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Articolo metodologico

Amplificazione del segnale tiramido per la colorazione immunofluorescente della fosforilazione ZBP1-dipendente di RIPK3 e MLKL dopo infezione da HSV-1 in cellule umane

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DOI:

10.3791/64332

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20 ottobre 2022

 ,  ,  , 
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

In questo articolo

Sommario

L'amplificazione del segnale della tiramido durante la colorazione immunofluorescente consente la rilevazione sensibile di RIPK3 e MLKL fosforilati durante la necroptosi indotta da ZBP1 dopo infezione da HSV-1.

Abstract

La proteina chinasi 3 (RIPK3) e la sua linea mista di substrato (MLKL) sono regolatori critici della necroptosi, una forma infiammatoria di morte cellulare con importanti funzioni antivirali. L'autofosforilazione di RIPK3 induce fosforilazione e attivazione della proteina boia che forma i pori della necroptosi MLKL. Il traffico e l'oligomerizzazione di MLKL fosforilato sulla membrana cellulare provocano la lisi cellulare, caratteristica della morte cellulare necroptotica. Il sensore di acido nucleico ZBP1 viene attivato legandosi all'RNA a doppio filamento sinistrorso a forma Z (Z-RNA) dopo l'infezione da virus a RNA e DNA. L'attivazione di ZBP1 limita l'infezione virale inducendo la morte cellulare regolata, compresa la necroptosi, delle cellule ospiti infette. La microscopia a immunofluorescenza consente la visualizzazione di diverse fasi di segnalazione a valle della necroptosi mediata da ZBP1 su base cellulare. Tuttavia, la sensibilità della microscopia a fluorescenza standard, che utilizza gli attuali anticorpi fosfo-specifici disponibili in commercio contro RIPK3 e MLKL umani, preclude l'imaging riproducibile di questi marcatori. Qui, descriviamo una procedura di colorazione ottimizzata per la serina (S) fosforilata RIPK3 (S227) e MLKL (S358) in cellule umane HT-29 infettate da herpes simplex virus 1 (HSV-1). L'inclusione di una fase di amplificazione del segnale di tiramide (TSA) nel protocollo di colorazione immunofluorescente consente la rilevazione specifica di RIPK3 fosforilato S227. Inoltre, TSA aumenta notevolmente la sensibilità del rilevamento di MLKL fosforilato S358. Insieme, questo metodo consente la visualizzazione di questi due eventi di segnalazione critici durante l'induzione della necroptosi indotta da ZBP1.

Introduzione

La proteina chinasi 3 serina/treonina interagente con recettore (RIPK3) e la chinasi mista (MLKL) sono regolatori centrali della morte cellulare necroptotica 1,2. La necroptosi è una forma litica e infiammatoria di morte cellulare regolata coinvolta nell'immunità antivirale e nell'autoinfiammazione. La necroptosi delle cellule infette da virus interrompe immediatamente la replicazione del virus. La lisi cellulare dopo induzione necroptosi rilascia anche modelli molecolari associati al danno, che stimolano l'immunità antivirale 3,4. La necroptosi è iniziata dall'attivazione di RIPK3 a seguito di interazioni mediate dal motivo di interazione omotipica (RHIM) RIP con una delle tre molecole attivanti a monte: RIPK1 (su coinvolgimento del recettore TNF 1 [TNFR1]), interferone-β che induce adattatori del dominio TIR (TRIF; su coinvolgimento dei recettori Toll-like 3 e 4) o la proteina legante il DNA 1 del sensore di acido nucleico antivirale (ZBP1)1,2 . La segnalazione della necroptosi procede attraverso una serie di eventi di fosforilazione a partire dall'autofosforilazione di RIPK3. L'autofosforilazione di RIPK3 umano alla serina (S)227 all'interno del suo dominio chinasico è un prerequisito per la necroptosi consentendo l'interazione con MLKL ed è comunemente usato come marcatore biochimico per l'attivazione di RIPK3 umano e la morte delle cellule necroptotiche 1,5. Una volta attivato, RIPK3 fosforila il ciclo di attivazione di MLKL a livello di treonina (T)357 e S3581. Ciò provoca un cambiamento nella conformazione MLKL, con conseguente esposizione del dominio del fascio a quattro eliche N-terminale. MLKL quindi oligomerizza e traffica verso la membrana cellulare dove forma un poro attraverso l'inserimento dei quattro fasci di eliche esposti nel doppio strato lipidico, portando infine alla morte cellulare 2,6.

