L'amplificazione del segnale della tiramido durante la colorazione immunofluorescente consente la rilevazione sensibile di RIPK3 e MLKL fosforilati durante la necroptosi indotta da ZBP1 dopo infezione da HSV-1.
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Articolo metodologico
Amplificazione del segnale tiramido per la colorazione immunofluorescente della fosforilazione ZBP1-dipendente di RIPK3 e MLKL dopo infezione da HSV-1 in cellule umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La proteina chinasi 3 (RIPK3) e la sua linea mista di substrato (MLKL) sono regolatori critici della necroptosi, una forma infiammatoria di morte cellulare con importanti funzioni antivirali. L'autofosforilazione di RIPK3 induce fosforilazione e attivazione della proteina boia che forma i pori della necroptosi MLKL. Il traffico e l'oligomerizzazione di MLKL fosforilato sulla membrana cellulare provocano la lisi cellulare, caratteristica della morte cellulare necroptotica. Il sensore di acido nucleico ZBP1 viene attivato legandosi all'RNA a doppio filamento sinistrorso a forma Z (Z-RNA) dopo l'infezione da virus a RNA e DNA. L'attivazione di ZBP1 limita l'infezione virale inducendo la morte cellulare regolata, compresa la necroptosi, delle cellule ospiti infette. La microscopia a immunofluorescenza consente la visualizzazione di diverse fasi di segnalazione a valle della necroptosi mediata da ZBP1 su base cellulare. Tuttavia, la sensibilità della microscopia a fluorescenza standard, che utilizza gli attuali anticorpi fosfo-specifici disponibili in commercio contro RIPK3 e MLKL umani, preclude l'imaging riproducibile di questi marcatori. Qui, descriviamo una procedura di colorazione ottimizzata per la serina (S) fosforilata RIPK3 (S227) e MLKL (S358) in cellule umane HT-29 infettate da herpes simplex virus 1 (HSV-1). L'inclusione di una fase di amplificazione del segnale di tiramide (TSA) nel protocollo di colorazione immunofluorescente consente la rilevazione specifica di RIPK3 fosforilato S227. Inoltre, TSA aumenta notevolmente la sensibilità del rilevamento di MLKL fosforilato S358. Insieme, questo metodo consente la visualizzazione di questi due eventi di segnalazione critici durante l'induzione della necroptosi indotta da ZBP1.
Introduzione
La proteina chinasi 3 serina/treonina interagente con recettore (RIPK3) e la chinasi mista (MLKL) sono regolatori centrali della morte cellulare necroptotica 1,2. La necroptosi è una forma litica e infiammatoria di morte cellulare regolata coinvolta nell'immunità antivirale e nell'autoinfiammazione. La necroptosi delle cellule infette da virus interrompe immediatamente la replicazione del virus. La lisi cellulare dopo induzione necroptosi rilascia anche modelli molecolari associati al danno, che stimolano l'immunità antivirale 3,4. La necroptosi è iniz....
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Protocollo
1. Preparazione di tiramide biotinilata
- Preparare la tiramide biotinilata a partire dalla biotina-tiramide. Per preparare una soluzione madre da 10 mM, sciogliere 3,6 mg di biotina-tiramide in 1 ml di DMSO. Conservare il prodotto disciolto in aliquote a −20 °C per preservarne la qualità.
2. Mantenimento delle cellule HT-29 in coltura
NOTA: Gli HT-29 che esprimono ZBP1 sono stati generati per trasduzione con un lentivettore27 che codifica ZBP1 umano.
- Mantenere le cellule HT-29 che esprimono ZBP1 nel mezzo 5A di McCoy integrato con ....
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Risultati
La rilevazione immunofluorescente della fosforilazione di MLKL e in particolare della fosforilazione di RIPK3 nelle cellule umane è tecnicamente impegnativa26. Presentiamo qui un protocollo di colorazione migliorato per p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) umani dopo l'attivazione di ZBP1. Il protocollo include una fase TSA per migliorare il limite di rilevamento e la sensibilità dei segnali fluorescenti. Per convalidare il metodo, è stato eseguito un confronto fianco a fianco dell'immunofluorescenza me.......
