Articolo metodologico

Sviluppo di un modello di ratto di sospensione del legamento uterosacrale

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DOI:

10.3791/64311

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17 agosto 2022

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1Department of Chemical Engineering, University of Virginia, 2Electrophysiology Division, Abbott, 3Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University of Virginia

In questo articolo

Sommario

Il prolasso degli organi pelvici colpisce milioni di donne in tutto il mondo e tuttavia alcuni interventi chirurgici comuni hanno tassi di fallimento fino al 40%. La mancanza di modelli animali standard per studiare questa condizione impedisce il progresso. Proponiamo il seguente protocollo come modello per la sospensione del legamento uterosacrale e il test di trazione in vivo .

Abstract

Il prolasso degli organi pelvici (POP) è un disturbo comune del pavimento pelvico (PFD) con il potenziale di avere un impatto significativo sulla qualità della vita di una donna. Circa il 10% -20% delle donne subisce un intervento chirurgico di riparazione del pavimento pelvico per trattare il prolasso negli Stati Uniti. I casi di PFD comportano un costo annuale complessivo di 26,3 miliardi di dollari solo negli Stati Uniti. Questa condizione multifattoriale ha un impatto negativo sulla qualità della vita e tuttavia le opzioni di trattamento sono diminuite solo nel recente passato. Un'opzione chirurgica comune è la sospensione del legamento uterosacrale (USLS), che viene tipicamente eseguita fissando la volta vaginale al legamento uterosacrale nel bacino. Questa riparazione ha una minore incidenza di complicanze rispetto a quelle con aumento della rete, ma è notevole per un tasso di fallimento relativamente alto fino al 40%. Considerando la mancanza di modelli animali standard per studiare la disfunzione del pavimento pelvico, vi è un'urgente necessità clinica di innovazione in questo campo con particolare attenzione allo sviluppo di modelli animali economici e accessibili. In questo manoscritto, descriviamo un modello di ratto di USLS che coinvolge un'isterectomia completa seguita dalla fissazione della volta vaginale rimanente al legamento uterosacrale. L'obiettivo di questo modello è quello di imitare la procedura eseguita sulle donne per poter utilizzare il modello per poi indagare strategie riparative che migliorino l'integrità meccanica dell'attacco legamentoso. È importante sottolineare che descriviamo anche lo sviluppo di una procedura di prova di trazione in situ per caratterizzare l'integrità dell'interfaccia in punti temporali scelti dopo l'intervento chirurgico. Nel complesso, questo modello sarà uno strumento utile per studi futuri che studiano le opzioni di trattamento per la riparazione POP tramite USLS.

Introduzione

Il prolasso degli organi pelvici (POP) è un disturbo comune del pavimento pelvico che colpisce milioni di donne in tutto il mondo con il potenziale di avere un impatto significativo su molti aspetti della vita di una donna, in particolare con l'etàdi 1 anno. In particolare, circa il 13% delle donne negli Stati Uniti subirà un intervento chirurgico per prolasso o incontinenza urinaria2. Una condizione più comune dopo la gravidanza e il parto, il prolasso è caratterizzato dalla discesa degli organi pelvici, prevalentemente i vari compartimenti della vagina e / o dell'utero, oltre la loro normale posizione nella cavità peritoneale. Ciò porta a fastidiosi sintomi di rigonfiamento vaginale o pressione, intestino, vescica e disfunzione sessuale e una qualità della vita complessivamente ridotta. Altri fattori di rischio per POP includono obesità, uso del tabacco, tosse cronica e costipazione3.

Nelle donne sane, gli organi del pavimento pelvico sono supportati dai muscoli elevatori ani, dai legamenti uterosacrali (USL), dai legamenti cardinali, dagli attacchi del tessuto connettivo al fianco pelvico e dalle strutture distali del corpo perineale 4,5. Le USL sono tra le più importanti strutture di supporto apicale sia per l'utero che per la vagina apicale e, quindi, sono spesso utilizzate nella correzione chirurgica del POP (Figura 1). Il supporto strutturale dell'USL deriva dal denso tessuto connettivo collagenoso nella regione sacrale che passa alla muscolatura liscia strettamente imballata. A causa di questo gradiente compositivo, l'USL si intreccia con la muscolatura uterina e vaginale per fornire un supporto robusto agli organi pelvici 6,7. Nella sospensione del legamento uterosacrale (USLS), le USL sono fissate alla volta vaginale a seguito di un'isterectomia, ripristinando la vagina e le strutture circostanti nella loro posizione anatomica nel compartimento addominale. Tuttavia, indipendentemente da una via transvaginale o laparoscopica, la procedura USLS è afflitta da un tasso di fallimento relativamente alto fino al 40% in alcuni studi 8,9. Il tasso di recidiva dei fastidiosi sintomi del rigonfiamento vaginale a 5 anni dopo la riparazione per il prolasso del compartimento apicale, come gli USL, è stato di circa il 40% in un ampio studio multicentrico randomizzato controllato9. Nello stesso studio, il ritrattamento per prolasso ricorrente a 5 anni è stato di circa il 10%. Il meccanismo di questo alto tasso di fallimento non è stato studiato, ma il ripristino della vagina e delle strutture circostanti nella loro posizione anatomica richiede il posizionamento della sutura nella regione collagenosa densa dell'USL10,11 piuttosto che nella regione della muscolatura liscia. Pertanto, l'alto tasso di fallimento potrebbe essere dovuto alla mancata corrispondenza meccanica e compositiva dell'interfaccia vagina-USL formata chirurgicamente rispetto alla completa integrazione osservata nell'attacco nativo cervicale-USL.