ZBP1 è un sensore di acido nucleico antivirale che riconosce gli acidi nucleici sinistrorsi a forma Z, incluso l'RNA a doppio filamento nella conformazione Z (Z-RNA). Il legame Z-RNA avviene tramite due domini Zα posizionati al N-terminale di ZBP1. Si ritiene che lo Z-RNA che si accumula durante l'infezione da virus dell'RNA e del DNA coinvolga direttamente ZBP1 7,8. ZBP1 attivato recluta RIPK3 attraverso i suoi RHIM centrali e induce la morte cellulare regolata, inclusa la necroptosi 9,10. I virus hanno adottato numerosi meccanismi di fuga per contrastare la necroptosi delle cellule ospiti indotta da ZBP111. Ad esempio, la subunità 1 della ribonucleotide reduttasi del virus dell'herpes simplex 1 (HSV-1), nota come ICP6 e codificata da UL39, ospita RHIM al suo N-terminale che interferisce con l'attivazione di RIPK3 mediata da ZBP1 nelle cellule umane12,13,14,15. ZBP1 non solo limita la replicazione virale, ma studi sui topi hanno dimostrato che l'attivazione di ZBP1 causa malattie infiammatorie e stimola l'immunità al cancro 16,17,18,19,20,21. I protocolli che rilevano gli eventi di segnalazione che si verificano durante la necroptosi indotta da ZBP1 nelle cellule umane sono, quindi, preziosi per valutare il ruolo di ZBP1 in questi processi.

L'amplificazione del segnale di tiramido (TSA), nota anche come CARD (Catalyzed Reporter Deposition), è stata sviluppata per migliorare il limite di rilevazione e il rapporto segnale-rumore nei saggi immunologici basati su anticorpi. Durante la TSA, qualsiasi anticorpo primario può essere utilizzato per rilevare l'antigene di interesse. La perossidasi del rafano (HRP), accoppiata ad un anticorpo secondario, catalizza l'accumulo locale di radicali tiramidici biotinilati in presenza di perossido di idrogeno. Questi radicali biotina-tiramide attivati reagiscono quindi con residui di tirosina prossimale per formare legami covalenti. I potenziali substrati di tiramide-biotina includono l'antigene stesso, gli anticorpi primari e secondari e le proteine vicine. Pertanto, mentre la TSA migliora significativamente la sensibilità del test, parte della sua risoluzione spaziale viene persa. In una fase finale, le molecole di biotina vengono rilevate utilizzando streptavidina marcata con fluorescenza. La reazione HRP deposita molte molecole di tiramide-biotina sopra o vicino all'antigene di interesse. Ciò aumenta notevolmente il numero di siti di legame streptavidina-fluorocromo, amplificando così notevolmente la sensibilità del saggio (Figura 1). In alternativa, la tiramide può essere accoppiata direttamente a un fluorocromo, eliminando la necessità di fluorofori accoppiati a streptavidina. L'immunoistochimica delle proteine e l'ibridazione DNA/RNA in situ sono stati tra i primi metodi con cui la TSA è stata impiegata per migliorare l'intensità del segnale22,23. Più recentemente, la TSA è stata combinata con citometria a flusso intracellulare24 e spettrometria di massa25.

