Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Xinwen Miao; Jiawei Wu; Wenting Zhao

doi:10.3791/64340

Articolo metodologico

Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

DOI:

10.3791/64340

⸱

30 novembre 2022

Xinwen Miao^*¹ , Jiawei Wu^*¹^,² , Wenting Zhao¹^,³

¹School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, ²State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, ³Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, viene sviluppato un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per fornire una membrana sintetica con una curvatura definita che consente la caratterizzazione di proteine con capacità di rilevamento della curvatura in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La curvatura della membrana svolge un ruolo importante in vari processi essenziali delle cellule, come la migrazione cellulare, la divisione cellulare e il traffico di vescicole. Non solo è generato passivamente dalle attività cellulari, ma regola anche attivamente le interazioni proteiche ed è coinvolto in molte segnalazioni intracellulari. Pertanto, è di grande valore esaminare il ruolo della curvatura della membrana nella regolazione della distribuzione e della dinamica delle proteine e dei lipidi. Recentemente, molte tecniche sono state sviluppate per studiare la relazione tra la membrana curva e la proteina in vitro. Rispetto alle tecniche tradizionali, il nuovo nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offre sia un throughput elevato che una migliore precisione nella generazione della curvatura della membrana formando un doppio strato lipidico continuo su matrici modellate di nanobar con una curvatura di membrana predefinita e un controllo piatto locale. Sia la fluidità lipidica che la sensibilità proteica alle membrane curve possono essere caratterizzate quantitativamente utilizzando l'imaging al microscopio a fluorescenza. Qui viene introdotta una procedura dettagliata su come formare un SLB su superfici di vetro fabbricate contenenti array di nanobar e la caratterizzazione delle proteine sensibili alla curvatura su tale SLB. Inoltre, sono coperti i protocolli per il riutilizzo dei nanochip e l'elaborazione delle immagini. Oltre al nanobar-SLB, questo protocollo è facilmente applicabile a tutti i tipi di chip di vetro nanostrutturati per studi di rilevamento della curvatura.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La curvatura della membrana è un parametro fisico critico di una cellula che si verifica in una varietà di processi cellulari come la morfogenesi, la divisione cellulare e la migrazione cellulare¹. È ampiamente riconosciuto ora che la curvatura della membrana è al di là di un semplice risultato di eventi cellulari; Invece, è emerso come un efficace regolatore delle interazioni proteiche e della segnalazione intracellulare. Ad esempio, è stato scoperto che diverse proteine coinvolte nell'endocitosi mediata da clatrina si legano preferenzialmente alla membrana curva, con conseguente formazione di un hotspot per l'endocitosi²

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pulizia del nanochip

Posizionare il nanochip in un becher da 10 mL con il lato modellato rivolto verso l'alto.
NOTA: Questo nanochip di quarzo è stato fabbricato mediante litografia a fascio di elettroni come descritto prima²¹. La geometria e la disposizione della nanostruttura sul chip possono essere progettate su misura. Le dimensioni delle nanobarre di gradiente utilizzate qui sono 2000 nm di lunghezza, 600 nm di altezza e da 100 a 1000 nm di larghezza (100 nm step-set).
Aggiungere con cautela 1 mL di acido solforico al 98% al becher e assicurarsi che l'acido copra completamente la parte an....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il design Nanobar è raccomandato per sondare le proteine sensibili alla curvatura positiva, che contiene un semicerchio a ciascuna estremità con curvatura definita dalla larghezza della nanobarra e un controllo della curvatura piatta / zero localmente al centro (Figura 2A, B). La formazione riuscita dell'SLB sui nanobar si traduce in segnali di marcatori lipidici uniformemente distribuiti su tutta la superficie dei nanobar, come mostrato nella Figura 2C<.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sistema nanobar-SLB qui descritto offre una combinazione unica dei vantaggi in diversi saggi in vitro esistenti. Rivela in modo efficiente il legame preferenziale delle proteine a membrane altamente curve come il test di galleggiamento o sedimentazione dei liposomi, ma richiede molti meno campioni e offre una curvatura definita con maggiore precisione su singole nanobarre ^8,29. Offre inoltre una vasta gamma di curvature controllate con precisione per .......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente in quest'opera.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) e il Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) della Nanyang Technological University (NTU) per aver supportato la fabbricazione di nanostrutture e l'imaging SEM, la Protein Production Platform (PPP) presso la School of Biological Sciences NTU per la purificazione delle proteine e la School of Chemical and Biomedical Engineering NTU per il microscopio confocale. Questo lavoro è finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 e MOE-T2EP30220-0009), dall'Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) supportato dal finanziamento MOE nell'ambito ....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo anidro	Sigma-Aldrich	100983
foglio di alluminio	Diamante	RN0879999FU
Fiala d'ambra	Sigma-Aldrich	27115-U
Cervello PS: L-&alfa;-fosfatidilserina (cervello, suino) (sale sodico)	Avanti Polar Lipids, Inc.
10 ml Beaker	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211065408	Il secondo contenitore
Cloroformio	Sigma-Aldrich V800117
Cotton fioc	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-ammino-1-carbossipentil)acido iminodiacetico)succinil] (sale di nichel)	Avanti Polar Lipids, Inc.
Uovo PC: L-&alfa;-fosfatidilcolina (uovo, pollo)	Avanti Polar Lipids, Inc.
Piattaforma per la produzione di proteine F-BAR, Scuola di Scienze Biologiche, Nanyang Technological University, Singapore			peptidi
	, Scuola di Scienze Biologiche, Nanyang Technological University, Singapore		Proteine e peptide
GFP	Piattaforma per la produzione di proteine, Scuola di Scienze Biologiche, Nanyang Technological University, Singapore		Proteine e peptide
GFP-His	Piattaforma per la produzione di proteine, Scuola di Scienze Biologiche, Nanyang Technological University, Singapore		Proteine e peptidi
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Perossido di idrogeno, 30% (certificato ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR da FBP17 umano	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Microscopia confocale a scansione laser	Zeiss	LSM 800 con obiettivo olio Airyscan	100x (N.A.1.4).
Metanolo	Fisher scientifico	10010240
Mini-estrusore	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1,5 mL Microprovette	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Membrana Nucleofila Nuclepore,0,1 μ m	Whatman	800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polidimetilsilossano (PDMS) Base	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polidimetilsilossano (PDMS) Reticolante	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Detergente al plasma	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Nanochip di quarzo	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	795429
Acido solforico	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt	Life Technologies Holdings Pte Ltd.
Pinzetta	Gooi	PDC-002-HP
Pulitori ad ultrasuoni	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Essiccatore sottovuoto	NUCERITE	5312
Bagno d'acqua	Julabo	TW8

840032790404840051 Piattaforma per la produzione di proteine di proteine F-BAR+IDR per proteine e T1395MP

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Array di nanobarre Saggio FRAP Microscopia confocale Legame proteico Mobilit lipidica Camera in PDMS

Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

In questo articolo

Sommario

Abstract

Introduzione

Protocollo

Risultati

Discussione

Dichiarazioni

Ringraziamenti

Materiali

Ristampe e permessi

Tag

Articoli correlati