Anche l'impatto economico del trattamento di questi disturbi è notevole, con circa 300 milioni di dollari spesi ogni anno negli Stati Uniti per l'assistenza ambulatoriale12 e oltre 1 miliardo di dollari spesi ogni anno in costi diretti per le procedure chirurgiche13. Nonostante le vaste risorse economiche dedicate al trattamento di queste condizioni, le complicanze derivanti da molti interventi chirurgici al prolasso rimangono scoraggianti. Ad esempio, le riparazioni di prolasso apicale a base di rete in polipropilene, come la sacrocolpopessi, offrono tassi di successo più elevati rispetto alle riparazioni di tessuti nativi14, ma al costo di potenziali complicazioni come l'esposizione alla rete o l'erosione. La FDA ha ricevuto quasi 3.000 reclami relativi a complicazioni della rete solo tra il 2008 e il 2010. Ciò è culminato in un ordine della FDA di interrompere la produzione e la vendita di tutti i prodotti a rete transvaginale per POP nell'aprile 201915. Pertanto, vi è una forte necessità clinica di materiali diversi dal polipropilene e modelli con cui testarli, che possono aumentare le riparazioni del prolasso dei tessuti nativi e aumentare le percentuali di successo rispetto alle tecniche tradizionali con la sola sutura.

Dall'annuncio della FDA nel 2019, la maggior parte dei chirurghi pelvici ha smesso di usare la rete transvaginale per le riparazioni del prolasso, spingendo i ricercatori a cercare nuovi approcci di ingegneria tissutale per aumentare le riparazioni dei tessuti nativi16,17,18 come con le cellule stromali mesenchimali (MSC)9,20 . Con questo spostamento di attenzione, c'è un urgente bisogno di perfezionare i modelli animali che possono aiutare con lo sviluppo di nuovi materiali; La sfida in questo processo è bilanciare la rilevanza clinica con i costi. A tal fine, la scienza di base e i ricercatori clinici che studiano il prolasso degli organi pelvici hanno finora sfruttato diversi modelli animali, tra cui ratti, topi, conigli, pecore, suini e primati non umani19. Il processo di identificazione di un modello animale ottimale è impegnativo, poiché gli esseri umani sono bipedi, non hanno coda e hanno un processo di nascita traumatico rispetto ad altre specie di mammiferi20. I suini21 sono stati utilizzati per simulare la sacrocolpopessi robotica, mentre le pecore sono state utilizzate per simulare le riparazioni del prolasso vaginale22. Questi modelli animali, sebbene clinicamente rilevanti, sono limitati in termini di fattibilità dai costi e dalla manutenzione. I primati non umani sono stati utilizzati per studiare la patogenesi del prolasso; Le scimmie scoiattolo in particolare sono una delle poche specie diverse dall'uomo che possono sviluppare prolasso spontaneo, rendendole uno dei modelli animali più rilevanti20. I primati non umani sono stati utilizzati anche per studiare procedure chirurgiche ginecologiche come la sacrocolpopessi23 e il trapianto uterino24. Analogamente alle loro controparti ovine e suine, la limitazione principale dei primati non umani come modello animale di prolasso è il costo di manutenzione, cura e imbarco19.

Sebbene il bacino del roditore sia orientato orizzontalmente con un rapporto dimensioni del canale testa-nascita molto più piccolo rispetto agli esseri umani19, i ratti sono adatti per studi su piccoli animali di chirurgia USLS poiché hanno anatomia, cellularità, architettura istologica e composizione della matrice USL simili rispetto all'USL25 umano. Inoltre, sono vantaggiosi in termini di manutenzione e imbarco. Nonostante questi attributi benefici, non ci sono rapporti pubblicati di un modello di ratto di riparazione USLS. Pertanto, l'obiettivo è quello di descrivere un protocollo per l'isterectomia e USLS nel ratto Lewis multipare. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che mirano a studiare la fisiopatologia e le componenti chirurgiche del POP utilizzando questo modello animale accessibile.

Anatomia del pavimento pelvico femminile, diagramma del prolasso, sospensione del legamento uterosacrale, studio medico.
Figura 1: Prolasso degli organi pelvici . (A) Il normale orientamento degli organi nella cavità peritoneale e (B) la drammatica descenza degli organi quando si verifica il prolasso. Dopo l'isterectomia, la sospensione del legamento uterosacrale (C) ripristina la vagina e le strutture circostanti nella loro corretta posizione anatomica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocollo

Seguire tutte le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), ottenendo l'approvazione per tutte le procedure sugli animali prima di iniziare. I requisiti per la tecnica di chirurgia asettica possono essere trovati da The Guide26 e Animal Welfare Regulations27. Lo studio è stato approvato dal protocollo n. 4332-11-20 dell'Università della Virginia Institutional Animal Care and Use Committee. Ottenere allevatrici multipare (due cucciolate). I ratti dovrebbero essere alloggiati in un vivaio accreditato dall'American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care e forniti di cibo e acqua ad libitum. Gli animali in questo studio erano ratti Lewis ottenuti da Charles River e avevano un'età compresa tra 4 e 6 mesi per soddisfare il requisito di due cucciolate. Gli animali sono stati mantenuti su un ciclo luce-buio di 12 ore.

