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Articolo metodologico

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

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DOI:

10.3791/64360

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20 gennaio 2023

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1Central Laboratory of Women’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 3Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento rapido e specifico per le dimensioni delle piccole vescicole extracellulari ottimizzando le dimensioni dell'ugello di nebulizzazione dell'aria, la pressione del fluido della guaina, la pressione del flusso del campione, la tensione, il guadagno e i parametri di soglia di attivazione.

Abstract

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) possono essere rilasciate da tutti i tipi di cellule e trasportare proteine, DNA e RNA. Le molecole di segnalazione servono come indicatori dello stato fisiologico e patologico di una cellula. Tuttavia, non esiste un metodo standard per l'isolamento di sEV, che impedisce l'identificazione dei biomarcatori a valle e gli studi di intervento farmacologico. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la purificazione di 50-200 nm sEV da parte di una selezionatrice di celle a flusso. Per questo, sono stati selezionati un ugello da 50 μm e una pressione del fluido della guaina da 80 psi per ottenere una buona velocità di selezione e un flusso laterale stabile. Sono state utilizzate microsfere di polistirene di dimensioni standard per localizzare popolazioni di particelle di 100, 200 e 300 nm. Con un'ulteriore ottimizzazione della soglia di attivazione di tensione, guadagno e diffusione diretta (FSC), il segnale sEV potrebbe essere separato dal rumore di fondo. Queste ottimizzazioni forniscono un pannello di impostazioni di ordinamento critiche che consente di ottenere una popolazione rappresentativa di sEV utilizzando solo FSC vs. side scatter (SSC). Il metodo di isolamento basato sulla citometria a flusso non solo consente l'analisi ad alto rendimento, ma consente anche la classificazione sincrona o l'analisi del proteoma di sEV in base all'espressione del biomarcatore, aprendo numerose applicazioni di ricerca a valle.

Introduzione

Una cellula rilascia vescicole extracellulari (EV) di varie dimensioni che si traducono in molecole di segnalazione e inclusioni di membrana, che sono importanti per la comunicazione intercellulare1. Anche le EV di diverse dimensioni svolgono ruoli biologici diversi, con 50-200 nm sEV in grado di distribuire con precisione RNA, DNA e proteine nella corretta posizione extracellulare. Il sEV aiuta anche a determinare i loro meccanismi di secrezione, coinvolgendo non solo la regolazione dei normali processi fisiologici come la sorveglianza immunitaria, il mantenimento delle cellule staminali, la coagulazione del sangue e la riparazione dei tessuti, ma anche la patologia alla base di diverse malattie come la progressione del tumore e le metastasi 2,3. Un isolamento e un'analisi efficaci della sEV sono fondamentali per identificare i biomarcatori e progettare futuri interventi farmacologici.

Con la continua ricerca sull'applicazione clinica di sEV, i metodi di isolamento di sEV hanno avanzato requisiti più elevati. A causa dell'eterogeneità di sEV in termini di dimensioni, fonte e contenuto, nonché della loro somiglianza con altri EV nelle proprietà fisico-chimiche e biochimiche, non esiste un metodo standard per l'isolamento di sEV 4,5. Attualmente, l'ultracentrifugazione, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), la precipitazione polimerica e la cattura per immunoaffinità sono i metodi di isolamento sEV più comuni6. L'ultracentrifugazione è ancora il gold standard per l'isolamento di sEV nella ricerca, nonostante richieda molto tempo, con conseguente bassa purezza con un'ampia distribuzione dimensionale di 40-500 nm e danni meccanici significativi al sEV dopo centrifugazione a lungo termine 7,8,9. La precipitazione polimerica, che di solito utilizza glicole polietilenico (PEG), soffre di purezza inaccettabile per la successiva analisi funzionale con concomitante precipitazione di aggregati proteici extracellulari e contaminazione polimerica10,11. I metodi basati sulla cattura dell'immunoaffinità richiedono anticorpi ad alto costo con specificità variabile, oltre ad avere problemi con bassi volumi di elaborazione e rese12,13,14. La dimensione delle particelle è uno dei principali indicatori per valutare la purezza del sEV isolato. Sebbene la purezza di sEV rimanga un obiettivo irraggiungibile, SEC rimuove una notevole quantità di componenti medi e le particelle sEV estratte con il metodo SEC sono principalmente nell'intervallo 50-200 nm15. Le tecniche esistenti presentano alcuni svantaggi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la lunga durata, la bassa purezza, la bassa resa, la scarsa riproducibilità, la bassa produttività dei campioni e il potenziale danno della sEV, che la rende incompatibile con l'utilizzo clinico16. Pertanto, un metodo di isolamento sEV rapido, economico e dimensionale applicabile a diversi biofluidi è una necessità essenziale in diverse situazioni di ricerca e cliniche.

