Articolo metodologico

L'isolamento della linfa mesenterica fluente nei topi per quantificare in vivo la cinetica dell'assorbimento dei lipidi alimentari e della secrezione di chilomicroni

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DOI:

10.3791/64338

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30 novembre 2022

 ,  , 
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive un protocollo chirurgico dettagliato per isolare la linfa intestinale fluente in risposta alle infusioni di nutrienti intraduodenali nei topi. Ciò consente la determinazione fisiologica dell'assorbimento lipidico intestinale totale e della sintesi e secrezione di chilomicroni in risposta a vari nutrienti sperimentali.

Abstract

Le lipoproteine intestinali, in particolare i chilomicroni ricchi di trigliceridi, sono uno dei principali motori del metabolismo, dell'infiammazione e delle malattie cardiovascolari. Tuttavia, isolare le lipoproteine intestinali è molto difficile in vivo perché vengono prima secrete dall'intestino tenue nei linfatici mesenterici. La linfa contenente chilomicrone si svuota quindi nella vena succlavia dal dotto toracico per fornire componenti del pasto al cuore, ai polmoni e, infine, alla circolazione di tutto il corpo. L'isolamento dei chilomicroni naïve è impossibile dal sangue poiché il trigliceride chilomicronico subisce idrolisi immediatamente dopo l'interazione con la lipoproteina lipasi e altri recettori delle lipoproteine in circolazione. Pertanto, la procedura originale della fistola linfatica di 2 giorni, descritta da Bollman et al. nei ratti, è stata storicamente utilizzata per isolare la linfa mesenterica fresca prima del suo ingresso nella vena toracica. Questo protocollo è stato migliorato e professionalizzato dal laboratorio di Patrick Tso negli ultimi 45 anni, consentendo l'analisi di queste lipoproteine critiche e secrezioni dall'intestino. La procedura della fistola linfatica Tso è stata aggiornata e viene presentata qui visivamente per la prima volta. Questa procedura rivista è una tecnica chirurgica di un solo giorno per l'installazione di un tubo di alimentazione duodenale, l'incannulamento del dotto linfatico mesenterico e la raccolta della linfa dopo un pasto nei topi coscienti. I principali vantaggi di queste nuove tecniche includono la capacità di raccogliere in modo riproducibile la linfa dai topi (che sfrutta la potenza dei modelli genetici murini); il tempo di anestesia ridotto per i topi durante l'impianto del tubo di infusione duodenale e della cannula linfatica; la capacità di campionare continuamente la linfa durante il periodo di alimentazione e post-prandiale; la capacità di misurare quantitativamente ormoni e citochine prima della loro diluizione e idrolisi enzimatica nel sangue; e la capacità di raccogliere grandi quantità di linfa per isolare le lipoproteine intestinali. Questa tecnica è un potente strumento per misurare direttamente e quantitativamente l'assorbimento dei nutrienti alimentari, la sintesi delle lipoproteine intestinali e la secrezione di chilomicroni.

Introduzione

L'importanza fisiologica del sistema linfatico mesenterico
I linfatici mesenterici sono stati descritti in qualche forma dal ~300 a.C. quando Erofilo descrisse il sistema portale epatico e tutte le "vene assorbenti nell'intestino"1,2,3,4,5. Per più di 1.700 anni dopo questa descrizione iniziale, una caratteristica distintiva dei linfatici intestinali era la presenza di liquido lattiginoso nella linfa mesenterica poco dopo un pasto3. Ora è noto che la linfa lattiginosa contenente chilomicroni (linfa "chilosa") non drena nella vena porta e nel fegato, ma viaggia invece attraverso la cisterna chyli nel dotto toracico e, infine, si unisce al sangue nella vena succlavia sinistra6. A causa di questa disposizione anatomica, la linfa chilosa viaggia prima attraverso il cuore e i polmoni prima di circolare attraverso il resto del corpo. Ciò significa che il cuore e i polmoni ottengono un "primo passaggio" alle secrezioni nella linfa mesenterica7.

Un ruolo importante dei linfatici mesenterici è il loro trasporto di lipidi alimentari dall'intestino tenue 8,9,10. Anatomicamente, chilomicroni, cellule immunitarie intestinali 11,12,13,14, ormoni intestinali 15,16,17,18, antigeni 19,20,21, composti lipofili non chilomicroni 22,23 e il liquido in eccesso entrano nei lattoli sottostanti la membrana basale degli enterociti e vengono quindi concentrati attraverso i capillari linfatici ai linfonodi mesenterici. Ci sono probabilmente molti componenti linfatici mesenterici sconosciuti, inclusi metaboliti, antigeni, contaminanti ambientali, sostanze nutritive e molecole di segnalazione.

I componenti della linfa mesenterica non sono stati identificati sistematicamente, in gran parte a causa della difficoltà di isolare la linfa mesenterica. L'accesso alla linfa mesenterica è sempre stata una sfida seria perché i dotti linfatici sono incolori e, tranne dopo un pasto grasso quando diventano chilosi e lattiginosi, i linfatici mesenterici contengono fluido linfatico incolore 6,8,9,10.

Metodi attuali e comuni per isolare la linfa intestinale
Non è possibile accedere alla linfa mesenterica nell'uomo (tranne che per circostanze rare ed estreme in cui si è verificato un grave trauma gastrointestinale)24. La raccolta linfatica in vivo è chirurgicamente complessa e impegnativa. La procedura originale della fistola linfatica di 2 giorni è stata descritta da Bollman et al.25 ed è stata migliorata e professionalizzata dal laboratorio di Patrick Tso negli ultimi 45 anni 26,27. La procedura di fistola linfatica consente ai ricercatori di raccogliere la linfa fluente da animali coscienti durante un periodo di infusione di lipidi duodenali di 6 ore.