1. Riparazione del prolasso degli organi pelvici mediante sospensione del legamento uterosacrale

  1. Preparazione di attrezzature e aree chirurgiche per la chirurgia di animali vivi
    1. Preparare l'area chirurgica in modo tale che la tavola chirurgica venga riscaldata a 37 °C utilizzando cuscinetti riscaldanti per acqua calda a ricircolo insieme a un tampone impermeabile sterile. Garantire la sterilità della tavola chirurgica e dell'area chirurgica utilizzando un disinfettante per superfici privo di candeggina seguito da una salvietta di etanolo al 70%.
    2. Utilizzare la sterilizzazione termica dell'autoclave per sterilizzare tutte le forniture sicure per autoclave, inclusi strumenti chirurgici, spugne chirurgiche (garze), tamponi di cotone e un drappeggio monouso. Ottenere guanti chirurgici sterili confezionati.
    3. Procurarsi tagliatrici elettriche, unguento oftalmico, salviette etanolo, tamponi di cotone e soluzione di iodio, insieme a lama di bisturi e punti di sutura sterili confezionati e posizionare al banco di lavoro.
  2. Preparazione animale per la chirurgia di animali vivi
    1. Posizionare con cura l'animale in una camera per anestesia fornita con isoflurano al 2% e pesare l'animale dopo aver raggiunto il piano corretto di anestesia. La corretta anestesia è confermata quando l'animale non risponde a un pizzico del dito del piede.
    2. Posizionare l'animale sulla scheda chirurgica in posizione prona con il naso saldamente nel cono di anestesia fornito con isoflurano al 2%. Applicare un unguento oftalmico su ciascuno degli occhi degli animali.
    3. Somministrare analgesico oppioide e analgesico FANS per via sottocutanea (Tabella dei materiali).
    4. Porre l'animale in posizione supina, come mostrato nella Figura 2, e radere la pelliccia addominale dal processo xifoideo fino all'orifizio uretrale (8 cm x 4 cm). Sterilizzare l'addome con tre cariche di iodio e alcol per preparare il sito di incisione.
      NOTA: Se la rasatura provoca sanguinamento, raggiungere l'emostasi con pressione prima di preparare la pelle con iodio e tampone di preparazione dell'alcool. Mantenere lo iodio sulla pelle per 30 s.
    5. Se non è disponibile alcun assistente chirurgico, depositare forniture e strumenti sterili su un vassoio sterile per strumenti, inclusi tamponi di cotone sterili, drappeggi, spugne (garze), lama chirurgica, punti di sutura e marcatore chirurgico (opzionale). Se è disponibile un assistente chirurgico, questo passaggio può essere omesso e l'assistente può fornire gli strumenti sterili seguendo il passaggio 1.3.1.
  3. Isterectomia e sospensione del legamento uterosacrale (USLS)
    1. Indossare un camice chirurgico, copricapo, maschera e guanti sterili. Coprire l'animale con un campo sterile, lasciando esposto solo l'addome.
    2. Fai un'incisione di 7 cm lungo la linea alba da appena sotto il processo xifoideo alla linea inferiore del capezzolo usando una lama di bisturi. L'incisione dovrebbe terminare ~ 0,5-1,0 cm rostrale dall'orifizio uretrale. Quindi, fare un'incisione attraverso lo strato muscolare sottostante. Evitare il vaso sanguigno della parete addominale per prevenire il sanguinamento.
    3. Assemblare il divaricatore addominale e ispezionare la cavità addominale (Figura 3A). Usando una pinza per iride, localizzare delicatamente il corno uterino sinistro. L'utero è profondo all'interno dell'intestino, che è spesso la struttura incontrata per la prima volta entrando nella cavità peritoneale. È utile identificare prima l'ovaio (Figura 3B) e il cuscinetto adiposo ovarico associato.
    4. Sollevare delicatamente il corno uterino sinistro con una pinza o un morsetto per zanzare e iniziare l'isterectomia legando il corno sotto l'ovaio e l'ovidotto usando un morsetto per zanzare. Le ovaie sono strutture delicate e sono facilmente danneggiate o devascolarizzate. Fai attenzione quando elevi le corna uterine; Afferrare il corno a una distanza di sicurezza dall'ovaio per raggiungere questo obiettivo.
    5. Continuare l'isterectomia bloccando e tagliando la vascolarizzazione adiacente, il tessuto connettivo e il grasso dal corno uterino usando micro forbici. Bloccare il tessuto connettivo prima della rimozione per ridurre il sanguinamento. Posizionare i morsetti il più vicino possibile all'interfaccia uterina, fino alla giunzione uterocervicale (definita anche come biforcazione del corno).
    6. Morseggiare attraverso il corno uterino vicino al punto di biforcazione usando una pinza per zanzare (Figura 4A-C). Accisare il corno omolaterale appena cefalato al morsetto per evitare sanguinamento. Questo si trova tra la giunzione utero-cervicale (appena rostrale alla cervice) e il punto di legatura utero-tubarica. La volta vaginale rimarrà dopo l'isterectomia (Figura 4D).
      NOTA: A causa del piccolo calibro dei vasi di ratto, la legatura dei monconi uterini con un morsetto temporaneo era sufficiente per questo intervento chirurgico. Tuttavia, questa tecnica può essere modificata secondo necessità con la sigillatura dei peduncoli con elettrocauterizzazione o legatura di sutura.
    7. Ripetere i passaggi 1.3.3-1.3.6 sul corno uterino destro per eseguire un'isterectomia totale.
    8. Regolare il divaricatore addominale per esporre il bacino inferiore. Ispezionare la volta vaginale esposta e il pavimento pelvico supporta i tessuti legamentosi e connettivi, che possono essere visti attaccati alla vagina e alla cervice. Se possibile, identificare l'uretere bilateralmente, che è solo mediale alle ovaie.
    9. Identificare i legamenti uterosacrali28,29, mostrati in Figura 5A, che possono essere trovati attaccati alla cervice appena sotto i monconi rimanenti delle corna uterine (volta vaginale). Il legamento è tracciato in un orientamento cefalad-mediale verso l'osso sacro.
    10. Utilizzando una sutura di polidiaxanone 3-0 su un ago piccolo e affusolato, posizionare un punto attraverso il legamento uterosacrale sinistro. Posizionare il punto in alto sul legamento, vicino all'osso sacro.
    11. Tirare il punto per assicurarsi che abbia catturato il legamento uterosacrale: la struttura USL si inserisce nella cervice con l'origine che si immerge dietro il retto dove si attacca all'osso sacro. Ancora una volta, identificare l'uretere per assicurarsi che non sia stato incorporato o attorcigliato con il punto uterosacrale.
    12. Quindi, passare il punto di polidiaxanone sinistro attraverso l'aspetto sinistro della volta vaginale (Figura 5B), con cura di incorporare sia l'aspetto anteriore che quello posteriore del bracciale vaginale. Ripetere i passaggi per completare la procedura USLS sul lato destro. I punti multipli possono essere posizionati bilateralmente, se lo si desidera.
    13. Una volta che i punti uterosacrali sono posizionati bilateralmente, legare saldamente la sutura usando un nodo quadrato, come mostrato in Figura 5C, in modo tale che la volta vaginale sia elevata cefalo verso l'osso sacro; Questo completa la sospensione del legamento uterosacrale.
  4. Chiusura della ferita chirurgica
    1. Riposizionare il contenuto addominale nella loro posizione anatomica all'interno della cavità peritoneale. Chiudere gli strati profondi della parete addominale (peritoneo, fascia, muscolo) con un modello di sutura continua da 4-0 a 6-0 poliglactina 910 o sutura polidiaxanone.
    2. Chiudere la pelle con un punto sottocuticolare (o interrotto) da 4-0 a 6-0 polidiaxanone o poliglactin 910. Somministrare antibiotici per via sottocutanea secondo necessità per la profilassi chirurgica delle infezioni del sito.
    3. Eseguire il monitoraggio post-chirurgico fino a quando l'animale non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale. Non restituire l'animale all'alloggio sociale fino a quando non è completamente guarito.