Nella citometria a flusso, le singole particelle vengono analizzate in modo multiparametrico ad alto rendimento e i sottoinsiemi vengono selezionati17. A causa dell'eterogeneità delle EV, sarebbe ideale una misurazione citometrica a flusso di particelle singole, che è stata utilizzata per studiare le EV seguendo i paradigmi dell'analisi cellulare, con etichette di dispersione della luce e fluorescenza utilizzate per identificare le caratteristiche correlate alla fisiologia e i componenti proteici18,19,20. Tuttavia, la citometria a flusso convenzionale è messa alla prova dalle piccole dimensioni di sEV e dalla bassa abbondanza di biomarcatori di superficie. La sensibilità della citometria a flusso potrebbe essere migliorata ottimizzando i parametri di rilevamento per distinguere il rumore di fondo e il sEV indipendentemente dall'utilizzo di scatter in avanti (FSC), dispersione laterale (SSC) o parametro di attivazione della soglia di fluorescenza19.

Con il presente protocollo, le impostazioni di ordinamento citometrico a flusso ad alta risoluzione sono state ottimizzate utilizzando sfere fluorescenti come standard. Selezionando la dimensione corretta dell'ugello, la pressione del fluido della guaina, il parametro di attivazione della soglia e le tensioni che controllano le intensità della luce diffusa, siamo stati in grado di isolare un sottoinsieme specifico di sEV da una miscela complessa.

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Protocollo

1. Coltura cellulare

  1. Preparare un terreno di coltura di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Coltura della cellula tumorale pancreatica umana, PANC-1, in un matraccio di coltura di 75 cm2 ad una densità di 1 x 106 cellule/ml. Incubare la coltura a 37 °C con il 5% di CO2.
  2. Subcoltura delle cellule quando la densità cellulare raggiunge il 75% -80% sotto osservazione microscopica. Rimuovere il mezzo e risciacquare 2 volte con 3-5 ml di tampone fosfato salino (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
  3. Scartare la soluzione, aggiungere 1-2 ml di soluzione di tripsina-EDTA e lasciare che le cellule si stacchino fino a quando non diventano arrotondate e sospese nel mezzo al microscopio. Aggiungere il terreno fresco, aspirare e disperdere in palloni di coltura da 75 cm2 con 15 mL di terreno di coltura. Utilizzare un rapporto di sub-coltivazione da 1:2 a 1:4 (consigliato).
    NOTA: Tutte le operazioni vengono eseguite in un armadio di biosicurezza per evitare la contaminazione cellulare.

2. Raccolta del mezzo culturale

  1. Incubare le cellule per 48 ore a 37 °C con il 5% di CO2. Raccogliere il surnatante cellulare (90 mL) in due provette da centrifuga da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C.
  2. Trasferire il surnatante in nuove provette sterili e centrifugare successivamente a 2.000 x g per 20 min, 10.000 x g per 30 minuti e 12.000 x g per 70 min a 4 °C.
  3. Rimuovere il surnatante e sciacquare il pellet con 10 ml di PBS pipettando delicatamente. Centrifugare a 12.000 x g per 70 minuti a 4 °C e risospendere il pellet in 10 mL di tampone PBS per ottenere una miscela di EV.
  4. Eseguire l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per quantificare e dimensionare la miscela EV. Eseguire l'analisi NTA secondo il manuale di riferimento per il funzionamento dello strumento e il riferimento21.