Il modello di fistola linfatica è stato utilizzato principalmente nei ratti per misurare la velocità di flusso linfatico, la produzione di trigliceridi e colesterolo (o altri composti intrisi duodenali), la composizione del chilomicrone e le concentrazioni di ormoni intestinali. In misura minore, questa tecnica può essere utilizzata anche nei topi, sebbene la sopravvivenza chirurgica e il volume linfatico ne risentano. A causa delle difficoltà nel vedere i dotti linfatici mesenterici, i metodi storici hanno incluso l'incannulamento della linfa mesenterica in animali più grandi come mini-maiali28, pecore29, maiali30, cani31 e ratti17. Lavorare con questi modelli più grandi richiede molte risorse e non consente studi in modelli knock-in o knock-out.

Sono stati utilizzati anche approcci alternativi. I chilomicroni possono essere isolati dal sangue nello stato post-prandiale (anche se questi saranno parzialmente idrolizzati dalla lipoproteina lipasi plasmatica)32,33,34,35. Il dotto toracico può anche essere incannulato, sebbene la linfa ivi raccolta contenga una mescolanza di linfa mesenterica e drenaggio linfatico extra-intestinale26,36. In vitro, le cellule Caco-2 secernono una particella simile al chilomicrone in risposta al trattamento con acidi grassi e queste cellule possono essere co-coltivate con cellule linfatiche endoteliali o vascolari rilevanti37,38. È stato dimostrato che le colture organoidi intestinali umane e di topo elaborano lipidi apicali e secernono chilomicroni 39,40,41,42. Questi modelli sono molto vantaggiosi e consentono approfondimenti meccanicistici nella fisiologia dell'intestino tenue, ma non possono replicare la complessità, i gradienti fisio-chimici o il flusso linfatico dinamico dei linfatici mesenterici in situ.

Vantaggi del modello di fistola linfatica di topo 1 giorno presentato qui
Rispetto a questi altri metodi di isolamento delle lipoproteine intestinali, la tecnica della fistola linfatica Tso Lab è stata tradizionalmente considerata la tecnica gold standard per misurare l'assorbimento dei nutrienti alimentari nella linfa mesenterica. Questa tecnica in vivo ha il vantaggio di catturare gli aspetti fisiologici chiave dell'assorbimento lipidico dietetico, l'aspetto dinamico dei composti durante il periodo di assorbimento, che richiede il campionamento ripetuto della linfa mesenterica fluente in animali vivi con nutrienti duodenali. Questa tecnica chirurgica misura anche gli ormoni intestinali e le citochine direttamente nel loro compartimento fisiologico piuttosto che nel sangue, dove vengono diluiti ed enzimaticamente degradati17,43.

Se la domanda sperimentale richiede una comprensione della dinamica della secrezione lipidica o dell'assorbimento dinamico e del metabolismo di qualsiasi composto o farmaco gastrointestinale idrofobo, allora questa tecnica non solo è appropriata ma è anche l'unico approccio che interpola il movimento del contenuto luminale dall'intestino prossimale a quello distale (stomaco-colon) e dalla superficie apicale a quella basolaterale (contenuto luminale attraverso enterociti a latteali e circolazione portale). Poiché questa tecnica impiega la consegna luminale di nutrienti attraverso il catetere intraduodenale, e poiché la linfa mesenterica fluente viene deviata e raccolta, l'intero apparato di assorbimento è sotto controllo sperimentale e può essere utilizzato per valutare qualitativamente i profili di assorbimento intestinale piccoli.

Presentato visivamente qui per la prima volta è un importante aggiornamento del modello di fistola linfatica Tso Lab, che (1) riduce il tempo sperimentale a un periodo di impianto chirurgico di 1 giorno e raccolta sperimentale; (2) migliora la sopravvivenza dei topi e le considerazioni relative al benessere degli animali; e (3) aumenta la riproducibilità dell'approccio nei topi per sfruttare la potenza dei modelli genetici murini. Questa tecnica deve essere considerata un gold standard per tutte le questioni sperimentali di secrezioni intestinali, lipoproteine o assorbimento lipidico alimentare ed è la tecnica migliore per la determinazione ad alta fedeltà della cinetica di assorbimento lipidico e dei chilomicroni.

Protocollo

Tutte le procedure chirurgiche sono state approvate dal Comitato interno per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh [Protocollo # 20047008] e sono conformi alla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL6/J, di età compresa tra 8 e 14 settimane. I topi sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Tutti i topi sono stati alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 ore con accesso ad libitum a chow e acqua standard.

1. Preparazione degli animali

  1. A seconda del design sperimentale, nutrire i topi o consentire loro di digiunare.
    NOTA: Un digiuno notturno non è necessario a meno che non ci siano preoccupazioni per le differenze nel tasso di svuotamento dello stomaco.
  2. Indurre l'anestesia con gas isoflurano al 5% e garantire una corretta anestetizzazione con il pizzicamento della coda e della punta. Una volta anestetizzata, mantenere i topi su un piano anestetico adeguato con il 2% -3% di gas isoflurano e posizionarli con nastro adesivo sulla piattaforma chirurgica.
  3. Tenere i topi caldi su una piattaforma chirurgica riscaldata che utilizza acqua calda circolante (vedi Tabella dei materiali).

