Quantificazione e analisi basate sulla citometria a flusso delle cellule B miocardiche

Sommario

Qui riportiamo un protocollo per la quantificazione e la differenziazione dei linfociti B miocardici in base alla loro posizione nello spazio intravascolare o endoteliale utilizzando la citometria a flusso.

Abstract

Un numero crescente di prove dimostra che i linfociti B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e dell'adattamento miocardico alle lesioni. Tuttavia, la letteratura riporta dati contrastanti sulla prevalenza delle cellule B del miocardio. È stato riportato che le cellule B sono tra le cellule immunitarie più diffuse nel cuore dei roditori o per essere presenti, ma con una prevalenza marcatamente inferiore rispetto alle cellule mieloidi, o per essere piuttosto rare. Allo stesso modo, diversi gruppi hanno descritto che il numero di cellule B miocardiche aumenta dopo il danno miocardico ischemico acuto, ma un gruppo non ha riportato cambiamenti nel numero di cellule B del miocardio danneggiato. L'implementazione di un metodo condiviso e riproducibile per valutare la prevalenza delle cellule B miocardiche è fondamentale per armonizzare le osservazioni di diversi gruppi di ricerca e quindi promuovere l'avanzamento dello studio delle interazioni miocardiche a cellule B. Sulla base della nostra esperienza, le osservazioni apparentemente contrastanti riportate in letteratura derivano probabilmente dal fatto che le cellule B miocardiche murine sono per lo più intravascolari e collegate all'endotelio microvascolare. Pertanto, il numero di cellule B recuperate da un cuore murino è squisitamente sensibile alle condizioni di perfusione utilizzate per pulire l'organo e al metodo di digestione utilizzato. Qui riportiamo un protocollo ottimizzato che tiene conto di queste due variabili critiche in modo specifico. Questo protocollo consente l'analisi riproducibile basata sulla citometria a flusso del numero di cellule B miocardiche murine e consente ai ricercatori di distinguere le cellule B miocardiche extravascolari da quelle intravascolari.

Introduzione

I linfociti B sono cellule immunitarie altamente specializzate che svolgono un ruolo importante nelle risposte immunitarie adattative e innate¹. Ci sono due popolazioni principali di cellule B: una popolazione più piccola di cellule B1 che sono per lo più prodotte durante la vita embrionale e una popolazione preponderante di cellule B2 che vengono prodotte nella vita adulta nel midollo osseo¹. Dopo la maturazione nel midollo osseo, le cellule B migrano verso gli organi linfoidi primari e secondari. Da lì ricircolano continuamente tra gli organi linfoidi che viaggiano attraverso i vasi sanguigni e i vasi linfatici

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti con l'approvazione della IACUC presso la Johns Hopkins University School of Medicine.

1. Preparativi

1. Preparare il buffer FACS, come descritto nella tabella 1.
2. Assicurati che ci sia abbastanza CO₂ per l'eutanasia degli animali.
3. Preparare lo spazio di dissezione (posizionare il cuscinetto da banco e posizionare il nastro e gli strumenti di dissezione nelle vicinanze).
4. Etichettare i tubi da 15 ml, mettere 3 ml di HBSS con calcio e magnesio in ogni provetta (vedere Tabella dei mat....

Risultati

Una volta completata l'acquisizione e raccolti tutti gli eventi, i dati devono essere analizzati secondo la pratica standard della citometria a flusso. Il focus dell'analisi varierà a seconda dell'obiettivo individuale di ciascun esperimento. In questo caso, è stata perseguita la quantificazione delle cellule B intravascolari ed extravascolari ed è stata espressa come numero di cellule per mg di tessuto.

Quando si utilizza un citometro spettrale, si consiglia di iniziare l'analisi con un gatin.......