Diagramma di confronto dell'anatomia animale; linea alba e orifizio uretrale marcati per l'orientamento spaziale.
Figura 2: Preparazione animale per la chirurgia dal vivo. La rimozione della pelliccia dall'area circostante il sito di incisione è necessaria per una corretta tecnica asettica. L'area mostrata nei pannelli (A) e (B) sono linee guida. I ricercatori dovrebbero rimuovere abbastanza peli in modo tale che gli strumenti sterili non entrino in contatto con i capelli durante l'intervento chirurgico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Anatomia chirurgica dell'apparato riproduttivo femminile; esplora l'ovidotto, l'ovaio, il corno uterino; Etichettato.
Figura 3: Conservazione delle ovaie. Le corna uterine non sono in genere visibili quando l'addome viene aperto per la prima volta, come mostrato in (A). Una volta che un corno è localizzato e seguito per trovare (B) l'ovaio e l'ovidotto dove si collegano al corno, la parte superiore del corno può essere bloccata e il corno separato per iniziare l'isterectomia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Procedura chirurgica su utero animale, clampaggio della cervice, dissezione sperimentale, studio veterinario.
Figura 4: Rimozione delle corna uterine. L'isterectomia nel ratto coinvolge (A) entrambe le corna uterine (B) bloccate alla giunzione uterocervicale e (C) asportate. La volta vaginale di ogni corno rimane con il moncone cervicale / uterino (freccia) (D) che li collega. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma di anatomia chirurgica che mostra la sospensione del legamento uterosacrale della volta vaginale e del retto.
Figura 5: Sospensione del legamento uterosacrale. (A) Orientamento dei legamenti uterosacrali in relazione alle strutture della volta vaginale create. Quando si posizionano le suture per la riparazione della sospensione del legamento uterosacrale (USLS), (B) le suture catturano il legamento uterosacrale e quindi passano attraverso entrambi gli aspetti anteriore e posteriore del bracciale vaginale. (C) Assicurata al legamento uterosacrale, la volta vaginale è ora elevata cefalo verso l'osso sacro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Prova di trazione uniassiale

NOTA: il sistema di test e il software utilizzati sono stati utilizzati seguendo le linee guida del produttore per la calibrazione e il test. Tutti i test sono stati effettuati a 22 °C.