2. Chirurgia e disegno sperimentale

  1. Iniziare l'intervento chirurgico applicando un unguento veterinario sugli occhi, radendo l'addome e applicando uno scrub chirurgico antisettico (vedi tabella dei materiali) al sito chirurgico. Questo sterilizza l'incisione e riduce la generazione di pelo trasportato dall'aria durante l'incisione della linea mediana.
  2. Mantenere un'area di lavoro sterile utilizzando strumenti sterili, tende e altre attrezzature e forniture necessarie.
  3. Iniettare la prima dose di carprofen (vedere Tabella dei materiali) per alleviare il dolore (i.p.) alla dose di 5 mg/kg.
  4. Afferrare la pelle con una pinzetta e fare un'incisione addominale mediana con piccole forbici. Tagliare verso lo sterno (mai sopra) e ridurre al grasso inguinale. Quindi, tagliare lo strato muscolare separatamente usando le forbici.
    NOTA: Sterilizzare tutte le apparecchiature prima dell'uso.
  5. Utilizzando il divaricatore, spostare i visceri peritoneali fino a quando il dotto linfatico è visibile.
  6. Usando una punta Q imbevuta di soluzione salina (vedi Tabella dei materiali), sposta il fegato verso il lato superiore destro del corpo e l'intestino e lo stomaco a sinistra dell'animale.
  7. Allungare il duodeno verso sinistra trasversalmente per esporre l'arteria mesenterica superiore e il dotto linfatico intestinale.
  8. Preparare un tubo della cannula della lunghezza di 30-40 cm inserendo un ago smussato nel tubo della cannula (vedere Tabella dei materiali) e lavare una piccola quantità di eparina (1.000 U/L) attraverso il tubo usando una siringa da 1 ml.
    NOTA: Il flusso linfatico è assistito dalla gravità per fluire verso il basso e nelle provette di raccolta della microcentrifuga sul ghiaccio. A seconda di dove si trova il secchiello del ghiaccio di raccolta adiacente alla configurazione chirurgica, potrebbe essere necessario regolare la lunghezza del tubo della cannula.
  9. Utilizzare le forbici per tagliare una smussatura sulla punta del tubo della cannula.
  10. Fare un'incisione superficiale con le forbici dell'iride (vedi Tabella dei materiali) nel dotto linfatico a circa 5 mm dalla sua comparsa nell'intestino tenue.
  11. Tenere il tubo della cannula con un paio di pinze sottili e inserire delicatamente la smussatura della punta nel condotto.
    NOTA: È importante non spingere troppo la cannula nel condotto perché ciò potrebbe impedire il flusso linfatico quando gli organi retratti vengono riportati nella loro posizione originale.
  12. Il dotto linfatico è troppo fragile per le manipolazioni associate alla legatura del catetere con una sutura. Invece, utilizzare una goccia di colla cianoacrilica (vedi Tabella dei materiali) per incollare la cannula linfatica nel dotto linfatico mesenterico.
  13. Controllare la linfa lattiginosa, bianca (se è stato utilizzato il gavage di olio d'oliva pre-operatorio) o la linfa chiara (se i topi hanno digiunato pre-operatorio) che inizia a fluire immediatamente attraverso la cannula della fistola linfatica.
    NOTA: Controllare che la cannula linfatica sia posizionata correttamente e che la linfa scorra; Continuare con il posizionamento della cannula intraduodenale.
  14. Utilizzando un ago da 18 G, forare un foro attraverso la regione pilorica dello stomaco posteriore allo sfintere pilorico.
  15. Inserire il tubo di infusione duodenale (vedere Tabella dei materiali) attraverso quel foro nello stomaco a circa 1-2 mm oltre lo sfintere pilorico nel duodeno.
  16. Fissare con una legatura con corda di borsa con sutura di seta 5-0 (vedi Tabella dei materiali) con un ago allo stomaco e sigillare con una goccia di colla cianoacrilica per evitare perdite.
  17. Iniziare l'infusione intraduodenale di glucosio al 5% - 0,9% di soluzione salina a 0,3 ml/h.
    NOTA: Quando si utilizzano topi con piccole variazioni nel peso corporeo che hanno circa 25 g (~ 8 settimane di età), l'infusione di 0,3 ml / h di glucosio / soluzione salina è appropriata. Se i topi sono drammaticamente più grandi, la velocità di infusione deve essere regolata verso l'alto per tenere conto della variazione del peso corporeo e del volume del sangue.
  18. Sostituire gli organi nella cavità corporea e sutura (5-0) i tessuti muscolari e cutanei separatamente.
    NOTA: La cannula linfatica e il tubo di alimentazione intraduodenale sono entrambi esteriorizzati attraverso la stessa incisione. Non vi è alcuna precedenza per separare i tubi con una sutura e nessuna preferenza per l'angolo di esternazione dei tubi.
  19. Dopo l'intervento chirurgico, ma prima del ritiro dell'anestetico, posizionare delicatamente i topi in sistemi di ritenuta Snuggle (vedi Tabella dei materiali) per limitare la motilità.
    NOTA: Le cinture delle coccole impediscono ai topi di afferrare o ruotare la testa per masticare i punti e i tubi.
  20. Quindi, posizionare i topi in una scatola di plexiglass trasparente su un rotatore con un leggero dondolio e riscaldarli usando una piastra riscaldante anfibia / rettile disponibile in commercio a temperatura controllata aderente al lato della scatola di contenimento. Fornire umidificazione anche sotto forma di contenitori sterili di acqua deionizzata agli angoli della scatola di contenimento (vedi Tabella dei materiali).
  21. A 30 minuti prima che l'isoflurano venga ritirato, somministrare ai topi la seconda dose di sollievo dal dolore (Buprenex, 0,1 mg/kg, i.p.).
  22. A seconda dell'esperimento, fornire ai topi un'infusione intraduodenale continua di glucosio-0,9% di soluzione salina ad una velocità di 0,3 ml / h per 1 ora.
    NOTA: La soluzione salina al 5% di glucosio-0,9% viene preparata utilizzando una sacca salina sterile (per uso umano, pH 7,4) della farmacia e una bottiglia sterile per uso umano di destrosio al 50%, seguendo rigide linee guida per la sterilità. La soluzione deve essere fatta fresca e scartata se superate le date di scadenza previste sulla sacca salina o sul flacone di destrosio.
  23. Somministrare ai topi uno dei lipidi elencati nella Tabella 1 come lipide sperimentale attraverso una cannula intraduodenale (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Per tutti i dati mostrati nella Figura 1, SMOFlipid (emulsione iniettabile lipidica al 20%, USP, vedere Tabella dei materiali) è stato infuso per via intraduodenale. Questa infusione sia pre che post-intraduodenale in bolo lipidico sostituisce il liquido perso che drena attraverso il dotto linfatico ed è un requisito assoluto. I topi sono ora pronti per essere infusi con una dose lipidica sperimentale.
  24. Eseguire la classica infusione lipidica di un bolo di emulsione lipidica da 0,3 mL (SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP) attraverso il tubo per infusione intraduodenale (vedere Tabella dei materiali).
  25. Dopo l'infusione in bolo di lipidi intraduodenali, riportare l'infusione al 5% di glucosio-0,9% di soluzione salina a 0,3 ml / h continuamente fino alla fine dell'esperimento.
  26. Raccogliere i campioni di linfa in provette da microcentrifuga pre-pesate per 60 minuti e mantenere la linfa sul ghiaccio. Pesare i tubi una seconda volta per stabilire il peso della linfa che viene secreta ogni periodo di 60 minuti.
    NOTA: Aspettatevi di raccogliere circa 50-300 μL di linfa all'ora, per topo nel ~6 h dopo un bolo lipidico di 0,3 ml.
  27. La linfa può fluire fino a 6 ore dopo l'infusione di lipidi. Al punto temporale di 6 ore, eutanasia i topi tramite isoflurano e lussazione cervicale.
    NOTA: Un chirurgo e/o un tecnico di laboratorio devono essere presenti per monitorare gli animali durante l'esperimento. Durante l'osservazione, fai attenzione ai coaguli nel drenaggio linfatico e ai cambiamenti nel comportamento animale che indicano dolore / angoscia. Se il dotto linfatico è ostruito in qualsiasi momento durante l'esperimento, l'esperimento viene terminato e l'animale viene eutanasia. L'animale può tecnicamente essere tenuto in vita fino a 24 ore dopo l'intervento chirurgico (secondo le regole della chirurgia di sopravvivenza IACUC). Tuttavia, i tassi di sopravvivenza diminuiscono nel tempo e 6 ore è un periodo di sopravvivenza riproducibile in cui l'assorbimento lipidico imita ancora la fisiologia in vivo e l'animale non sta lottando con la sopravvivenza.
  28. Eseguire la raccolta di tessuto terminale dopo l'eutanasia (fase 3.1).
    NOTA: La differenza nei profili di assorbimento dei lipidi alimentari nei topi tenuti per 6 ore o 24 ore dopo l'intervento chirurgico è stata recentemente testata44. Abbiamo scoperto che la procedura di 24 ore riduce i tassi di sopravvivenza degli animali e l'escursione dei lipidi alimentari nella linfa. Per questi motivi, consigliamo vivamente l'approccio 6-h. Questo design chirurgico aggiornato riduce la morte animale non necessaria e il potenziale di sofferenza degli animali nel periodo post-chirurgico. Ciò supporta uno dei principali obiettivi dell'American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, che è la "sostituzione, riduzione, raffinazione" degli animali [ref PMID: 21595115].