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la serina 227 fosforilata umana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) e la MLKL umana fosforilata (p-MLKL [S358]) dopo l'attivazione di ZBP1 da infezione da HSV-1 utilizzando la microscopia a immunofluorescenza. Utilizziamo una linea cellulare di adenocarcinoma colorettale umano HT-29 sensibile alla necroptosi che è stata trasdotta per esprimere stabilmente ZBP1 umano. Queste cellule sono state infettate con un ceppo HSV-1 che esprime una proteina ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) in cui quattro aminoacidi core all'interno del RHIM virale (VQCG) sono stati sostituiti da alanine (AAAA), rendendo così l'ICP6 incapace di bloccare la necroptosi 13,14,15 mediata da ZBP1. Per superare il problema del basso rapporto segnale-rumore degli anticorpi attualmente disponibili in commercio diretti contro p-RIPK3 e p-MLKL nell'immunocolorazione26, eseguiamo una fase di amplificazione del segnale del tiramide (TSA) (Figura 1), che si traduce nella robusta rilevazione di p-RIPK3 umano (S227) e migliora la sensibilità di rilevamento del p-MLKL umano (S358) di un ordine di grandezza.

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Protocollo

1. Preparazione di tiramide biotinilata

  1. Preparare la tiramide biotinilata a partire dalla biotina-tiramide. Per preparare una soluzione madre da 10 mM, sciogliere 3,6 mg di biotina-tiramide in 1 ml di DMSO. Conservare il prodotto disciolto in aliquote a −20 °C per preservarne la qualità.

2. Mantenimento delle cellule HT-29 in coltura

NOTA: Gli HT-29 che esprimono ZBP1 sono stati generati per trasduzione con un lentivettore27 che codifica ZBP1 umano.

  1. Mantenere le cellule HT-29 che esprimono ZBP1 nel mezzo 5A di McCoy integrato con L-glutammina, sodio-piruvato e siero bovino fetale al 10% (d'ora in poi indicato come mezzo completo) e mantenere in un incubatore a 37 ° C con il 5% di anidride carbonica. Idealmente, utilizzare celle con un numero di passaggio basso (inferiore a 10). Lasciare le cellule a recuperare per almeno 5 giorni dopo il ciclo di disgelo prima dell'inizio dell'esperimento.
  2. Per staccare le cellule dal pallone di coltura, rimuovere il terreno e lavare le cellule con 5 ml di PBS (preriscaldato a 37 °C). Quindi, aggiungere la quantità appropriata di tripsina/EDTA (0,05% tripsina e 0,032% EDTA, rispettivamente, preriscaldati a 37 °C) alle celle (2 mL per un matraccio T75, 3 mL per un matraccio T175).
  3. Incubare le cellule con tripsina/EDTA per un massimo di 10 minuti in un incubatore a 37 °C con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, toccare il pallone e controllare visivamente se le cellule si sono staccate dal pallone usando un microscopio con ingrandimento dell'obiettivo 4x-20x.
  4. Se le cellule non sono completamente staccate, incubare per altri 5 minuti a 37 °C. Quando le cellule sono staccate, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 6 ml di mezzo pieno al pallone.
  5. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Contare le cellule usando una colorazione blu tripano per valutare la vitalità; Si raccomanda una diluizione 1:5. Procedere con l'esperimento solo se la vitalità delle cellule supera il 90%.

3. Avvio dell'esperimento, semina e stimolazione delle cellule

  1. Semina 90.000 cellule HT-29 che esprimono ZBP1 in mezzo intero in una piastra di pozzetto di superficie di 1 cm² che consente la microscopia di fascia alta. Utilizzare un volume finale di 200 μL per pozzetto.
  2. Incubare le cellule durante la notte a 37 °C con il 5% di anidride carbonica. Prendi in considerazione che alcuni pozzetti extra devono essere seminati per i controlli di colorazione, che è spiegato più dettagliatamente nel passaggio 5.6.
  3. Quando le cellule raggiungono il 70% -80% di confluenza, aggiungere uno stimolo che induce necroptosi alle cellule. Qui, le cellule sono state infettate con HSV-1 ICP6mutRHIM (molteplicità di infezione [MOI] di 5, definita come unità formanti placca (pfu) divisa per il numero di cellule; il pfu è stato quantificato utilizzando un saggio di placca sulle cellule Vero) per 6 ore, 8 ore o 10 ore.
  4. Come controllo positivo per l'induzione della necroptosi, stimolare le cellule per 4 ore con un cocktail che induce necroptosi contenente 30 ng/mL di TNF, 20 μM dell'inibitore pan-caspasi zVAD-fmk e 5 μM del bimetici SMAC BV6.
  5. Come controllo negativo per la colorazione p-RIPK3 (S227), includere GSK'840 (1 μM) per inibire l'attività della chinasi RIPK3 e prevenire l'autofosforilazione di S227. Idealmente, aggiungere l'inibitore in una condizione non trattata e dopo la stimolazione necroptosi. L'inibitore può essere aggiunto contemporaneamente all'infezione virale.
  6. Preparare le stimolazioni in mezzo intero, preriscaldato a 37 °C. Utilizzare un volume finale di 200 μL per pozzetto per tutte le stimolazioni.