  1. Preparazione dei campioni
    1. Eutanasia del ratto utilizzando una procedura farmacologica approvata dalla IACUC. Garantire la morte tramite un metodo fisico secondario. Qui è stata utilizzata l'inalazione di CO2 seguita da puntura cardiaca. Esporre la volta vaginale in preparazione per i test meccanici di trazione. Nel presente studio, eseguire test di trazione sui legamenti uterosacrali nativi (controllo), nonché su animali che avevano subito una sospensione del legamento uterosacrale come descritto sopra (POP).
    2. Legamenti di prova in situ 24 settimane dopo l'intervento chirurgico. Si suggerisce un timepoint terminale di almeno 8 settimane per consentire il completo riassorbimento delle suture.
      1. Dopo l'eutanasia umana, fai un'incisione lungo la linea alba per esporre l'addome.
      2. Inizia a sezionare il tessuto adiposo fino a quando la volta vaginale è visibile. Continuare a sezionare i cuscinetti di grasso addominale fino a quando gli USL intatti sono chiaramente visibili (animali di controllo, Figura 6A) o la giunzione tra il legamento uterosacrale e la volta vaginale è visibile (animali POP, Figura 6C). Prestare attenzione a non tirare la giunzione per rimuovere il tessuto adiposo, ma piuttosto utilizzare tagli accurati con micro-forbici per mantenere la coerenza tra i campioni.
      3. Utilizzando un righello flessibile, misurare la distanza tra l'inserzione uterosacrale (posteriore al retto) e la volta vaginale. Questo valore è la lunghezza originale del tessuto.
        NOTA: La lunghezza originale del tessuto, la lunghezza del calibro, per gli USL di controllo misurava 13,4 ± 0,5 mm mentre la lunghezza del calibro per la riparazione delle USL misurava 12,8 ± 0,4 mm.
      4. Infilare il nastro ombelicale dietro l'USL intatto (controllo, Figura 6B) o la giunzione USLS (POP, Figura 6D) in modo tale che il tessuto sia centrato sul nastro ombelicale. Misurare l'altezza e la larghezza del tessuto dove si interseca con il nastro ombelicale utilizzando calibri digitali. Questi valori verranno utilizzati per calcolare l'area della sezione trasversale.
      5. Fissare una piastra di compressione di grandi dimensioni (tabella dei materiali) tramite l'adattatore di base e posizionare l'animale in cima in modo che il campione sia centrato sotto il supporto dell'impugnatura.
  2. Prove di trazione
    1. Programmare il regime di prova di trazione nel software: pre-carico, pre-condizione, pull to failure. Ciò segue i precedenti protocolli di test meccanici del pavimento pelvico29 e del tessuto riproduttivo30 .
    2. Impostare lo strumento in preparazione delle prove di trazione. Per lo studio corrente, utilizzare una cella di carico da 10 N, un'impugnatura stampata in 3D e un adattatore di base per collegare una piastra di compressione come mostrato nella Figura 7.
      NOTA: Qualsiasi configurazione di base in grado di supportare l'intera dimensione dell'animale è accettabile. Utilizzare qualsiasi presa in grado di tenere saldamente il nastro ombelicale. In questo test è stato utilizzato un supporto personalizzato stampato in 3D e un'impugnatura da studi precedenti31,32. I file STL sono stati inclusi come file supplementari.
      1. Posizionare l'animale in modo tale che il campione sia centrato sotto l'impugnatura (Figura 8A). Immobilizzare la regione pelvica che circonda il campione fissando l'animale al piatto (Figura 8B).
      2. Abbassare la cella di carico in modo tale che le code del nastro ombelicale raggiungano facilmente la presa. Fissare il nastro ombelicale nell'impugnatura, lasciando il nastro allentato per evitare la manipolazione del campione.
    3. Aprire il test di precondizionamento nell'interfaccia del software ed etichettare il test con il nome del campione. Assicurarsi che il metodo di precondizionamento includa la fase di precarico.
    4. Fare clic per avviare il test di precondizionamento, che precaricherà il campione a 0,015 N. Una volta che la forza di precarico è stabile, la prova condizionerà il campione ad una velocità di allungamento di 0,1 mm/s per 30 s. Lasciare riposare il tessuto per 1 minuto. Durante l'attesa, caricare il regime di test pull-to-failure.
      NOTA: La forza di precarico può variare a seconda delle limitazioni dello strumento e delle condizioni di prova. Fare riferimento a studi precedenti in cui il precarico riportato varia da 0,015 N a 0,1 N 29,33,34,35,36.
    5. Aprire il regime di test programmato per eseguire il pull in caso di errore. Etichettare il test con il nome del campione e fare clic su OK per passare alla finestra successiva. Immettere la lunghezza del misuratore del campione e quindi fare clic su Avanti per passare alla pagina di test.
    6. Bilancia tutto e fai clic su Start. Lasciare che il test venga eseguito ad una velocità di allungamento di 0,1 mm/s fino a quando il tessuto non è stato tirato al cedimento. Il test produrrà dati di spostamento del carico.
  3. Calcolo di sollecitazioni, deformazioni e moduli per prove di trazione
    1. Utilizzando i dati di spostamento del carico, l'area della sezione trasversale e la lunghezza del manometro del campione, calcolare la sollecitazione (MPa) e la deformazione (%) come precedentemente riportato 37,38,39,40,41. Utilizzare l'equazione 1 e l'equazione 2 mostrate di seguito. Si noti che anche lo stiramento del nastro durante il test deve essere tenuto in considerazione in questi calcoli.
      Formula di calcolo della sollecitazione, Stress = Carico/Area, equazione per l'analisi della meccanica dei materiali.     Equazione 1
      Formula di calcolo della deformazione; diagramma; Misura la percentuale di spostamento e differenza di lunghezza originale.     Equazione 2
      1. Dalla curva carico-spostamento (Figura 9A,D), calcolare la rigidità (pendenza lineare, N/mm) e il carico finale. Dalla curva di deformazione delle sollecitazioni, calcolare il modulo tangente (pendenza lineare, MPa) e la sollecitazione finale. La regione lineare della curva di deformazione sotto sforzo è indicata nella Figura 9B,E con il modulo tangente calcolato da questa regione mostrato nella Figura 9C,F per entrambi i gruppi sperimentali.
        NOTA: sia per la rigidezza che per il modulo tangente, identificare la porzione lineare scegliendo una finestra di punti che massimizzi il valore di R2 per una regressione lineare37,41.