Discussione

Un numero crescente di evidenze indica che le cellule B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e del rimodellamento/adattamento miocardico alle lesioni 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometria a flusso è uno strumento eccellente pe.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alexa Fluor 700 anti-topo/umano CD11b Anticorpo	101222	BioLegend	100 &; g 200 µ L
(CellTreat 29481) Filtro cellulare, 40 &; micro; m, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0,5 mL Naturale Microcentrifuga Tubo	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0,9% Cloruro di sodio Iniezione, USP	114-055-101	Qualità Biologico	0,90%
1,5 mL Naturale Microcentrifuga Tubo	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µ L Puntali con filtro Tips GraduateOne	11213810	USA Scientific
1000 µ Puntali filtranti TipOne graduati	L 11267810	USA Scientific
da 15 mL, tappo di chiusura, polipropilene, 430052 senza RNasi/DNasi		Corning
a 1 via, policarbonato	SVPT951	produzione ECT
2,2,2-tribromoetanolo	T48402	Sigma-Aldrich
200 &; L Puntali con filtro graduato TipOne	11208810	valvola
, policarbonato	SVPT953	produzione ECT
Provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL, 12 x 75 mm stile	352054	Corning Brand
, tappo di chiusura, polipropilene, senza RNasi/DNasi	430290	Corning
ACK ( Tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio)	118-156-101	Qualità	Osmolalità biologica: 290 + o -5% mOsm/Kg Adattatore H20
4x50ml, per secchio rettangolare da 250 mL in rotore A-4-63	5810759005	Adattatore Eppendorf
per provette da centrifuga da 15 mL, 9 provette per adattatore, fondo conico per l'uso con il rotore modello A-4-62	22638289	Eppendorf
Adattatore per 15 tubi a fondo tondo 2.6 – 7 mL, per secchio rettangolare da 250 mL in rotore A-4-62	22638246	Eppendorf
Foglio di alluminio 12 pollici x 75' Rotolo .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Camera di induzione per anestesia - Topo	RWD-AICMV-100
con ago collegato 25 G x 5/8 pollici, sterile, monouso, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Siringhe per insulina ultrafini Brandzig 29G 1cc 1/2" Confezione da 100	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-topo CD19	Anticorpo 115537	BioLegend	50 &; g/mL
TAPPI per tubi di flusso con filtro mesh 35 e micro; m, Doppia posizione per provette da 12 x 75 mm, sterili	T9009	Southern Labware
Anidride carbonica USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Bicchiere a forma bassa, vetro, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Collagenase 2	LS004176	Sigma-Aldrich
Connettore ottone cromato 1/4" NPT femmina x 1/4" barbiglio	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Citometro		a flusso Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipplo 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I - 40.000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet  3 - Pipettatore elettronico	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuga	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus pipette		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, Ice Pan a tripla densità (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Emostatici Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly, Dritto	13018-14	Fine Science Tools
Siringa Luer Slip sterile, monouso, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderato	4033- CS150	McKesson
Navigator Bilancia portatile multiuso	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7,4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-topo/umano CD45R/B220 Anticorpo	103208	BioLegend	200 &; g/mL
Anticorpo CD45 anti-topo PerCP/Cyanine5.5	103132	BioLegend	100 µ g 500 uL
Piastra di Petri, impilabile 35 mm x 10 mm Polistirene sterile	FB0875711YZ	Fisher Scientific Pkgd
: Diss 1080 Dado/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Potente illuminatore a doppio collo d'oca LED da 6 Watt	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Ago 25 G x 5/8 (0,5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Clone purificato di ratto anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0,5 mg/mL
R 4.1.1		The R
Foundation Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regolatore analitico a due stadi 0-25 psi erogazione CGA320 ingresso 3500 psi	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 secchi rettangolari da 250 mL	Rotor A-4-62	Eppendorf
Pipetta sierologica, tappata, 10 mL, sterile, apirogena/priva di endotossine, non citotossica, 1 pezzo(i)/blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma nastro per etichette	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Raccordo, PP, dritto, maschio Luer Lock x 1/8" portagomma; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, misura S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" parete x 50' di lunghezza	CG-730-003	Excelon Laboratory
Siringa PP/PE senza ago, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Pompa siringa	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas Timer di allarme a 3 canali TM10500	9371W13	Thomas Scientific
Tube Rack, 12  posizioni, 6 per 5.0  mL e 15  provette da ml e 6 per 25  mL e 50  provette mL, polipropilene, posizioni numerate, autoclavabili	30119835	Eppendorf
Tube Rack, 12  posizioni, per 5.0  mL e 15  Provette mL, polipropilene, posizioni numerate, autoclavabili	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Tubo da laboratorio, diametro interno & D.E. 1/4 poll. &volte; 3/8 poll.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
Pinza da dissezione VWR con perno guida con punte curve	89259-946	Avantor, da VWR
Forbici da dissezione VWR, punta affilata, 4½ "	82027-578	Avantor, di VWR
VWR Agitatore orbitale a incubazione, modello 3500I	12620-946	Avantor, di VWR
Zombie Aqua Kit di vitalità fissabile	423102	BioLegend

provetta da centrifuga Valvola di arresto di arresto a 3 vie USA Scientific Falcon, una provetta da centrifuga da 50 mL Siringa con punta a slittamento BD Luer Conduct Science variabili a 1 canale