3. Raccolta del contenuto luminale e del tessuto mucoso

  1. Alla fine del periodo di infusione di lipidi di 6 ore, sacrificare i topi tramite isoflurano e lussazione cervicale. Legare entrambe le estremità dello stomaco, dell'intestino tenue e del cieco con punti di sutura 5-0 per evitare perdite del contenuto luminale.
  2. Raccogli lo stomaco, il cieco e il colon e posizionali in un tubo di vetro da 15 ml. Dividere l'intestino tenue in tre o quattro segmenti e raccogliere il contenuto luminale risciacquando il tessuto in 2-3 ml di PBS freddo dopo aver tagliato longitudinalmente.
  3. Rimuovere la mucosa intestinale che comprende le cellule epiteliali e la lamina propria associata dallo strato muscolare raschiando ogni sezione in 2-3 ml di PBS freddo con una pinzetta curva.
  4. Posizionare tutti i tessuti, gli isolati luminali e mucosi e lo strato muscolare in tubi di vetro e aggiungere 8 ml di 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH a ciascun tubo.
  5. Determinare la radioattività e/o le concentrazioni lipidiche mediante conteggio a scintillazione liquida e/o un kit di analisi dei trigliceridi (vedere Tabella dei materiali) dopo l'estrazione di Folch45.

4. Cromatografia su strato sottile (TLC)

  1. Estrarre i lipidi totali degli isolati luminali e mucosi mediante un'estrazione di Folch modificata45.
  2. Asciugare i lipidi estratti nel solvente sotto un evaporatore di azoto e quindi risospenderli in 2:1 vol/vol di CHCl3:MeOH prima di caricarli su una piastra di gel di silice TLC (vedi Tabella dei materiali).
  3. Separare i lipidi usando un sistema solvente di etere di petrolio, etere etilico e acido acetico glaciale (25:5:1 vol/vol/vol). Utilizzare il vapore di iodio per la visualizzazione di diversi lipidi, compresi gli standard.
  4. Raschiare le macchie sulla piastra TLC corrispondenti a monogliceridi / fosfolipidi, digliceridi, acidi grassi, trigliceridi ed estere di colesterolo in singoli flaconcini di scintillazione prima dell'aggiunta di 4 ml del liquido di scintillazione (vedere Tabella dei materiali) per il conteggio della scintillazione.
  5. Esprimere i dati come percentuale della dose lipidica totale in bolo o come frazione del lipide totale rilevato per ciascun campione.