4. Fissaggio delle celle

  1. Rimuovere il mezzo e lavare le celle con 200 μL di 1x PBS. Quindi, aggiungere 150 μL di PFA al 4% (già equilibrato a temperatura ambiente) alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
    NOTA: se si utilizzano celle che si staccano facilmente, la fissazione delle celle può essere ottimizzata come segue. Rimuovere 100 μL di mezzo dal pozzetto, in modo che un volume di 100 μL rimanga sulla piastra. Aggiungere 100 μL di PFA al 4% alle cellule. Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il mezzo / fissativo dai pozzetti e sostituirlo con 150 μL di PFA al 4%. Incubare le cellule per altri 20 minuti a temperatura ambiente per garantire la completa fissazione delle cellule.
  2. Dopo la fissazione, rimuovere il 4% di PFA e lavare le cellule 3x con 200 μL di 1x PBS. I campioni possono essere conservati in un eccesso (>200 μL) di 1x PBS a 4 °C durante la notte fino a ulteriore elaborazione.

5. Permeabilizzazione e colorazione primaria

  1. Rimuovere il PBS e aggiungere 100 μL di tampone di permeabilizzazione (0,5% Triton X-100 in PBS). Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione e, successivamente, lavare i pozzetti con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare la camera di imaging con tampone di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile (20-30 movimenti oscillanti al minuto).
  3. Per evitare il legame non specifico degli anticorpi primari, aggiungere 100 μL di mezzo bloccante e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. In alternativa, questa fase di blocco può essere sostituita dal blocco con BSA al 3%, Triton-X-100 allo 0,1% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Lavare i pozzetti 3 volte con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
  5. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio, aggiungere gli anticorpi primari alla camera di imaging e incubare per una notte a 4 °C. Utilizzare un volume finale di 100 μL per coprire il pozzetto. Durante l'incubazione notturna a 4°C, non posizionare la camera di imaging su uno shaker da laboratorio inclinabile.
    NOTA: Anti p-MLKL (S358; diluizione: 1:200) e anti-p-RIPK3 (S227; diluizione: 1:200) condividono il coniglio come specie ospite e non devono quindi essere combinati in un unico pozzetto. Per monitorare l'infezione virale, combinare un anticorpo primario contro una proteina virale di scelta con p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227). Qui, le cellule sono state infettate con infezione da HSV-1 seguita da colorazione ICP0 (diluizione: 1:50, specie ospite: topo).
  6. Prendi in considerazione i controlli di colorazione necessari a questo punto. Includi sempre una condizione anticorpale non primaria per visualizzare il potenziale sfondo della fase di amplificazione TSA per impostare la soglia di mascheramento (vedi passaggio 9).
    NOTA: Nel caso di un protocollo di co-colorazione (ad esempio, combinando p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227] con un anticorpo contro una proteina virale) utilizzare anche singole coloranti. L'uso di singole macchie è importante per correggere il potenziale segnale di bleed-through in altri canali di imaging.