3. Ordinamento delle celle

  1. Eseguire la procedura di avvio standard dello smistatore di celle di flusso. Accendere la macchina premendo il pulsante Avvio. Fare clic sul pulsante di accensione laser sul pannello di controllo laser. Premere il pulsante Cambia serbatoi nel sottomenu campionatore intelligente per pressurizzare la fluidica.
    NOTA: assicurarsi che il serbatoio dei rifiuti sia vuoto e che il serbatoio della guaina sia pieno prima dell'avvio.
  2. Utilizzare un ugello jet-in-air da 50 μm pulito ad ultrasuoni e installarlo sul gruppo ugello. Regolare la pressione a 80 psi per il fluido della guaina e 80,3 psi per il flusso del campione sulla console di pressione.
  3. Premere il pulsante Start Sheath Flow (Avvia flusso guaina) per avviare il flusso della guaina. Fare clic sul pulsante Bolla nel sottomenu campionatore intelligente per disattivare automaticamente la bolla per 10 minuti, quindi disattivarla.
    NOTA: Per la selezione delle celle, diverse dimensioni degli ugelli di nebulizzazione dell'aria richiedono diverse pressioni del fluido della guaina per mantenere la stabilità del flusso del liquido. In questo metodo, è stato utilizzato un ugello di 50 μm e solo una pressione del fluido della guaina maggiore o uguale a 80 psi potrebbe generare flussi laterali stabili. La differenza di pressione tra il flusso del campione e il fluido della guaina determina la velocità di carico dello smistamento. Nella condizione di impostazione del metodo (la differenza di pressione tra il flusso del campione e il fluido della guaina è 0,3-0,6 psi), il flusso del liquido era relativamente stabile e la velocità di caricamento consentiva di aumentare l'efficienza di selezione all'80% dal 50% per una differenza di pressione inferiore a 0,3-0,6 psi.
  4. Allineare il flusso e determinare lo spot laser. Accendere la luce della camera di illuminazione per visualizzare il flusso sopra i fori. Regola i micrometri su e giù, sinistra e destra e fronte e dietro per centrare il flusso sul foro stenopeico e focalizzare il flusso.
  5. Selezionare la scheda Intercetta laser e flusso . Premere continuamente il pulsante freccia verde come richiesto per completare il processo di calibrazione dell'intercettazione laser e dell'allineamento degli ugelli.
  6. Accedi allo schermo di allineamento laser fine. Selezionare il canale 640-722/44 (H) come parametro dell'asse X e il canale 405-448/59 (H) come parametro dell'asse Y. Premere il selettore del parametro di trigger e scegliere il parametro SSC del laser a 488 nm. Aprire tutti gli otturatori laser.
    NOTA: i parametri dell'asse X e dell'asse Y scelti dipendono dalla configurazione laser del sistema. Altri parametri sono consentiti se il sistema non dispone di un laser a 640 nm o 405 nm. Per ottenere risultati ottimali, selezionare i laser con la massima separazione spaziale sulla striscia stenopeica (escluso il laser a 355 nm).
  7. Diluire le particelle fluorescenti arcobaleno aggiungendo una goccia in 1 ml di acqua bidistillata per una concentrazione finale di 1 x 106 sfere per ml. Aprire lo sportello della camera di campionamento e caricare un tubo delle particelle fluorescenti arcobaleno preparate.
  8. Premere il pulsante Avvia campione . Regola i micrometri su e giù per ottimizzare l'intensità della fluorescenza, rendendo ogni segnale il più intenso possibile. Premere il pulsante Start Quality Control (QC) sul pannello di controllo touchscreen per eseguire automaticamente il controllo qualità.
  9. Eseguire il ritardo di caduta. Accedere alla schermata di configurazione dell'ordinamento e selezionare il pulsante di ritardo a discesa. Premere il pulsante Inizializzazione IntelliSort. Lo strumento regola automaticamente la frequenza e l'ampiezza dell'oscillazione della goccia per ottenere il ritardo di caduta di 25 ± 5 ed essere in grado di visualizzare chiaramente il punto di rottura della goccia. Premere il pulsante Mantenere .
  10. Selezionate tubo come tipo di output di ordinamento. Posizionare un portatubo da 15 mL nella camera di smistamento. Accendere la tensione della piastra e impostare la tensione della piastra su circa 4000 V.
  11. Attivare il modello di test selezionando il pulsante Impostazione flusso . Regolare il cursore della fase di carica e il cursore di deflessione per assicurarsi che l'immagine del flusso sia allineata con il tubo di raccolta. Selezionare il pulsante Segno di spunta .
  12. Accedere alla workstation Summit sul computer. Creare un nuovo protocollo dal menu principale File. Creare un dot plot selezionando la scheda Istogramma nel pannello di controllo del software Summit.
  13. Fare clic con il pulsante destro del mouse sugli assi del nuovo diagramma di punti nel workspace e scegliere FSC come parametro dell'asse X e SSC come parametro dell'asse Y. Presentare FSC e SSC in forma logaritmica.
  14. Selezionare la scheda Acquisizione e individuare il pannello dei parametri di acquisizione. Abilita tutti i segnali nel sottomenu dei parametri di abilitazione. Scegliere FSC come parametro di attivazione e impostare la soglia di 0,01. Regolare la tensione e il guadagno di FSC e SSC su 250 e 0,6 per garantire che gli eventi all'interno del grafico FSC vs. SSC e le popolazioni siano separati.
    NOTA: l'impostazione della soglia equivale all'impostazione della dimensione delle particelle che può essere rilevata mediante citometria a flusso. Maggiore è la soglia, più grandi saranno le particelle rilevate e le particelle piccole saranno tagliate dalla soglia e non potranno essere rilevate. In questo metodo, la soglia è impostata su 0,01, in modo da poter rilevare tutte le particelle più grandi del rumore elettronico.