5. Isolamento e caratterizzazione dei chilomicroni

  1. Trasferire i campioni linfatici combinati dal bolo post-lipidico di 6 ore (fase 2.29) a provette da ultracentrifuga, miscelati con NaCl allo 0,9% (300-500 μL), quindi riporre accuratamente con un volume appropriato di NaCl allo 0,87% (300-500 μL).
    1. Ultracentrifuga (vedi Tabella dei Materiali) i campioni a 110.000 x g a 4 °C per 16 ore. Raccogliere la frazione superiore contenente chilomicroni isolati e trasferirli in una nuova provetta da microcentrifuga.
  2. Determinare le concentrazioni di trigliceridi chilomicroni, colesterolo e apoB seguendo i passaggi seguenti.
    1. Determinare le concentrazioni di trigliceridi e colesterolo utilizzando un kit di analisi dei trigliceridi e del colesterolo (vedere la tabella dei materiali).
    2. In breve, incubare 2 μL dei campioni con 200 μL di reagente enzimatico a 37 °C per 5 minuti in una piastra da 96 pozzetti. Leggere la piastra utilizzando un lettore di piastre a 500 nm per i trigliceridi e 600 nm per il colesterolo.
      NOTA: Per il calcolo delle concentrazioni sono stati utilizzati standard e spazi vuoti. Le concentrazioni di ApoB sono state determinate utilizzando il kit ELISA ApoB del topo (vedi Tabella dei materiali).
  3. Determinare la dimensione delle particelle di chilomicrono.
    1. Utilizzare campioni di chilomicrone freschi a concentrazioni di trigliceridi di circa 40 mg / dL per l'imaging TEM. In breve, posizionare 5-10 μL di ciascun campione su una griglia TEM e asciugare.
    2. Esaminare la griglia con un microscopio elettronico a trasmissione e catturare immagini. Misurare le dimensioni delle particelle lipoproteiche e analizzarle utilizzando il software ImageJ (vedere Tabella dei materiali).

Risultati

La Figura 2 mostra la secrezione di trigliceridi nella linfa mesenterica e le portate linfatiche medie nei più recenti topi wild-type (WT) n = 17 sottoposti alla procedura di fistola linfatica di un giorno qui descritta. Come mostrato nella Figura 2A, la concentrazione di trigliceridi nella linfa aumenta in risposta a un bolo intraduodenale di 300 μL di SMOFLipid. La concentrazione di picco dei trigliceridi viene raggiunta a ~ 2-3 ore dopo il bolo e diminuisce costantemente durante il tempo di 6 ore (immediatamente prima dell'eutanasia). Parallelamente alla secrezione di trigliceridi, la velocità del flusso linfatico aumenta dall'infusione in bolo del Tempo 0 fino alla fine dell'esperimento (Figura 2B).

Questi risultati mostrano che l'impianto chirurgico sia del dotto linfatico mesenterico che della cannula intraduodenale si è verificato e sono rappresentativi di un controllo positivo a cui altri contenuti linfatici (ormoni, peptidi, nutrienti) potrebbero essere confrontati. Se non vi è alcun cambiamento nella concentrazione di trigliceridi nella linfa in risposta ai lipidi intraduodenali in bolo, questo segnala che l'intervento chirurgico ha causato danni significativi all'intestino tenue in modo che la capacità di assorbimento dei lipidi sia assente, o, in modelli genetici precedentemente non fenotipici, ciò suggerirebbe che il topo ha un difetto nell'assorbimento dei lipidi che è fisiologicamente significativo.

