Qui, viene sviluppato un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per fornire una membrana sintetica con una curvatura definita che consente la caratterizzazione di proteine con capacità di rilevamento della curvatura in vitro.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La curvatura della membrana svolge un ruolo importante in vari processi essenziali delle cellule, come la migrazione cellulare, la divisione cellulare e il traffico di vescicole. Non solo è generato passivamente dalle attività cellulari, ma regola anche attivamente le interazioni proteiche ed è coinvolto in molte segnalazioni intracellulari. Pertanto, è di grande valore esaminare il ruolo della curvatura della membrana nella regolazione della distribuzione e della dinamica delle proteine e dei lipidi. Recentemente, molte tecniche sono state sviluppate per studiare la relazione tra la membrana curva e la proteina in vitro. Rispetto alle tecniche tradizionali, il nuovo nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offre sia un throughput elevato che una migliore precisione nella generazione della curvatura della membrana formando un doppio strato lipidico continuo su matrici modellate di nanobar con una curvatura di membrana predefinita e un controllo piatto locale. Sia la fluidità lipidica che la sensibilità proteica alle membrane curve possono essere caratterizzate quantitativamente utilizzando l'imaging al microscopio a fluorescenza. Qui viene introdotta una procedura dettagliata su come formare un SLB su superfici di vetro fabbricate contenenti array di nanobar e la caratterizzazione delle proteine sensibili alla curvatura su tale SLB. Inoltre, sono coperti i protocolli per il riutilizzo dei nanochip e l'elaborazione delle immagini. Oltre al nanobar-SLB, questo protocollo è facilmente applicabile a tutti i tipi di chip di vetro nanostrutturati per studi di rilevamento della curvatura.
Introduzione
La curvatura della membrana è un parametro fisico critico di una cellula che si verifica in una varietà di processi cellulari come la morfogenesi, la divisione cellulare e la migrazione cellulare1. È ampiamente riconosciuto ora che la curvatura della membrana è al di là di un semplice risultato di eventi cellulari; Invece, è emerso come un efficace regolatore delle interazioni proteiche e della segnalazione intracellulare. Ad esempio, è stato scoperto che diverse proteine coinvolte nell'endocitosi mediata da clatrina si legano preferenzialmente alla membrana curva, con conseguente formazione di un hotspot per l'endocitosi2
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Pulizia del nanochip
- Posizionare il nanochip in un becher da 10 mL con il lato modellato rivolto verso l'alto.
NOTA: Questo nanochip di quarzo è stato fabbricato mediante litografia a fascio di elettroni come descritto prima21. La geometria e la disposizione della nanostruttura sul chip possono essere progettate su misura. Le dimensioni delle nanobarre di gradiente utilizzate qui sono 2000 nm di lunghezza, 600 nm di altezza e da 100 a 1000 nm di larghezza (100 nm step-set). - Aggiungere con cautela 1 mL di acido solforico al 98% al becher e assicurarsi che l'acido copra completamente la parte an....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il design Nanobar è raccomandato per sondare le proteine sensibili alla curvatura positiva, che contiene un semicerchio a ciascuna estremità con curvatura definita dalla larghezza della nanobarra e un controllo della curvatura piatta / zero localmente al centro (Figura 2A, B). La formazione riuscita dell'SLB sui nanobar si traduce in segnali di marcatori lipidici uniformemente distribuiti su tutta la superficie dei nanobar, come mostrato nella Figura 2C<.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il sistema nanobar-SLB qui descritto offre una combinazione unica dei vantaggi in diversi saggi in vitro esistenti. Rivela in modo efficiente il legame preferenziale delle proteine a membrane altamente curve come il test di galleggiamento o sedimentazione dei liposomi, ma richiede molti meno campioni e offre una curvatura definita con maggiore precisione su singole nanobarre 8,29. Offre inoltre una vasta gamma di curvature controllate con precisione per .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente in quest'opera.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) e il Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) della Nanyang Technological University (NTU) per aver supportato la fabbricazione di nanostrutture e l'imaging SEM, la Protein Production Platform (PPP) presso la School of Biological Sciences NTU per la purificazione delle proteine e la School of Chemical and Biomedical Engineering NTU per il microscopio confocale. Questo lavoro è finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 e MOE-T2EP30220-0009), dall'Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) supportato dal finanziamento MOE nell'ambito ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Etanolo anidro | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| foglio di alluminio | Diamante | RN0879999FU | |
| Fiala d'ambra | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Cervello PS: L-&alfa;-fosfatidilserina (cervello, suino) (sale sodico) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| 10 ml Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | Il secondo contenitore |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich V800117 | ||
| Cotton fioc | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-ammino-1-carbossipentil)acido iminodiacetico)succinil] (sale di nichel) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Uovo PC: L-&alfa;-fosfatidilcolina (uovo, pollo) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Piattaforma per la produzione di proteine F-BAR, Scuola di Scienze Biologiche, Nanyang Technological University, Singapore | peptidi | ||
| , Scuola di Scienze Biologiche, Nanyang Technological University, Singapore | Proteine e peptide | ||
| GFP | Piattaforma per la produzione di proteine, Scuola di Scienze Biologiche, Nanyang Technological University, Singapore | Proteine e peptide | |
| GFP-His | Piattaforma per la produzione di proteine, Scuola di Scienze Biologiche, Nanyang Technological University, Singapore | Proteine e peptidi | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Perossido di idrogeno, 30% (certificato ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR da FBP17 umano | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Microscopia confocale a scansione laser | Zeiss | LSM 800 con obiettivo olio Airyscan | 100x (N.A.1.4). |
| Metanolo | Fisher scientifico | 10010240 | |
| Mini-estrusore | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1,5 mL Microprovette | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Membrana Nucleofila Nuclepore,0,1 μ m | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polidimetilsilossano (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polidimetilsilossano (PDMS) Reticolante | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Detergente al plasma | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Nanochip di quarzo | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Acido solforico | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | ||
| Pinzetta | Gooi | PDC-002-HP | |
| Pulitori ad ultrasuoni | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Essiccatore sottovuoto | NUCERITE | 5312 | |
| Bagno d'acqua | Julabo | TW8 |
Riferimenti
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Che....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
