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Articolo metodologico

Protesi alla testa per il neuroimaging di ratti svegli e fissati con la testa

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DOI:

10.3791/64324

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7 settembre 2022

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of California, Irvine, 33Center for Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine

In questo articolo

Sommario

Viene descritta una nuova procedura dettagliata per l'imaging funzionale di ratti svegli e fissati con la testa.

Abstract

Gli anestetici, comunemente usati nella ricerca scientifica preclinica e fondamentale, hanno un'influenza depressiva sulle funzioni metaboliche, neuronali e vascolari del cervello e possono influenzare negativamente i risultati neurofisiologici. L'uso di animali svegli per studi di ricerca è vantaggioso, ma pone la sfida principale di mantenere gli animali calmi e fermi per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante l'acquisizione dei dati. L'imaging sveglio nei roditori di piccole dimensioni (ad esempio, topi) è molto comune, ma rimane scarso nei ratti poiché i ratti sono più grandi, più forti e hanno una maggiore tendenza a opporsi alle restrizioni di movimento e alla fissazione della testa per le lunghe durate richieste per l'imaging. Viene descritto un nuovo modello di neuroimaging di ratti svegli e fissati con la testa utilizzando imbracature personalizzate cucite a mano, protesi per la testa stampate in 3D, tappi per la testa e un telaio. I risultati ottenuti a seguito di una singola prova di stimolazione a baffo singolo suggeriscono un aumento dell'intensità della risposta funzionale evocata. L'acquisizione della risposta funzionale evocata da ratti svegli e fissi con la testa è più veloce di quella dei ratti anestetizzati, affidabile, riproducibile e può essere utilizzata per studi longitudinali ripetuti.

Introduzione

La maggior parte delle indagini scientifiche di neuroimaging di base, precliniche e traslazionali sono acquisite da animali anestetizzati 1,2. Gli anestetici facilitano la sperimentazione ma influenzano continuamente il metabolismo del cervello e del corpo, la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca3. Il tipo di anestetico e la durata e la via di somministrazione aggiungono variabili confondenti all'interpretazione dei dati che potrebbero contribuire alla riproducibilità e ai fallimenti traslazionali4. Uno dei principali colli di bottiglia degli studi di neuroimaging del ratto sveglio e fissato con la testa è la necessità di mantenere il ratto fermo e calmo durante i processi di preparazione e acquisizione dei dati. Piccoli movimenti producono artefatti di movimento ingiustificati, che possono influire negativamente sull'analisi e sulle interpretazioni dei dati.

È stato ideato un nuovo modello di neuroimaging da ratti svegli e fissi con la testa utilizzando imbracature personalizzate, protesi per la testa tridimensionali stampate in 3D, tappi per la testa e un telaio per la testa che offre diversi vantaggi per una facile sperimentazione. L'impianto cranico 3D è leggero e copre una piccola porzione del cranio necessaria per il transfixing. Gli impianti cranici e i cappucci stampati in 3D sono progettati utilizzando software CAD (computer-aided design). I protocolli di stimolazione dei baffi, acquisizione dei dati, analisi dei dati e risultati di ratti anestetizzati sono stati descritti in dettaglio nel precedente lavoro 5,6,7.

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Protocollo

Tutte le procedure erano conformi alle linee guida del National Institute of Health e approvate dall'Università della California, Irvine Animal Care and Use Committee. In questo studio sono stati utilizzati sette maschi e una femmina di ratto (Sprague-Dawley, peso: 185-350 g). Dopo il completamento dello studio, i ratti sono stati sacrificati usando overdose di anidride carbonica.