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Figura 1: Timeline proposta per il modello murino di fistola linfatica. T-4, T-3, T-2: il doppio incannulamento richiede circa 2-4 ore, seguito dal posizionamento dei topi nelle camere di recupero. T-1: Una volta che i topi sono nel periodo di recupero, ricevono un'infusione duodenale continua del 5% di glucosio-0,9% di soluzione salina. T0: l'infusione intraduodenale continua passa dal 5% di glucosio-0,9% di soluzione salina ad un'infusione di nutrienti sperimentali. T0-T6: I topi ricevono glucosio intraduodenale continuo al 5% in soluzione salina o, in alternativa, nutrienti continui. La linfa viene raccolta ogni ora durante questo periodo. Endpoint: i topi vengono eutanizzati e i tessuti possono essere raccolti. La figura è stata creata con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Concentrazione e portata dei trigliceridi linfatici mesenterici. I topi wild-type sono stati dotati di un tubo di alimentazione intraduodenale e di una cannula linfatica mesenterica. I topi hanno ricevuto un'infusione in bolo di 300 μL di lipidi. La linfa è stata raccolta per 6 ore in aliquote orarie e mantenuta sul ghiaccio. (A) Il contenuto di trigliceridi linfatici è stato determinato mediante un saggio chimico in ciascuna aliquota oraria di linfa. (B) Nelle 6 ore successive all'infusione in bolo, il flusso linfatico viene tracciato come grammi di linfa secreti all'ora. I punti sono mezzi ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Metodi di consegna dei lipidiRaccomandazioni/Istruzioni
Bolo di emulsione lipidica mistaÈ possibile utilizzare una dose di 0,3 ml di ( A ) Liposyn III 20% lipidi iniettabili o (B) SMOFlipid 20% emulsione iniettabile lipidica, USP, tramite tubo di infusione intraduodenale. Questi lipidi emulsionati sono utili perché non hanno bisogno di essere preparati in anticipo, sono liquidi a temperatura ambiente, sono sterili e perché contengono un mix "facilmente digeribile" di acidi grassi liberi, trigliceridi, fosfolipidi e taurocolato di sodio. Questa è una buona infusione iniziale per topi che possono avere insufficienze pancreatiche o biliari.
Bolo di trigliceridi0,3 ml di olio d'oliva riscaldato delicatamente (o trioleina purificata) come lipide neutro che riflette una dieta ricca di grassi insaturi, strutto (che riflette una dieta con alto contenuto di grassi saturi) o olio di cocco (che riflette una dieta con alto contenuto di trigliceridi a catena media) possono essere tutti somministrati mediante tubo per infusione intraduodenale o sonda orale. Se il trigliceride sperimentale è saturo, deve essere riscaldato per essere liquido a temperatura ambiente.
Bolo pasto misto0,3 mL Assicurarsi con la formulazione contenente 0,075 g di grassi (21,6%), 0,5 g di carboidrati (64,0%) e 0,1125 g di proteine (14,4%) e riflette un pasto misto a basso contenuto di grassi, può essere somministrato tramite infusione intra-duodenale.
Bolo lipidico radiomarcatoIl trioleato di glicerolo marcato con 5,0 μCi 3 H e/o il colesterolo C 1,0 μCi 14in 0,3ml di olio d'oliva possono essere somministrati tramite infusione intraduodenale. 14 C-colesterolo: Colesterolo-[4-14C] con attività specifica di 55Ci/mmol e concentrazione di 0,1mCi/ml. 3 Trioleina H-TG [9,10-3H(N)] (3H-TG) con attività specifica di 60Ci/mmol e concentrazione di 1mCi/mL
Dose continuaL'infusione di una qualsiasi delle formulazioni nutritive sperimentali di cui sopra ad una velocità di 0,3 ml / h (anziché 0,3 ml di bolo totale), si tradurrà in una produzione costante di trigliceridi nella linfa. Questo differisce da un'infusione in bolo, in cui la concentrazione di trigliceridi nei picchi linfatici a ~ 2-3 ore, e quindi ritorna alle concentrazioni basali a ~ 6-8 ore.

Tabella 1: Tabella delle infusioni lipidiche.

Discussione

La procedura originale di fistola linfatica di 2 giorni è stata descritta da Bollman et al.25 e praticata dal laboratorio di Patrick Tso negli ultimi 45 anni 26,27. Il protocollo qui presentato è una potente aggiunta a questo classico metodo gold standard per identificare, quantificare e comprendere le secrezioni chylous uniche dell'intestino tenue, nonché le dinamiche in vivo dell'assorbimento e del metabolismo dei nutrienti alimentari, degli ormoni intestinali e dell'immunità intestinale.

I vantaggi di questo modello includono (1) la capacità di campionare continuamente la linfa mesenterica durante il periodo di alimentazione e post-prandiale piuttosto che il campionamento statico in un punto temporale durante l'assorbimento, la digestione o la secrezione; (2) la misurazione degli ormoni intestinali e delle citochine direttamente nel loro compartimento fisiologico piuttosto che nel sangue, dove sono diluiti e degradati enzimaticamente17,44; (3) la capacità di isolare, quantificare e caratterizzare le lipoproteine secrete dall'intestino tenue in seguito all'ingestione di un pasto lipidico e l'assenza di lipasi endoteliali nella linfa mesenterica, che preserva le concentrazioni di trigliceridi chilomicroni e la struttura nativa del chilomicrone46,47; (4) la capacità di misurare direttamente la velocità di flusso linfatico, la produzione di trigliceridi e colesterolo (o altri composti infusi duodenali), la composizione del chilomicrone e le concentrazioni di ormoni intestinali. Infine, questo protocollo consente di raccogliere quantità relativamente grandi di >50 μL di linfa ogni ora per un periodo di 6 ore. Poiché il fluido viene reintegrato con soluzione salina intra-duodenale e infusione di glucosio, il modello di fistola linfatica è significativamente migliorato rispetto ad altre tecniche di campionamento linfatico e si traduce in pool fluidi piuttosto che statici di linfa mesenterica. Poiché il volume è un ostacolo importante per gli approcci lipidomici, proteomici e metabolomici, questo è un grande punto di forza.

Il protocollo per la fistola linfatica di topo di 1 giorno qui descritto presenta diversi vantaggi rispetto al protocollo originale per la fistola linfatica, inclusa una riduzione del numero totale di animali da esperimento rispetto ai protocolli di fistola linfatica 2 giorni precedentemente descritti26,27 a causa di un tasso di sopravvivenza più elevato dopo l'intervento chirurgico; una riduzione del tempo sperimentale complessivo da 2 giorni a un solo giorno; e, infine, una riduzione del periodo di recupero per i topi dalla notte (>18 ore), dove possono verificarsi dolore intenso o scarsi risultati post-chirurgici, a un periodo post-operatorio più gestibile ~ 6 ore.

Una caratteristica di questo protocollo di 1 giorno è l'attenzione alle considerazioni e agli endpoint umani. Questi devono avere la massima priorità: (1) gli animali devono ricevere liquidi di sostituzione intraduodenali o endovenosi; (2) devono essere mantenuti caldi e il più possibile indolori (con Buprenex post-operatorio e/o carprofene, a seconda del disegno sperimentale e della necessità di evitare effetti antinfiammatori); (3) Sanguinamento, tremore, diarrea o segni di sofferenza sono tutte ragioni convincenti per un endpoint umano. Secondo le rigide linee guida IACUC, l'isoflurano seguito da dislocazione cervicale è un buon endpoint. I tassi di sopravvivenza chirurgica sono ~ 70% per un singolo giorno (rispetto a ~ 40% per l'intervento chirurgico originale di 2 giorni), ma i ricercatori non dovrebbero esitare a terminare l'esperimento con un segno di angoscia. Questo dovrebbe essere preso in considerazione quando si pianifica il numero di animali.

