori a 1.000 bp 9,16.

Quando si utilizzano 60 embrioni per l'elettroporazione, questo protocollo supera la microiniezione in termini di efficacia di editing, risultando in 3-4 animali fondatori rispetto a un fondatore da microiniezione9. Per gli esperimenti di knockout genico nel ceppo di topi C57BL / 6N utilizzando sgRNA identico, questo metodo ha superato la microiniezione, producendo una media di quattro animali fondatori9 (Tabella 2). Per inserimenti di piccole dimensioni, come il tagging V5 o HA, gli ssODN fino a 162 nt sono stati testati con successo e gli sforzi sono attualmente finalizzati a scalare fino a 1000-2000 nt. Il successo di questi esperimenti dipende in gran parte dall'efficacia dell'sgRNA utilizzato affinché i risultati dell'HDR siano robusti. Quasi tutti i risultati HDR sono a mosaico, ma tra il 31% e il 64% degli embrioni mostra alcune prove di inserzioni 9,16.

Figura 1: Panoramica di CRISPR-EZ. Una panoramica grafica del flusso di lavoro. Una volta che una strategia e un design sono stati fatti, gli embrioni modificati possono essere generati e testati in circa 1 settimana. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. e Chen et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Tempistica ideale per eseguire la procedura. Il diagramma mostra le caratteristiche rilevanti e i punti temporali durante la prima divisione cellulare dopo la fecondazione. Per attuare questo approccio, ai ricercatori vengono forniti alcuni indizi visibili, come cambiamenti morfologici, stime del tempo del ciclo cellulare e marcatori chimici frequentemente osservati prima della prima scissione. Poiché i tempi esatti dell'inseminazione e della fecondazione sono sconosciuti, una raccomandazione sensata sarebbe quella di considerare l'ora 0 come mezzanotte. Prima che lo zigote entri nella fase S è il momento ideale per fornire macchinari di editing per NHEJ o HDR, che si traduce nell'esecuzione di questo protocollo tra le ore 7:00 e le 11:00 del mattino. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Successo delle strategie di editing. Strategie semplici come un singolo sgRNA si traducono in una riparazione in/del tramite NHEJ o una mutazione di precisione se combinate con un modello ssODN tramite HDR. La riparazione NHEJ può anche essere utilizzata per delezioni utilizzando più sgRNA. In generale, più semplice è la strategia, più efficace è CRISPR-EZ senza ulteriore ottimizzazione. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Localizzazione dell'ovidotto e dell'ampolla. Dopo aver isolato chirurgicamente i tessuti riproduttivi, si dovrebbe proteggere la regione applicando una leggera pressione sul cuscinetto adiposo con una pinza. Il cuscinetto adiposo è una regione relativamente sicura da manipolare per non danneggiare le ovaie / ovidotto. L'area nel quadrato tratteggiato deve essere rimossa e posizionata in una goccia di M2 per un'ulteriore dissezione. Un diagramma a fumetti mostra la regione di interesse con le strutture anatomiche pertinenti etichettate. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Elaborazione suggerita e impostazione della piastra di coltura. Schemi che mostrano varie configurazioni di piastre per aiutare i ricercatori a condurre sia l'elaborazione degli embrioni che la coltura. (A) Tipica piastra di lavaggio M2+BSA. (B) Piastra M2+ialuronidasi per l'asportazione delle cellule cumuliformi. (C) Piastra di soluzione AT opzionale per l'assottigliamento della zona. (D) Piastra KSOM+BSA per la coltura di embrioni, con rivestimento di olio minerale necessario per mantenere pH, umidità e temperatura. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Esempio di genotipizzazione per i risultati di NHEJ e HDR . (A) Un diagramma a fumetti della regione che circonda il gene Tyr nel genoma del topo. Di seguito sono riportati i dettagli della sequenza non modificata (WT) in cui si trova un sito di restrizione HinfI naturale, che si trova all'interno del sito di riconoscimento target dello sgRNA (testo rosso). Di seguito questo è uno dei tanti possibili risultati dopo il successo del targeting CRISPR / Cas9 in cui si forma un "in / del". L'esatta natura di questa modifica è difficile da prevedere, ma quasi certamente interromperà il sito HinfI. Più sotto c'è la sequenza oligo del donatore che cambia due coppie di basi per trasformare il sito HinfI in un sito di riconoscimento EcoRI. (B) Risultati del polimorfismo rappresentativo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) dopo la modifica. Vengono mostrati esempi di editing NHEJ (in alto) e HDR (in basso). Questa cifra è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Fenotipo e vitalità di zigoti e topi Tyr-modificati. Questa tabella è stata adattata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Risultati degli esperimenti di delezione CRISPR-EZ e microiniezione. Questa tabella è stata adattata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 1: Elenco degli oligo e dei donatori ssODN. Questa tabella è stata adattata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Modello di DNA per la configurazione della reazione sgRNA. Questa tabella è stata adattata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Impostazione della trascrizione in vitro . Questa tabella è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: Impostazione del complesso RNP per la formazione di NHEJ. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 5: Configurazione complessa RNP per la formazione di HDR. Questa tabella è stata adattata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 6: Configurazione complessa RNP per la cancellazione. Questa tabella è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 7: Impostazione della PCR genotipica. Questa tabella è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 8: Configurazione della PCR di genotipizzazione nidificata. Questa tabella è stata modificata con il permesso di Modzelewski et al.9. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 9: Impostazione del digest di restrizione HinfI. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 10: Impostazione del digest di restrizione EcoRi. Clicca qui per scaricare questo file.

Non ci sono dichiarazioni finanziarie rilevanti da parte degli autori.