Tecnica chirurgica, sospensione del legamento uterosacrale, dissezione anatomica, procedura passo-passo.
Figura 6: Preparazione del campione per la prova di trazione uniassiale. (A) Gli USL di controllo esposti prima (B) il nastro ombelicale è infilato dietro il tessuto. (C) Giunzione della volta vaginale USL dopo la completa dissoluzione delle suture con (B) il nastro ombelicale infilato dietro il tessuto in preparazione della prova di trazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Configurazione per prove di trazione con cella di carico, piastra di compressione, supporto per campioni e attrezzatura grip plus.
Figura 7: Il sistema di prova meccanica. (A) Il sistema di prova in modalità prova di trazione utilizzato con (B) supporto stampato in 3D e (C) impugnatura del campione stampata in 3D completa di una striscia testurizzata per migliorare la presa. Configurazione dei pezzi mostrati nel pannello (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Impostazione del test di trazione muscolare su un campione di ratto; analisi biomeccaniche; meccanica dei tessuti.
Figura 8: Messa a punto della prova di trazione . (A) Il provino è centrato sotto l'impugnatura e il supporto. (B) L'animale e il tessuto che circondano il campione siano mantenuti fermi prima dell'inizio della prova di trazione. Come mostrato dall'immagine inserita, fissare il tessuto circostante è essenziale per isolare il tessuto di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Controllo e riparazione USLS: grafici carico vs. spostamento e stress vs. deformazione; risultati dell'analisi meccanica.
Figura 9: Esempio di output e analisi dei dati delle prove di trazione. (A) La curva carico-spostamento per un campione di controllo seguita da (B) l'analisi della deformazione delle sollecitazioni e (C) la pendenza dell'equazione di adattamento della curva di linea che mostra il modulo tangente in MPa. (D-F) mostra lo stesso processo per un campione USLS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

Fattibilità chirurgica e posizionamento della sutura uterosacrale
Non ci sono state complicanze intraoperatorie correlate all'isterectomia o alla sospensione del legamento uterosacrale in nessuno degli animali. C'era un sanguinamento minimo durante la rimozione delle corna uterine, a condizione che la vascolarizzazione adiacente fosse bloccata prima della rimozione. Il sanguinamento limitato ha permesso una buona visualizzazione dei legamenti uterosacrali per il posizionamento della sutura e ha impedito lesioni intraoperatorie intestinali, del retto, ureterali o della vescica. Dopo il posizionamento delle suture, la nuova giunzione USL-volta vaginale ha impedito il movimento del moncone cervicale/uterino come mostrato in Figura 5C. Durante i primi tre giorni postoperatori, gli animali sono stati controllati quotidianamente e poi bisettimanalmente fino alla fine dell'esperimento. Con gli analgesici oppioidi e FANS a rilascio prolungato somministrati al momento dell'intervento chirurgico, ulteriori analgesici sono risultati non necessari. Sulla base della nostra esperienza con 16 interventi chirurgici sugli animali (n = 8 sia per i gruppi di controllo che per quelli USLS), ci si dovrebbe aspettare un calo di peso nella prima settimana dopo l'intervento chirurgico con una perdita media del 5,7 ± dell'1,4% dal peso del giorno dell'intervento. Come previsto, i ratti hanno lentamente guadagnato peso nelle successive 23 settimane, con un aumento di peso medio del 15,1 ± del 4,5% nel corso dell'esperimento.