4. Isolamento di sEV

  1. Diluire le microsfere fluorescenti in polistirene a sospensioni di 100 nm, 200 nm e 300 nm. Aggiungere 1 μL di microsfere a 1 mL di acqua bidistillata.
  2. Caricare successivamente la sospensione della microsfera. Seleziona Start nel menu di acquisizione del software Summit e registra 20.000 eventi.
    NOTA: il numero di eventi è facoltativo. Non meno di 5.000 eventi sono raccomandati per soddisfare la significatività statistica.
  3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul dot plot FSC vs. SSC per creare rettangoli e trascinare per ridimensionare e riposizionare le regioni di rumore elettronico e la popolazione di microsfere di 100 nm. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulle regioni per rinominarle rispettivamente come R7 e R4. Ripetete i passaggi precedenti per inquadrare le microsfere da 200 nm e 300 nm con rettangoli successivamente e rinominatele rispettivamente come R5 e R6.
  4. Infine, determinare la regione di ordinamento 50-200 nm in base al rumore elettronico e alla posizione delle particelle a 200 nm definite come R8.
    NOTA: Il limite inferiore di rilevamento di 50 nm è posto appena sopra il rumore elettronico della selezionatrice di celle di flusso. La regione tra il rumore e la popolazione di microsfere a 200 nm può quindi essere definita tra 50-200 nm.
  5. Modificare le decisioni di ordinamento nel pannello Logica di ordinamento e statistiche. Fare doppio clic sul campo vuoto del flusso sinistro (L1). Selezionare la regione denominata R8 per creare la logica di ordinamento. Scegliete la modalità di purezza Abort e selezionate un inviluppo di gocce di 1 goccia per il flusso L1.
  6. Caricare un campione di 500 μL di miscela EV dal punto 2.3. Premere il pulsante Start sotto il menu di acquisizione in Summit per acquisire i dati, quindi premere Start nel menu di ordinamento per raccogliere 50-200 nm sEV in una provetta da centrifuga da 15 ml.
    NOTA: è necessario un ambiente sterile per ridurre al minimo la contaminazione durante qualsiasi procedura.
  7. Osservare la presenza di sEV mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e verificare la dimensione delle particelle di sEV utilizzando NTA. Eseguire l'analisi western blot (WB) per confermare ulteriormente l'espressione dei marcatori CD9, CD63 e CD8118.

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Risultati

Il diagramma di flusso per il protocollo sperimentale è mostrato nella Figura 1. In questo metodo, sono state utilizzate microsfere di polistirene di dimensioni standard come standard di riferimento per la distribuzione granulometrica. Nella condizione del parametro strumentale specifico, il segnale delle particelle potrebbe essere chiaramente distinto dal rumore di fondo nel grafico FSC vs. SSC usando la forma logaritmica. Le strategie di gating sono illustrate nella Fi...

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Discussione

Questo protocollo delinea un metodo ottimizzato per isolare e purificare sEV con la dimensione delle particelle specificata di 50-200 nm utilizzando un selezionatore di celle a flusso, che è stato convalidato da NTA. Il metodo ha risolto il problema del collo di bottiglia di ottenere sEV con dimensioni delle particelle uniformi e elevata purezza, evitando interferenze da molecole biologiche non correlate avvolte in EV di grandi dimensioni22. Analisi rapide e ad alto rendimento sono possibili con l...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo di ricerca scientifica dell'Università di medicina cinese di Zhejiang (2020ZG29), dal Progetto di ricerca sul benessere pubblico di base della provincia di Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), dal Progetto del Dipartimento provinciale dell'istruzione dello Zhejiang (Y202147028) e dal Progetto di tecnologia sperimentale del Dipartimento di laboratorio dell'Università di Zhejiang (SJS201712, SYB202130).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da centrifugaBeckman Coulter344058
Fiasche di colturaCorning 
Dulbecco' s medium aquila modificataCorning Cellgro10-013-CV
Siero fetale bovinoSUERSUER050QY
Selezionatore di cellule a flussoBeckman CoulterMoflo Astrios EQ
Cellula tumorale pancreatica umana, PANC-1NANAPANC-1 Le cellule sono state donate dal professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Dimensione delle particelle laser e potenziale zeta analizzatore MalvernZetasizer Nano ZS 90
Soluzione salina tampone fosfatoGibcoC20012500BT
Microsfere fluorescenti in polistireneBeckman Coulter6602336
Microscopia elettronica a trasmissioneJEOLJEM-1200EX
Soluzione tripsina-EDTAGibco1713949
Particelle fluorescenti ultra arcobalenoBeckman CoulterB28479
UltracentrifugaBeckman CoulterOptima-L80XP
Rotore per ultracentrifugaBeckman CoulterSW32TI
430641

Riferimenti

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