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Discussione
Questo protocollo di colorazione immunofluorescente descrive l'uso dell'amplificazione del segnale della tiramido (TSA) per aumentare la sensibilità agli eventi di segnalazione della via di segnalazione necroptotica umana che sono difficili da rilevare, compresa la fosforilazione di RIPK3 e MLKL26. L'inclusione di un gradino TSA migliora significativamente la soglia di rilevamento di p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta la sensibilità dello sforzo p-MLKL (S358). TSA ha rivelato un segnale p-RI.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il VIB Bioimaging Core per la formazione, il supporto e l'accesso al parco strumenti. J.N. è supportato da una borsa di dottorato della Research Foundation Flanders (FWO). La ricerca nel gruppo J.M. è stata sostenuta da un Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), un junior research grant (G031022N) dalla Research Foundation Flanders (FWO), un CRIG young investigator proof-of-concept grant e dall'Università di Gand. La ricerca nel gruppo P.V. è stata sostenuta da EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 AT....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Antibodies | |||
| Anti-coniglio HRP | Agilent Technologies Belgio | K4002 | Envision+ System-HRP Marcato Polimero anti-coniglio |
| Capra anti-topo DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Anticorpo secondario |
| HSV-1 ICP0 Santa | Cruz | sc-53070 | Anticorpo |
| anti-ICP0 (HSV-1) di topoSiero di topo IAV-PR8 | Produzione interna | xx | Anticorpo policlonale anti-IAV-PR8 di topo |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Anticorpo anti-fosfo S358 di coniglio |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Anticorpo anti-RIPK3-fosfo S227 di coniglio |
| Fluorofori | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | Per visualizzare il nucleo delle cellule |
| Streptavidina accoppiata ad Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | Per visulalizzare molecole di biotina |
| Composti | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Substrato ossidante, necessario per l'attività HRP |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | Per fissare/reticolare le cellule |
| Biotinil-tiramide | R& D Systems | 6241 | Per amplificare il segnale, substrato HRP |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| Per la coltura cellulare: per staccare le cellule | |||
| 8,0 g/L di NaCl | |||
| 0,4 g/L di sale disodico di EDTA | |||
| EDTA 0,04% | Formulazione | 1,1 g/L Na2HPO4 | |
| 0,2 g/L di NaH2PO4 | |||
| 0,2 g/L KCl | |||
| 0,2 g/L di glucosio | |||
| Siero fetale bovino | TICO | FBS EU XXX | Per colture cellulari, mantenimento di colture cellulari; numero di lotto: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 inibitore della chinasi |
| L-Glutammina | Sigma-Aldrich | G7513 | Per colture cellulari, mantenimento di colture cellulari |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Soluzione bloccante |
| PBS | Gibco | ||
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | Per colture cellulari, mantenimento di colture cellulari |
| TNF-&alfa; | Produzione | interna-Molecola di segnalazione, in grado di innescare la morte cellulare in combinazione con BV6 e zVAD | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | Per permeabilizzare le cellule |
| Blu di tripano | Merck | 11732 | Per la conta cellulare, utilizzato come marcatore vivo/morto allo 0,1% |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T4424 | Per la coltura cellulare: per staccare le cellule |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | Per coltivare le cellule |
| Cotton Preping Balls-size medium | Microscopia elettronica | Scienze 71001-10 | Per pulire gli obiettivi |
| Immersol 518 F / 30 ° C | ZEISS | 444970-9000-000 | Per visualizzare il campione ad alti ingrandimenti |
| Detergente per lenti | ZEISS | 000000-0105-200 | Per pulire gli obiettivi |
| LSM880 Microscopio | Per visualizzare il campione | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | Per elaborare i dati |
| Prism 9 | Graphpad | xx | Per analizzare i dati, i test statistici e la generazione di grafici |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | Per eseguire quantificazioni |
| Zen black | ZEISS | xx | Per acquisire ed elaborare immagini |
| Zen blue | ZEISS | xx | Per visualizzare immagini |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) ceppo F | prodotto dal Dr. Jiahuai Han | nella replica domestica | HSV-1 come innesco per la necroptosi; Il dominio centrale RHIM di UL39/ICP6 è mutato (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) ceppo F | Prodotto dal Dr. Jiahuai Han | nella replicazione domestica | HSV-1 (WT) come controllo negativo per l'induzione della necroptosi (inibizione di ICP6) |
| IAV PR8 | nel repertorio domestico | nella replicazione | domestica IAV come innesco per la necroptosi |
Riferimenti
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....
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Ristampe e permessi