Collaudo meccanico della riparazione USLS
Per dimostrare la funzionalità della riparazione USLS, è stato eseguito un test di trazione uniassiale. Dopo l'eutanasia dell'animale nel momento post-operatorio scelto, 24 settimane in questo studio, l'area chirurgica deve essere attentamente sezionata per visualizzare la giunzione USL-volta vaginale come mostrato in Figura 6A. Rispetto ad altre metodologie per testare le USL del ratto insieme ad altre strutture di supporto e organi pelvici29,42, il metodo qui descritto è il primo a testare l'USL del ratto in modo isolato. Il nastro ombelicale utilizzato in questo studio è stato scelto strategicamente per la sua flessibilità in quanto la conformità del nastro ha consentito una minima interruzione del tessuto durante la preparazione dei test di trazione. I dati di spostamento del carico, quindi, devono essere regolati per tenere conto della piccola quantità di allungamento apportato dal nastro ombelicale. La Figura 9 fornisce un esempio di dati ottenuti tramite prove di trazione e la Figura 9A fornisce un esempio di un tipico grafico sforzo-deformazione. Si raccomanda la segnalazione dei dati di tensione-deformazione in quanto queste informazioni sono normalizzate e indipendenti dalle dimensioni dei campioni34 e possono essere meglio confrontate tra gli studi. Per il legamento uterosacrale intatto, riportiamo proprietà strutturali come carico finale (2,9 ± 0,5 N) e rigidità (0,4 ± 0,1 N/mm), nonché proprietà normalizzate del materiale come sollecitazione finale (2,1 ± 0,4 MPa), deformazione finale (1,6 ± 0,5) e modulo tangente (4,0 ± 1,1 MPa). Nei test uniassiali eseguiti sugli organi riproduttivi del ratto e su tutte le loro connessioni tissutali di supporto da Moalli et al., hanno riportato un carico finale al fallimento (13,2 ± 1,1 N) e rigidità (2,9 ± 0,9 N / mm) superiore all'USL29 isolato. Il lavoro svolto da Moalli et al. e da altra letteratura34,35 menziona l'elevata variabilità tra i campioni testati, come mostrato nei dati qui presentati. Per la riparazione della sospensione del legamento uterosacrale, abbiamo trovato tutte le proprietà strutturali del materiale (rigidità, 0,33 ± 0,13 N/mm; carico finale, 2,6 ± 1,3 N) e le proprietà normalizzate del materiale (sollecitazione finale, 1,8 ± 0,7 MPa; sforzo finale 1,3 ± 0,3; modulo tangente, 3,0 ± 0,9 MPa) inferiori a quelle dell'USL nativo.

Discussione

Il protocollo è notevole per diversi vantaggi. Per quanto ne sappiamo, è la prima descrizione pubblicata di USLS nel modello di ratto e fornirà ai futuri ricercatori passaggi riproducibili per eseguire questa procedura nel contesto della ricerca. In secondo luogo, includiamo un nuovo protocollo per i test di trazione dell'interfaccia nativa e chirurgica dell'USL. Il protocollo di test di trazione potrebbe essere utilizzato in studi simili che studiano nuovi approcci di ingegneria tissutale per aumentare le riparazioni dei tessuti nativi come USLS. Inoltre, il modello di ratto stesso è utile per lo studio dei disturbi del pavimento pelvico a causa della facilità di movimentazione / imbarco, della breve durata della vita e dell'efficienza dei costi rispetto ai modelli animali più grandi. I limiti del protocollo includono l'incapacità di valutare una delle principali complicanze dell'USLS, il kinking ureterale. Nonostante questo, non abbiamo avuto casi di presunta lesione ureterale in questo studio. Un'altra considerazione è che l'orientamento orizzontale del bacino, il piccolo rapporto testa-canale fetale e la mancanza di prolasso spontaneo nel modello di ratto limitano una certa applicabilità dei risultati agli esseri umani. Tuttavia, l'uso di ratti multipare è un punto di forza di questo studio poiché rappresenta il principale fattore di rischio nello sviluppo di POP3.

L'istituzione di un protocollo di successo per l'isterectomia e l'USLS nel ratto Lewis sarà uno strumento utile per i futuri ricercatori che studiano i componenti chirurgici del POP, riducendo al minimo la variabilità nel testare il comportamento meccanico dell'USL. I modelli animali chirurgici sono utili in quanto consentono ai ricercatori di progettare esperimenti clinicamente rilevanti che controllano la parità, la massa corporea, la malattia e la nutrizione34, mitigando al contempo il rischio etico dello studio iniziale negli esseri umani. Inoltre, i modelli standardizzati per POP consentono ai ricercatori di aggirare i limiti della raccolta di tessuti umani. In particolare, i metodi di prova di trazione descritti in questo protocollo consentiranno la coerenza tra gli studi. I precedenti modelli di roditori hanno testato le proprietà meccaniche dell'intera regione pelvica, che comprende la cervice, la vagina e i legamenti di supporto pelvico multipli29,42. I metodi qui descritti consentono la misurazione dell'USL in modo da mantenere gli attaccamenti spinali e cervicali nativi. Va notato che i metodi di prova di trazione non valutano solo l'USL, ma piuttosto l'USL in combinazione con la sua inserzione nel sacro e nella cervice. Questo è un punto di forza dello studio in quanto riflette le solite forze in situ a cui è sottoposto il legamento. Riconosciamo che il comportamento meccanico del legamento isolato sarebbe diverso se fosse testato ex vivo senza i suoi attacchi nativi. Ciò è particolarmente vero in quanto le strutture dei ratti sono piccole e limitano la fattibilità della raccolta di un campione adatto per i test ex vivo. Le USL sperimentano il caricamento in più direzioni in situ, quindi la natura uniassiale del test è una limitazione, ma l'uso di questo metodo consente confronti significativi tra studi precedenti sulla meccanica USL del ratto29,42. Sebbene attualmente non esista un protocollo di test meccanico standard ampiamente accettato, questo modello sarà uno strumento utile per futuri studi di ingegneria tissutale sul campo.