1. Progettazione di diversi componenti

  1. Progettazione dell'impianto cranico:
    1. Realizzare l'impianto della testa utilizzando un software CAD (Figura 1C) e progettarlo per visualizzare l'area posteriore al bregma e adiacente alla linea mediana centrata sulla corteccia somatosensoriale. Assicurarsi che l'impianto cranico copra un'area compresa tra 0,9 mm e 1,9 mm sul cranio lontano dall'area di imaging.
    2. Utilizzare solo tre viti per ancorare l'impianto della testa sul cranio del ratto. Progettare tutti i fori delle viti in modo che rimangano sul lato opposto della linea mediana nell'emisfero controlaterale dell'emisfero ripreso.
    3. Posizionare una barra, scavata dall'interno, nella parte superiore dell'impianto della testa per consentire ai fili di fissare il cappuccio della testa all'impianto della testa come mostrato nella Figura 1D.
  2. Design del cappuccio:
    1. Assicurarsi che il cappuccio copra completamente l'area di imaging e la protegga da qualsiasi tipo di trauma, come mostrato nella Figura 1A, B. Aggiungi una curvatura alla calotta della testa in modo che si allinei alla forma della testa senza causare difficoltà alle attività quotidiane dell'animale nelle gabbie arricchite standard.
    2. Tagliare il lato interno del cappuccio in una forma rettangolare più ampia in modo che la parte superiore dell'impianto cranico possa adattarsi ad esso, come mostrato nella Figura 1E. Perpendicolare a questo rettangolo, tagliare altre due regioni rettangolari per ancorare il cappuccio alla protesi della testa.
    3. Far passare un filo attraverso la barra scavata superiore dell'impianto della testa per il fissaggio del cappuccio sulla testa del ratto, come mostrato nella Figura 1E-G. Passa il secondo filo allo stesso modo.
      NOTA: Questi fili possono essere facilmente rimossi utilizzando pinze o pinze. I file di stampa 3D vengono forniti (formato file: STL) come file supplementare 1 e file supplementare 2.
  3. Design del telaio della testa:
    1. Progettare il telaio della testa in modo che una parte tagliata possa muoversi attraverso la barra superiore dell'impianto della testa e venga fissata utilizzando un morsetto.
    2. Inclinare l'altra parte tagliata per fornire una resistenza extra per mantenere la testa del ratto fissata per rendere il lato controlaterale completamente accessibile per l'imaging. Ai fini di questo studio, tagliare la piastra di acciaio con ceole di stagno per produrre il telaio della testa (Figura 1H, I).
      NOTA: anche questa parte può essere stampata in 3D.

2. Addestramento iniziale dei ratti

  1. Consentire ai ratti di acclimatarsi all'ambiente del vivaio nelle loro gabbie per 2-3 giorni.
  2. Inizia a maneggiare il topo in una stanza tranquilla. Apri la gabbia e chiedi allo sperimentatore di mettere la mano all'interno della gabbia vicino al topo per 15-20 minuti per consentire al topo di abituarsi.
  3. Una volta che il topo mostra calma non spaventandosi o scappando dalle mani dello sperimentatore, raccogli delicatamente il topo per la manipolazione. Maneggiare il topo per 30-45 minuti ogni giorno prima dell'allenamento dell'imbracatura.

3. Allenamento con imbracatura

  1. Allenare i ratti per almeno 2-3 giorni nelle imbracature prima dell'impianto chirurgico dell'impianto cranico e del cappuccio.
  2. Disporre la configurazione dell'imbracatura come mostrato nella Figura 2A. Pulire la configurazione dell'imbracatura utilizzando salviette a etanolo.
    NOTA: Tutte le imbracature sono cucite a mano e realizzate con un materiale di rete sul fondo o su entrambi i lati, come mostrato nella figura 2A, B.
  3. Per l'addestramento dell'imbracatura, anestetizzare i ratti usando il 4% di isoflurano per l'induzione e l'1% per il mantenimento fino a quando non c'è il riflesso del pizzicamento della zampa posteriore.
  4. In anestesia con isoflurano, posizionare i ratti su un foglio di plastica flessibile di 20 cm x 8 cm (lunghezza x larghezza), dove 10 cm x 8 cm del foglio di plastica sono completamente coperti con la parte più morbida del Velcro.
    NOTA: Anestetizzare i ratti per l'allenamento con l'imbracatura è un passaggio facoltativo, utilizzato principalmente per ridurre lo stress e l'ansia.
  5. Per i primi 2 giorni dell'allenamento, metti il topo comodamente in un calzino per bambini (taglia 0-3 mesi) con la testa fuori attraverso un piccolo foro inciso all'estremità del calzino.
  6. Avvolgere un piccolo pezzo di tampone assorbente intorno alla parte inferiore del corpo per mantenere il ratto asciutto e raccogliere gli escrementi.
  7. Avvolgere il topo in un panno di cotone traspirante (dimensioni: 25 cm x 25 cm). Metti il topo su un foglio di plastica che ha Velcro strisce incollate ad esso.
  8. Fissare ulteriormente il ratto al foglio di plastica usando strisce Velcro larghe 0,5 cm ad una distanza di 3-6 mm l'una dall'altra.
  9. Fissare il topo nella fionda. Rimuovere l'anestesia gassosa. Consentire al ratto di riprendersi dall'anestesia gassosa nell'imbracatura.
  10. Quando il topo inizia a frullare, offri alcune gocce di soluzione di saccarosio al 10% come ricompensa ogni 10-15 minuti.
  11. Presentare casualmente al ratto gli stimoli sensoriali che verranno utilizzati durante l'imaging (qui la stimolazione dei baffi, ogni 15-25 minuti) per abituarlo agli stimoli sensoriali. Stimolare manualmente i baffi a intervalli casuali.
  12. Allena il topo nell'imbracatura per 1 ora il giorno 1, 2 ore il giorno 2 e 3 ore il giorno 3 come mostrato nella Figura 2C.

