Questo articolo descrive due metodi rapidi ed efficienti per la raccolta dello sperma dal piccolo modello di pesce medaka (Oryzias latipes), nonché un protocollo per valutare in modo affidabile la qualità dello sperma utilizzando l'analisi dello sperma assistita da computer (CASA).
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Articolo metodologico
Raccolta spermatica e analisi dello sperma assistita da computer nel modello Teleoste Medaka giapponese (Oryzias latipes)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il medaka giapponese (Oryzias latipes) è un pesce teleosteo e un modello di vertebrato emergente per la ricerca ecotossicologica, dello sviluppo, genetica e fisiologia. Medaka è anche ampiamente utilizzato per studiare la riproduzione dei vertebrati, che è una funzione biologica essenziale in quanto consente a una specie di perpetuarsi. La qualità dello sperma è un indicatore importante della fertilità maschile e, quindi, del successo riproduttivo. Le tecniche per l'estrazione dello sperma e l'analisi degli spermatozoi sono ben documentate per molte specie, compresi i pesci teleostei. La raccolta dello sperma è relativamente semplice nei pesci più grandi, ma può essere più complicata nei piccoli pesci modello in quanto producono meno spermatozoi e sono più delicati. Questo articolo, quindi, descrive due metodi di raccolta dello sperma nel piccolo pesce modello, medaka giapponese: dissezione dei testicoli e massaggio addominale. Questo documento dimostra che entrambi gli approcci sono fattibili per medaka e mostra che il massaggio addominale può essere eseguito un numero ripetuto di volte mentre il pesce si riprende rapidamente dalla procedura. Questo articolo descrive anche un protocollo per l'analisi dello sperma assistita da computer in medaka per valutare oggettivamente diversi importanti indicatori della qualità dello sperma di medaka (motilità, progressività, durata della motilità, concentrazione relativa). Queste procedure, specificate per questo utile modello di piccolo teleosteo, miglioreranno notevolmente la comprensione dei fattori ambientali, fisiologici e genetici che influenzano la fertilità nei maschi vertebrati.
Introduzione
Il medaka giapponese è un piccolo pesce teleosteo d'acqua dolce originario dell'Asia orientale. Medaka è diventato un eccellente sistema modello di vertebrati per l'ecotossicologia, la genetica dello sviluppo, la genomica e gli studi di biologia evolutiva e fisiologia 1,2. Simili al popolare zebrafish, sono relativamente facili da allevare e altamente resistenti a molte malattie comuni dei pesci 1,2. Ci sono diversi vantaggi nell'utilizzare medaka come modello, tra cui un breve tempo di generazione, embrioni trasparenti 1,2....
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Protocollo
Tutte le sperimentazioni e la gestione degli animali sono state condotte in conformità con le raccomandazioni sul benessere animale sperimentale presso l'Università norvegese di scienze della vita (NMBU). Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando maschi adulti (6-9 mesi) di medaka giapponese (ceppo Hd-rR) allevati presso NMBU (Ås, Norvegia). I metodi sono stati anche brevemente testati in medaka giapponese maschio di 9 mesi (ceppo CAB) allevato presso l'Istituto nazionale di ricerca per l'agricoltura, l'alimentazione e l'ambiente (INRAE, Rennes, Francia).
1. Preparazione dello strumento e della soluzione
- Pre....
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Risultati
Tipo di dati ottenuti
L'analisi della motilità degli spermatozoi del software SCA Evolution fornisce dati sulla motilità (percentuale di spermatozoi mobili e immobili), nonché sulla progressività (percentuale di spermatozoi progressivi e non progressivi) e sulla velocità (percentuale di spermatozoi rapidi, medi e lenti). Combina anche progressività e velocità (progressivo rapido, medio progressivo, non progressivo). Queste etichette si basano su misurazioni (figura 3A) e calcoli (.......
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Discussione
L'osmolalità è un fattore importante nell'attivazione dello sperma di pesce36,37. Generalmente, gli spermatozoi sono immobili nei testicoli e diventano mobili nei mezzi iperosmotici rispetto al liquido seminale per i pesci marini e ipo-osmotici rispetto al liquido seminale per i pesci d'acqua dolce37. Simile al sangue, il plasma seminale nei pesci d'acqua dolce è tipicamente inferiore a quello dei pesci marini (circa 300 mOsmol/kg rispetto.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Norwegian University of Life Sciences e dal programma Fulbright degli Stati Uniti. Gli autori desiderano ringraziare Anthony Peltier e Lourdes Carreon G Tan della NMBU per la manutenzione delle strutture ittiche e Guillaume Gourmelin dell'ISC LPGP dell'INRAE (Francia) per aver fornito ai pesci e allo spazio di laboratorio per testare ulteriormente questi metodi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | È possibile utilizzare qualsiasi marca standard |
| 10 & micro; L micropipetta in vetro calibrata monouso e tubo aspiratore | Drummond | 2-000-010 | |
| Obiettivo 10x con contrasto di fase | Nikon | MRP90100 | |
| provette da 2 mL | Axygen | MCT-200-c-s | È possibile utilizzare qualsiasi marca standard |
| Pinze smussate | Strumenti di scienza | fine 11000-12 | |
| Pinze lisce smussate | Millipore | XX6200006P | |
| Vetrino monouso per camera di conteggio da 20 micron | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 vetrini da camera |
| Microscopio da dissezione | Olympus | SZX7 | È possibile utilizzare qualsiasi marca standard |
| Pinze fini | Strumenti per la scienza fine | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Spugna di tenuta | autocostruita | ||
| Microscopio invertito | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Piccole forbici da dissezione | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Vortice da tavolo | Labnet | C1301B | |
| Tricaina | Sigmaaldrich | A5040 |
Riferimenti
- Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).....
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Ristampe e permessi