In termini di risoluzione dei problemi di questa tecnica, il posizionamento di successo della cannula linfatica è il principale collo di bottiglia in questa procedura chirurgica. Durante la pratica dell'intervento chirurgico, aiuta a sonda il topo con 0,3 ml di olio d'oliva circa 2 ore prima dell'intervento. Ciò causerà la secrezione di chilomicroni nel dotto linfatico mesenterico, facendolo apparire "lattiginoso" e più visibile. Il blu di metilene può anche essere usato, ma è spesso meno evidente del dotto linfatico lattiginoso. Se dopo il posizionamento della cannula linfatica e il suo posizionamento con colla la linfa mesenterica scorre con successo attraverso la cannula in un recipiente di raccolta, allora si può procedere con il posizionamento di un tubo per infusione duodenale. Occasionalmente, la linfa potrebbe non fluire continuamente, ma potrebbe ricominciare a fluire quando l'animale viene posizionato sul tavolo rotante. Criticamente, fai attenzione ai coaguli all'interno del tubo linfatico. Questi dovrebbero essere massaggiati fuori dai tubi per evitare la pressione di riflusso sul dotto linfatico.

Oltre alla secrezione di trigliceridi e alla portata linfatica, questa tecnica può essere utilizzata per determinare le seguenti cinetiche di assorbimento lipidico e le caratteristiche del chilomicrone:

Secrezione di chilomicroni45,48,49
Immediatamente dopo un pasto contenente grassi, c'è un aumento transitorio dei trigliceridi plasmatici circolanti. Poiché i trigliceridi sono intrinsecamente idrofobici, devono prima essere emulsionati per essere solubili nel sangue50. Gli enterociti dell'intestino tenue svolgono questo ruolo e confezionano i trigliceridi dietetici in particelle di emulsione chilomicronica51. I chilomicroni contengono colesterolo e trigliceridi alimentari nel loro nucleo, circondati da fosfolipidi e apolipoproteine, tra cui apoB-48, apoA-I, apoA-IV e apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 è la proteina strutturale essenziale e le altre apolipoproteine hanno varie funzioni richieste per il metabolismo dei chilomicroni e la clearance dal sangue. Per determinare le caratteristiche chiave dei chilomicroni, incluso il loro contenuto di trigliceridi e apolipoproteine, deve essere utilizzata la tecnica della fistola linfatica di 1 giorno mostrata qui. Il tasso di secrezione di chilomicrone è la percentuale di 3H-trigliceridi infusi che viene secreta nella linfa e misurata per scintillazione contando campioni di linfa orari. Questo può essere combinato con la caratterizzazione dettagliata del chilomicrone 48,49,56,57,58. I campioni linfatici orari possono essere combinati o conservati separatamente. La linfa viene trasferita in tubi di ultracentrifuga, miscelata con 0,9% di NaCl e quindi accuratamente sovrapposta con 300-500 μL di 0,87% di NaCl. I campioni vengono quindi ultracentrifugati a 110.000 x g a 4 °C per 16 ore. Le frazioni superiori contenenti chilomicroni isolati vengono raccolte e testate per le concentrazioni di trigliceridi utilizzando il kit di analisi dei trigliceridi. In breve, 2 μL del chilomicrone (diluizione 1:10) vengono incubati con 200 μL di reagente enzimatico a temperatura ambiente per 10 minuti in una piastra da 96 pozzetti. La piastra viene letta da un lettore di piastre a 500 nm e gli standard e gli spazi vuoti vengono utilizzati per il calcolo delle concentrazioni di trigliceridi. La dimensione del chilomicrone può quindi essere determinata mediante colorazione negativa e microscopia elettronica a trasmissione (TEM)14,29. I trigliceridi e il colesterolo possono essere quantificati mediante dosaggio chimico e contenuto di apolipoproteine (apoB-48, A-I, C-II, C-III) mediante kit ELISA o Western blot.

Determinazione del sito primario di assorbimento lipidico 48,59
Isolando i compartimenti cellulari luminali ed epiteliali del duodeno, del digiuno e dell'ileo a 6 ore dopo l'infusione di 3 trigliceridi H o di un pasto misto radiomarcato, il contenuto viene estratto da Folch per determinare quanto dei 3trigliceridi H viene assorbito attraverso la membrana cellulare epiteliale (normale) o viene trattenuto nel lume (anormale) lungo la lunghezza dell'intestino tenue48 . Questi studi sono particolarmente importanti se ci sono potenziali differenze nella motilità gastrointestinale 60,61,62, se esiste un'ipotesi riguardante gli acidi biliari (altamente attivi durante l'assorbimento lipidico e essi stessi riassorbiti nell'ileo)63,64,65,66, o se c'è la preoccupazione che i nutrienti vengano assorbiti nella posizione anatomica sbagliata (ileo o anche colon)67 ,68,69,70.