4. Preparazione prechirurgica

  1. Stampare l'impianto cranico e il cappuccio della testa utilizzando la stampante 3D (Figura 1).
  2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e i copricapi (impianti e cappucci) immergendo l'apparecchiatura nel germicida Metricide28 per 10 ore. Risciacquare accuratamente gli strumenti con acqua sterile poco prima dell'intervento.
  3. Esporre il ratto al 4% di isoflurano e quindi mantenere all'1% -2% di isoflurano fino a quando non c'è il riflesso del pizzicamento della zampa posteriore. Questo intervento chirurgico può essere eseguito sotto molti tipi di anestesia, come isoflurano, pentobarbital di sodio, e ketamina-xilazina.
  4. Iniettare atropina (0,05 mg/kg) per via intramuscolare per ridurre le secrezioni mucose per aiutare nella respirazione.
  5. Rasare la testa del ratto di 5 mm centrata attorno alla linea mediana usando un tagliacapelli partendo da tra gli occhi fino alla parte posteriore delle orecchie.
  6. Monitorare la saturazione parziale di ossigeno e la frequenza cardiaca attraverso un pulsossimetro e una sonda cardiofrequenzimetro fissata alla zampa posteriore del ratto.
  7. Pulire la testa del topo e l'area circostante tre volte con cicli alternati di betadine e salviette imbevute di alcool al 70%.
  8. Fissare il topo in un sistema stereotassico.
  9. Inserire una sonda rettale lubrificata con vaselina per misurare la temperatura corporea del ratto e mantenerla attraverso il sistema di feedback della coperta riscaldante per evitare l'ipotermia dopo la somministrazione di anestetico.
  10. Somministrare anestetico locale lidocaina cloridrato ad una concentrazione di 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 peso corporeo per via sottocutanea nel sito chirurgico.
  11. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione.
  12. Somministrare il 2% di anestetico locale per via sottocutanea sul sito chirurgico.
  13. Iniettare 3 ml di soluzione di suoneria lattata a temperatura ambiente per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e fornire nutrimento durante l'intervento chirurgico.