6. Amplificazione del segnale della tiramido (TSA)

  1. Rimuovere la miscela di anticorpi primari e lavare i pozzetti 3 volte con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
  2. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 μL di anticorpo secondario marcato con HRP riconoscendo la specie di anticorpo primario che deve essere amplificata. Per amplificare il segnale p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), aggiungere 100 μL di HRP anti-coniglio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
    NOTA: solo p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227) saranno amplificati. La colorazione di una proteina virale verrà visualizzata utilizzando un metodo di colorazione indiretta standard.
  3. Successivamente, lavare i pozzetti 3 volte con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
  4. Nei passaggi successivi, aggiungere la tiramide biotinilata alla piastra microscopica. Utilizzando il gruppo HRP accoppiato agli anticorpi secondari, la reazione enzimatica innescherà la formazione di radicali tiramidici in prossimità del bersaglio primario (qui, p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227]).
  5. Per attivare l'attività enzimatica della HRP, aggiungere un substrato ossidante insieme alla tiramide biotinilata. Per ottenere ciò, integrare il tampone TSA (acido borico 0,1 M [pH 8,5]) con 0,03 M H 2 O2; in particolare, prendere 5 ml di tampone TSA e aggiungere 5 μL di H2O2 al 30%.
  6. Ora, diluire la biotina-tiramide in H 2 O2-integratotampone TSA che va da 1: 1.000 a 1: 20.000.
    NOTA: Il fattore di diluizione della biotina-tiramide deve essere ottimizzato per lotto.
  7. Rimuovere il tampone di lavaggio dai pozzetti e aggiungere biotina-tiramide diluita ai pozzetti fino a un volume finale di 100 μL. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti su uno shaker da laboratorio inclinabile.
  8. Quindi, lavare i pozzetti 3x con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.

7. Fluorofori

NOTA: Poiché il segnale dell'anticorpo primario viene convertito in un gruppo biotina, p-MLKL (S358) e p-RIPK3 (S227) vengono visualizzati utilizzando streptavidina accoppiata a un fluoroforo (fluoroforo 568, diluizione: 1:500). Inoltre, i nuclei sono colorati con DAPI (5 μg/mL). Se una proteina virale è inclusa nel protocollo di colorazione, includere un anticorpo secondario adatto marcato con fluorescenza contro la specie ospite dell'anticorpo primario. Nei risultati rappresentativi, è stato utilizzato un mouse anti-ICP0. Come anticorpo secondario è stato incluso un antitopo di capra accoppiato al fluoroforo 633 (diluizione: 1:1.000).

  1. Preparare la miscela colorante in tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS) contenente gli anticorpi e le macchie sopra menzionate. Rimuovere il tampone di lavaggio, aggiungere 100 μL di miscela colorante e incubare a temperatura ambiente per 1 ora su uno shaker da laboratorio inclinabile. Tenere la camera di imaging al riparo dalla luce da questo passaggio in poi.
  2. Quindi, lavare i pozzetti 2x con tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
  3. Infine, sciacquare i pozzetti 2x con 1x PBS. Conservare i campioni in un eccesso (> 200 μL) di 1x PBS fino all'imaging. In alternativa, immergere i campioni nel supporto di montaggio per preservare la colorazione. La camera di imaging è ora pronta per essere visualizzata su un microscopio confocale.

8. Imaging con un microscopio confocale

  1. Accendere il microscopio confocale e i laser almeno 10 minuti prima dell'imaging.
  2. Usa un obiettivo ad immersione per la sensibilità. Preferibilmente, utilizzare l'ingrandimento dell'obiettivo 40x o 63x. Prima dell'imaging, pulire gli obiettivi di immersione con il detergente per lenti utilizzando appositi batuffoli di cotone. Obiettivi sporchi (ad esempio, a causa della polvere) possono causare immagini di qualità inferiore.
  3. Mettere una quantità eccessiva di olio sul fondo della camera di imaging. Inoltre, aggiungi una goccia d'olio sull'obiettivo della scelta.
  4. Metti la camera di imaging sul microscopio. Trova il campo di messa a fuoco utilizzando la colorazione DAPI o l'imaging in campo chiaro. Se necessario, spostarsi intorno alla camera di imaging per garantire la corretta diffusione dell'olio ad immersione.
  5. Impostare le tracce di imaging necessarie sul microscopio. A seconda del microscopio, i seguenti passaggi possono variare (Tabella 1).
    NOTA: quando si impostano le tracce di imaging, programmare le tracce in modo che la colorazione nucleare venga misurata per ultima. Il laser a 405 nm può contribuire al fotosbiancamento e, quindi, alla perdita di segnale specifico in tutti i canali.
  6. Per analizzare una cella completa per la presenza di p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), misurare gli stack z che coprono l'altezza della cella. Qui, gli z-stack sono stati fatti di 40 fette ogni 0,16 μm, risultando in un intervallo di 6,22 μm.