Identificazione dei meccanismi del traffico di 3H-trigliceridi in cellule epiteliali assorbenti48
Questo viene eseguito calcolando la percentuale di 3 H-trigliceridi idrolizzati in 3 acidi grassi H-liberi nel lume intestinale, assorbiti nella mucosa e ri-esterificati in 3H-trigliceridi intracellulari prima della secrezione come chilomicroni. Questo è un potente marker di difetti di assorbimento / secrezione poiché può essere tracciato per mostrare il movimento del trigliceride dietetico nei suoi prodotti di degradazione e il successivo confezionamento in chilomicroni. L'espressione dell'mRNA del meccanismo di assorbimento degli acidi grassi (CD36, FABPs, ACSLs), della via di riesterificazione (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) e delle apolipoproteine (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) può essere ulteriormente quantificata mediante RT-PCR.

Le applicazioni future di questa tecnica sono limitate solo dall'interesse per la diafonia intestino-organo, il metabolismo, l'immunità, l'assorbimento dei nutrienti, i contaminanti dietetici ambientali o qualsiasi altra malattia con un ruolo nel sistema gastrointestinale. È probabile che molti esperimenti e ipotesi convincenti siano stati bloccati a causa della difficoltà di accedere al sistema linfatico mesenterico critico, e l'obiettivo di questo protocollo visualizzato è quello di rendere questa tecnica più facilmente disponibile. Isolare i chilomicroni e la linfa mesenterica in cui risiedono inizialmente è una parte fondamentale della comprensione del metabolismo di tutto il corpo; Il modello di fistola linfatica di topo 1 giorno è un potente modello fisiologico per lo studio di questi eventi.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo estremamente grati alla Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, ad ABK), alla Rainin Foundation (Synergy Award, a PI GJ Randolph e Co-I ABK) e al National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 ad ABK) per il loro sostegno a questi studi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, USP  sterileHospira, Lake Forest, IL, USNDC 0409-4888-06
Provette Eppendorf da 1,7 mLFisher Scientific, Waltham, MA, US7200184
14C-colesterolo: colesterolo-[4-14C] (0,1mCi/ mL)American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, USARC 0857
agoda 18 GBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti305199
2 Dumont pinze per micro-dissezioneStrumenti di scienza fine, Foster City, CA, Stati Uniti11251-35
2 pinzeROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, Stati UnitiRS-5130
3H-TAG:  Trioleina [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL)American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, USART0199
3H-TG Trioleina [9,10-3H(N)] (3H-TG)American Radiolabeled Chemicals, INC. St. LouisMO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterileHospira, Lake Forest, IL, USNDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: matrice di gel di silice Z265500-1PAKFisher Scientific, Waltham, MA, US11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep SwabstickFisher Scientific, Waltham, MA, US14-910-501
Scrub chirurgico BetadineDynarex Corp., Orangeburg, NY, US1201
Cannulacon taglio conicoBraintree Scientific.,  Braintree, MA, Stati UnitiMRE025
Buprenorfina HCl iniezione Carpuject PFS 0,3 mg/mL 10/Bx (Buprenex)HenrySchein, Warrendale, PA, Stati Uniti1278184
C57BL6/J topi maschiLaboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrepBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti260100
Kit di dosaggio del colesteroloFujiFilm Healthcare, Lexington, MA, Stati Uniti
Colesterolo-[4-14C]American Radiolabeled Chemicals, INC. St. LouisMO 63146
Scatola in plexiglass trasparente L43cm X W26 X H 21 con termoforo a temperatura controllata e umidificazioneil nostro design e le nostre modifiche
disponibili in commercio  pad riscaldante per anfibi/rettiliShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, CinaXHC-F035D
Applicatori con punta in cotoneFisher Scientific, Waltham, MA, US22363156
Tubo per infusione duodenale - canualaBraintree Scientific, Braintree , MA, USMRE037
EnsureAbbott Nutrition, Columbus, OH
Piattaforma chirurgica con pompa per acqua calda circolantePatterson Scientific, Waukesha, WI, USGaymar T/ Pompa Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1.000 unità/mL sterileMylan, Morgantown, WV, USNDC-67457-384-31
Image J SoftwareNational Institute of Health, Bethesda, Maryland,
forbici dell'irideROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5602
IsofluranePiramal Pharma Solutions, Riverview, MI, USNDC 66794-017-25
Apparecchio di induzione dell'isoflurano e apparecchio per anestesiaPatterson Scientific, Waukesha, WI, camera diinduzione del topo
colla Krazyprodotti di Elmer Inc., Columbus, OH, Stati UnitiKG484
Liposyn III 20% lipidico iniettabileHospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Contatore a scintillazione multiusoBeckman Coulter, Brea, CA
Forbici a molla per micro-dissezioneROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5602
Kit ELISA apoB per topiABCAM Inc., Waltham, MA, USab230932-1
Porta aghiStrumenti per scienze fini, Foster City, CA, US12002-12
DivaricatoriKent Scientific Co., Torrington, CT, USSURGI-5001
Rimadyl (Carprofen)Zoetis Inc., Kalamazoo MI, Stati Uniti4019449
Tavola rotante Barnstead ThermolyneLabquake, Zü ricco, SvizzeraBarnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% emulsione iniettabile di lipidi, USPFresenius Kabi, Warrendale, PA, USNDC-63323-820-01
SnuggleLomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Î le-Perrot, QC J7V 7M4, CanadaMS 02.5PM
Forbici chirurgicheROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5912SC
Sutura (5-0 seta con ago)DemeTECH, Miami Lakes, FL, USDT-719
Microscopio elettronico a trasmissione (JEOL 1400-FLASH 120KV)JEOL, Peabody, MA
Kit per il dosaggio dei trigliceridiRandox Laboratories, Crumlin, Regno UnitoTR210
ULTIMA GOLD XR Fluido a scintillazionePerkin Elmer, Hebron, KY, US6013119
Ultracentrifuga, rotore S100AT4-497SORVALL RC M120 GX
Jackson 99902601 degli Stati Uniti

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