5. Chirurgia

  1. Rimuovere la parte della pelle sopra il sito chirurgico (diametro di 4 mm centrato attorno alla linea mediana e al centro della testa) utilizzando forbici chirurgiche affilate. Sezionare e rimuovere parte della pelle (~ 2 mm di diametro, sopra la corteccia somatosensoriale sinistra) tra l'orecchio e l'occhio sulla parte temporale della testa.
  2. Rimuovere, utilizzando un bisturi, il tessuto cutaneo sottostante (pericranio) per esporre il cranio. Pulire il cranio con una garza di cotone sterilizzata.
  3. Ritrarre / resecare il muscolo temporale per esporre la dimensione desiderata per l'area di imaging [7,5 mm per 7,5 mm per questo studio].
  4. Esporre il cranio sull'emisfero controlaterale per l'impianto della testa. Posizionare l'impianto della testa sul cranio per accertare la posizione delle viti di ancoraggio per l'impianto, come mostrato in Figura 2D-F.
  5. Contrassegnare il teschio per forare le viti usando l'inchiostro indiano con la punta 1. Praticare i fori di bava per le viti utilizzando la punta del trapano dentale 3. Avvitare l'impianto della testa in posizione.
  6. Asciugare il cranio usando una garza sterile. Applicare un sottile strato di adesivo tissutale intorno e sotto l'impianto della testa per incollarlo al cranio. Applicare uno strato di cemento dentale per sostenere ulteriormente l'impianto della testa in posizione e lasciare asciugare il cemento per 2-3 minuti.
    NOTA: L'uso di adesivo per tessuti in aggiunta al cemento dentale garantisce una forte tenuta8.
  7. Utilizzando la punta 3 del trapano dentale, assottigliare un'area di 7,5 mm x 7,5 mm sul lato sinistro del cranio appena posteriore al bregma e laterale alla linea mediana. Assottigliare il cranio a ~50 μm come mostrato nella Figura 3A.
  8. Applicare un unguento antibiotico topico sul sito chirurgico e quindi coprirlo con un sottile strato di gomma siliconica per proteggere il cranio assottigliato, come mostrato nella Figura 3B. Coprire il sito chirurgico utilizzando il cappuccio della testa come mostrato nella Figura 3C. Fissarlo in posizione con i due piccoli pezzi di fili che attraversano sia l'impianto cranico che il cappuccio della testa come mostrato in Figura 3D, E. Applicare gomma siliconica per coprire la calotta della testa e il cranio per stabilizzare ulteriormente la cuffia sulla testa del ratto, come mostrato nella Figura 3F.
    NOTA: La gomma siliconica fornisce una protezione aggiuntiva al cranio assottigliato.
  9. Iniettare nel ratto flunixin meglumina (2,5 mg/kg) per via sottocutanea per la gestione del dolore e dell'infiammazione. Per prevenire l'infezione, iniettare enrofloxacina antibiotica Enrosite (22,7 mg/ml, 10 mg/kg +/-0,01), per via intraperitoneale.
  10. Spostare il topo nella camera di recupero per aiutare a mantenere la temperatura corporea con una coperta riscaldante e una lampada di calore. Monitorare continuamente il ratto fino a quando non riprende conoscenza e può mantenere la recumenza sternale.
  11. Riportare il topo nella sua gabbia separata una volta che si è completamente ripreso.
  12. Per i prossimi 3 giorni, somministrare flunixina e buprenorfina per alleviare l'infiammazione e il dolore e arruolarsi per prevenire l'infezione due volte al giorno.

6. Imaging sveglio

  1. Anestetizzare il ratto con il 4% di isoflurano per l'induzione e l'1% per il mantenimento quando non c'è riflesso del pizzicamento della zampa posteriore. Iniettare acepromazina (0,3-0,5 mg/kg) per via sottocutanea.
    NOTA: Questa concentrazione di acepromazina è inferiore a livelli di sedazione lievi e aiuta solo a mantenere calmi i ratti durante il processo di imaging.
  2. Utilizzando strisce di Velcro personalizzate, fissare il ratto sul foglio di plastica utilizzato durante le procedure di allenamento. Avvolgere la parte inferiore del corpo usando un tampone di assorbimento e posizionare il ratto comodamente nell'imbracatura.
  3. Rimuovere la gomma siliconica. Rimuovere il cappuccio della testa rimuovendo i fili di fissaggio. Fissare il telaio della testa nell'impianto della testa come mostrato nella Figura 2G.
  4. Bloccare il telaio della testa in morsetti come mostrato nella Figura 2H, I.
  5. Rimuovere l'anestesia gassosa. Lavare l'area di imaging con soluzione salina 3x e pulire con una garza bagnata. Asciugare l'area di imaging e creare un pozzo, usando vaselina, attorno all'area di imaging. Riempire il pozzetto con soluzione salina sterilizzata e coprire con un vetrino (Figura 2E).
  6. Fare riferimento alle procedure di acquisizione per l'imaging ottico del segnale intrinseco, il protocollo di stimolazione dei baffi e l'analisi e la presentazione dei dati, che sono state discusse in dettaglio in precedenza 6,7.
  7. Durante l'esperimento, monitorare i ratti per segni di agitazione e irrequietezza, che possono essere ulteriormente ridotti coprendo gli occhi dei ratti con un panno morbido o una garza (opzionale).