Diversi passaggi descritti in questo protocollo sono fondamentali per la salute e il benessere degli animali, nonché per la riproducibilità della chirurgia USLS e dei successivi test di trazione. In primo luogo, è essenziale ottenere sia i farmaci analgesici che quelli antinfiammatori descritti come analgesici da soli sono risultati inadeguati per la gestione del dolore. L'antibiotico profilattico riduce il rischio di infezione del sito chirurgico ed è lo standard di cura nella chirurgia umana. Per quanto riguarda la procedura chirurgica USLS, evitare danni alle ovaie e ridurre al minimo la perdita di sangue sono essenziali per un intervento chirurgico di successo. I passaggi 1.3.3 e 1.3.4 descrivono la separazione della parte superiore del corno uterino dall'ovaio adiacente; Bisogna fare attenzione a mantenere questa dissezione sul lato del corno uterino per prevenire la rottura dei vasi delicati intorno all'ovaio, che può causare un eccessivo sanguinamento. Da notare, altri ricercatori hanno dimostrato che la funzione ovarica è preservata dopo la rimozione delle corna uterine43. Inoltre, se le ovaie vengono interrotte o rimosse, l'architettura complessiva della fibrilla di collagene sarà disturbata, alterando le proprietà meccaniche dei suoi tessuti44,45. Una volta che il corno uterino è separato in modo sicuro dall'ovaio, c'è un chiaro piano di dissezione che consente l'isolamento del corno uterino dai cuscinetti adiposi circostanti e dal sistema vascolare. Nonostante il chiaro piano di dissezione, i peduncoli lungo il corno uterino devono essere fissati con un morsetto prima della transezione con micro forbici. Contrariamente alla pratica chirurgica nell'uomo, abbiamo scoperto che la legatura della sutura dei peduncoli dell'isterectomia non è necessaria, poiché il bloccaggio del peduncolo prima della transezione garantisce un'emostasi adeguata. Il passo 1.3.6 del protocollo descrive questo attento processo per ridurre al minimo la perdita di sangue. Durante l'esecuzione dell'isterectomia, è necessario prestare molta attenzione per identificare gli ureteri come menzionato nei passaggi 1.3.6 e 1.3.8. Comprendere la vicinanza anatomica dell'uretere è fondamentale, poiché una delle complicanze più comuni associate alle USL nell'uomo è la lesione ureterale46.

In conclusione, presentiamo un nuovo protocollo per l'esecuzione di isterectomia, sospensione del legamento uterosacrale e test di trazione dell'USL in un modello di ratto. Prevediamo che i nostri risultati aiuteranno i futuri ricercatori scientifici di base fornendo una descrizione chiara e riproducibile di queste procedure e quindi consentiranno il progresso della ricerca sul prolasso degli organi pelvici.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la Prof.ssa Silvia Blemker per l'uso del suo Instron e il Prof. George Christ per l'uso del suo spazio chirurgico, nonché il supporto e l'impugnatura stampati in 3D. Questo lavoro è stato supportato dalla UVA-Coulter Translational Research Partnership e dal DoD (W81XWH-19-1-0157).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tampone per la preparazione dell'alcolBD326895
Unguento lacrimale artificialeAmerican Health Service Sales CorpPH-PARALUBE-O
Bluehill softwareInstronBluehill 3
Cavicida 1 disinfettanteFisher Scientific22 998 800
Piastra di compressioneInstron2501-163
Cotone tamponiPuritan Medical806-WC
Spugna di garza,8 strati VWR95038-728
Pinze per zanzareMedline IndustriesMMDS1222115
Porta aghiMedline IndustriesDYND04045
Forbici operative, 5½ ", SharpAmerican Health Service Sales Corp4-222
Analgesico oppioide (Buprenorfina XR)Fidelis Animal HealthEthiqa XR0.65  mg/kg  SC  Q72
FANS Analgesico (Meloxicam SR)Wildlife Pharmaceuticals, LLCMeloxicam SR1  mg/kg  SC  q72
PDS II, 3-0 Sutura in polidiossanone, SH-1EthiconZ316H
PDS II, 5-0 P sutura olidiossanone, divaricatore RB-1EthiconZ303H
Medline IndustriesMDS1862107
Lama per bisturi Stainless Surgical #10Miltex4-310
Manico per bisturiMedline IndustriesMDS15210
Forbice, micro, curvo, 4,5"WestcottMDS0910311
sistema di prova universale a colonna singolaInstron5943 S38731 kN capacità di forza, cella di carico 10 N
Guanti sterili in lattice di gomma naturaleAccutech91225075
sutura, Vicryl, 6-0, P-3EthiconJ492G
nastro, ombelicale, cotone, 1/8X18"EthiconU10T
Cella di carico a trazione e compressioneInstron2530-10NCella di carico 10N (1 kgf, 2 lbf)
Adesivo chirurgico veterinario (colla per pelle)Covetrus31477

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