PistaLaserDivisore di fascioFiltro
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)561MBS -405 +BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Gene virale: ICP0633MBS -405 +BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Nucleo: DAPI405MBS -405 +BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

Tabella 1: Tracce di imaging per la visualizzazione cellulare.

9. Analisi e quantificazione dei dati

  1. Carica le immagini microscopiche sul software. Utilizzare la messa a fuoco estesa per visualizzare tutte le informazioni dello z-stack in un'immagine 2D.
  2. Successivamente, programmare il protocollo di analisi per estrarre le seguenti informazioni: il numero di celle per immagine, la somma dei voxel che mostrano la colorazione p-RIPK3 (S227) + o p-MLKL (S358) +. Un voxel rappresenta un volume tridimensionale, definito come l'equivalente tridimensionale di un pixel.
  3. Per quantificare il numero di celle per immagine, segmentare il nucleo. Per ridurre il rumore nei risultati della segmentazione, aggiungere una limitazione delle dimensioni alla segmentazione (>100 μm³). Il numero di nuclei segmentati rappresenta il numero di cellule nell'immagine.
  4. Per quantificare la quantità di voxel p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+, programmare una segmentazione basata su soglia. Impostare la soglia in modo che nessun segnale venga rilevato nelle immagini senza anticorpi primari (NP).
  5. Adattare ulteriormente la soglia utilizzando le immagini della condizione di simulazione non trattata. Per garantire il rilevamento sensibile dell'aumento del segnale dovuto alla stimolazione della necroptosi, limitare il prelievo dei voxel p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ in condizioni simulate impostando una soglia più alta. Controllare sempre il protocollo di analisi programmato in diverse immagini dalla condizione simulata e dall'infezione virale che induce la necroptosi.
  6. Eseguite l'analisi su tutti i set di immagini. Esporta la quantificazione voxel e la segmentazione del nucleo in un file .txt per ulteriori elaborazioni nel software per fogli di calcolo.
  7. Crea una tabella pivot dei dati che mostra il nome dell'immagine, la quantificazione del nucleo e la somma dei voxel rilevati.
  8. Quindi, dividi la somma dei voxel positivi per il conteggio delle cellule nell'immagine. Ciò si traduce in un valore relativo di voxel positivi per cellula. Per visualizzare l'aumento di fold, dividere il valore relativo di p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ voxel per cellula per la mediana della condizione non trattata (mock).

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Risultati

La rilevazione immunofluorescente della fosforilazione di MLKL e in particolare della fosforilazione di RIPK3 nelle cellule umane è tecnicamente impegnativa26. Presentiamo qui un protocollo di colorazione migliorato per p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) umani dopo l'attivazione di ZBP1. Il protocollo include una fase TSA per migliorare il limite di rilevamento e la sensibilità dei segnali fluorescenti. Per convalidare il metodo, è stato eseguito un confronto fianco a fianco dell'immunofluorescenza me...