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Risultati

Vengono mostrati i segnali rappresentativi di imaging ottico di un singolo studio di un ratto anestetizzato e la risposta sommata (di 40 studi raccolti) di un ratto sveglio (Figura 4). L'intensità del segnale per la stimolazione a baffo singolo di un ratto sveglio può essere visualizzata a una soglia più alta rispetto al ratto anestetizzato, mostrando un segnale più forte dall'animale sveglio. I baffi C2 dei ratti vengono stimolati a 5 Hz per 1 s e la risposta funzionale viene visualizzata c...

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Discussione

L'uso dell'imaging del ratto sveglio e fissato con la testa offre molti vantaggi in termini di facilità e personalizzazione. Le imbracature progettate su misura consentono ai ratti di essere avvolti attraverso materiale di rete traspirante, eliminando la necessità di racchiudere gli animali in camere di contenimento di plastica chiuse per lunghi periodi di tempo10,11. I ratti sono mantenuti calmi e senza stress per tutta la lunga durata delle successive sessioni ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha e Amirsoheil Zareh per il loro aiuto durante l'addestramento dei ratti e la preparazione delle imbracature. Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (NIH, numero di sovvenzione: NS119852) e dalla Fondazione Leducq (numero di sovvenzione: 15CVD02).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RattiCharles RiverSprague Dawley
IsofluranoPivetal21295098Anestetico generale
Lidocaina HCl 2% iniezionePhoenixL-2000-04Anestetico locale
Atropina solfato iniezioneVedco5098907512Aiuto nella respirazione
Soluzione per iniezione di Ringer lattatoVedco
Iniezione di flunixinaVedco6064408670Gestione del dolore
Iniezione di enrosite (Enrofloxacina 2,27%)VetOne501084Evitare l'infezione
Iniezione di PromAce (Acepromazina maleato)Beohringer Ingelheim136059
Animax unguentoDechra Prodotti veterinari122-75Principi attivi di nistatina 1000 unità per grammo, neomicina solfato 2,5 mg per grammo, tiostrepton 2500 unità per grammo e triamcinolone acetonide 1 mg per grammo
Unguento oftalmico PuralubeDechra Veterinary Products211-38
Tamponi di preparazione PVP povidone-iodioMedlineMDS093917Betadine generico
Tamponi di alcol isopropilicoBD326895
tessuto Vetbond adesivo3M1469SB
Fresa (punta da trapano), standard in metallo duro operatorioSS Bianco Frese14829#3
00-90 x 1/8 testa piatta in acciaio inoxJ.I. MorrisF0090CE125Viti di ancoraggio
Sistema stereotassicoKopf Instruments1430
Coperta riscaldante omeotermicaHarvard Apparatus50-7220-F
Pulsossimetro e cardiofrequenzimetroKent ScientificMouseStat Jr.
PetrolatumFisher ScientificP66-1LBVaselina generico
Filo, rame nudoFisher Scientific15-545-2C20 gauge
Teets Cold Cure polverePearson DentalC73-0054 principio attivo: Metacrilato di metile
Teets Liquido per polimerizzazione a freddoPearson DentalC73-0078 principio attivo: Metacrilato di metile
Stampo in silicone in gommaSmooth-OnBody DoubleFast silicone polymer
Metricide 28 (Germicida)MetrexOct-05
Inchiostro di India, neroPelikan301051
Trapano dentaleNSK Dental UltimateXL-F
Stampante 3DPrusa Researchi3 MK3S+
Cucire su elementi di fissaggioVelcro90030
Tessuto multiuso per la protezione degli animali domesticiJoann10173334Materiale di rete
Bur (punta da trapano), frese standard in metallo duroSS White Burs14829#1
50989088317 Viti fresa,

Riferimenti

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