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Discussione

Questo protocollo di colorazione immunofluorescente descrive l'uso dell'amplificazione del segnale della tiramido (TSA) per aumentare la sensibilità agli eventi di segnalazione della via di segnalazione necroptotica umana che sono difficili da rilevare, compresa la fosforilazione di RIPK3 e MLKL26. L'inclusione di un gradino TSA migliora significativamente la soglia di rilevamento di p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta la sensibilità dello sforzo p-MLKL (S358). TSA ha rivelato un segnale p-RI...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il VIB Bioimaging Core per la formazione, il supporto e l'accesso al parco strumenti. J.N. è supportato da una borsa di dottorato della Research Foundation Flanders (FWO). La ricerca nel gruppo J.M. è stata sostenuta da un Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), un junior research grant (G031022N) dalla Research Foundation Flanders (FWO), un CRIG young investigator proof-of-concept grant e dall'Università di Gand. La ricerca nel gruppo P.V. è stata sostenuta da EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG e GIGG consortia e VIB.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Antibodies
Anti-coniglio HRPAgilent Technologies BelgioK4002Envision+ System-HRP Marcato Polimero anti-coniglio
Capra anti-topo DyLight 633Thermofisher35513Anticorpo secondario
HSV-1 ICP0 SantaCruzsc-53070Anticorpo
anti-ICP0 (HSV-1) di topoSiero di topo IAV-PR8Produzione internaxxAnticorpo policlonale anti-IAV-PR8 di topo
pMLKLAbcamab187091Anticorpo anti-fosfo S358 di coniglio
pRIPK3Abcamab209384Anticorpo anti-RIPK3-fosfo S227 di coniglio
Fluorofori
DAPIThermofisherD21490Per visualizzare il nucleo delle cellule
Streptavidina accoppiata ad Alexa Fluor 568ThermofisherS11226Per visulalizzare molecole di biotina
Composti
30% H2O2SigmaH1009Substrato ossidante, necessario per l'attività HRP
4% PFASANBIOAR1068Per fissare/reticolare le cellule
Biotinil-tiramideR& D Systems6241Per amplificare il segnale, substrato HRP
BV-6SelleckchemS7597BV6 IAP Inhibitor
         Per la coltura cellulare: per staccare le cellule
         8,0 g/L di NaCl
         0,4 g/L di sale disodico di EDTA
EDTA 0,04%Formulazione1,1 g/L Na2HPO4
         0,2 g/L di NaH2PO4
         0,2 g/L KCl
         0,2 g/L di glucosio
Siero fetale bovinoTICOFBS EU XXXPer colture cellulari, mantenimento di colture cellulari; numero di lotto: 90439
GSK'840AobiousAOB0917RIPK3 inibitore della chinasi
L-GlutamminaSigma-AldrichG7513Per colture cellulari, mantenimento di colture cellulari
MAXblockActive Motif15252Soluzione bloccante
PBSGibco
Piruvato di sodioSigma-AldrichS8636Per colture cellulari, mantenimento di colture cellulari
TNF-&alfa;Produzioneinterna-Molecola di segnalazione, in grado di innescare la morte cellulare in combinazione con BV6 e zVAD
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50MLPer permeabilizzare le cellule
Blu di tripanoMerck11732Per la conta cellulare, utilizzato come marcatore vivo/morto allo 0,1%
TripsinaSigma-AldrichT4424Per la coltura cellulare: per staccare le cellule
zVADBachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottomiBidi80807Per coltivare le cellule
Cotton Preping Balls-size mediumMicroscopia elettronicaScienze 71001-10Per pulire gli obiettivi
Immersol 518 F / 30 ° CZEISS444970-9000-000Per visualizzare il campione ad alti ingrandimenti
Detergente per lentiZEISS000000-0105-200Per pulire gli obiettivi
LSM880 MicroscopioPer visualizzare il campione
Software
ExcelOfficexxPer elaborare i dati
Prism 9GraphpadxxPer analizzare i dati, i test statistici e la generazione di grafici
Volocity 6.3VolocityxxPer eseguire quantificazioni
Zen blackZEISSxxPer acquisire ed elaborare immagini
Zen blueZEISSxxPer visualizzare immagini
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) ceppo Fprodotto dal Dr. Jiahuai Hannella replica domesticaHSV-1 come innesco per la necroptosi; Il dominio centrale RHIM di UL39/ICP6 è mutato (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) ceppo FProdotto dal Dr. Jiahuai Hannella replicazione domesticaHSV-1 (WT) come controllo negativo per l'induzione della necroptosi (inibizione di ICP6)
IAV PR8nel repertorio domesticonella replicazionedomestica IAV come innesco per la necroptosi
interna 10444402 confocale Fast Airyscan

Riferimenti

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