Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Summary

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento rapido e specifico per le dimensioni delle piccole vescicole extracellulari ottimizzando le dimensioni dell'ugello di nebulizzazione dell'aria, la pressione del fluido della guaina, la pressione del flusso del campione, la tensione, il guadagno e i parametri di soglia di attivazione.

Abstract

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) possono essere rilasciate da tutti i tipi di cellule e trasportare proteine, DNA e RNA. Le molecole di segnalazione servono come indicatori dello stato fisiologico e patologico di una cellula. Tuttavia, non esiste un metodo standard per l'isolamento di sEV, che impedisce l'identificazione dei biomarcatori a valle e gli studi di intervento farmacologico. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la purificazione di 50-200 nm sEV da parte di una selezionatrice di celle a flusso. Per questo, sono stati selezionati un ugello da 50 μm e una pressione del fluido della guaina da 80 psi per ottenere una buona velocità di selezione e un flusso laterale stabile. Sono state utilizzate microsfere di polistirene di dimensioni standard per localizzare popolazioni di particelle di 100, 200 e 300 nm. Con un'ulteriore ottimizzazione della soglia di attivazione di tensione, guadagno e diffusione diretta (FSC), il segnale sEV potrebbe essere separato dal rumore di fondo. Queste ottimizzazioni forniscono un pannello di impostazioni di ordinamento critiche che consente di ottenere una popolazione rappresentativa di sEV utilizzando solo FSC vs. side scatter (SSC). Il metodo di isolamento basato sulla citometria a flusso non solo consente l'analisi ad alto rendimento, ma consente anche la classificazione sincrona o l'analisi del proteoma di sEV in base all'espressione del biomarcatore, aprendo numerose applicazioni di ricerca a valle.

Introduction

Una cellula rilascia vescicole extracellulari (EV) di varie dimensioni che si traducono in molecole di segnalazione e inclusioni di membrana, che sono importanti per la comunicazione intercellulare¹. Anche le EV di diverse dimensioni svolgono ruoli biologici diversi, con 50-200 nm sEV in grado di distribuire con precisione RNA, DNA e proteine nella corretta posizione extracellulare. Il sEV aiuta anche a determinare i loro meccanismi di secrezione, coinvolgendo non solo la regolazione dei normali processi fisiologici come la sorveglianza immunitaria, il mantenimento delle cellule staminali, la coagulazione del sangue e la riparazione dei tessuti....

Protocol

1. Coltura cellulare

1. Preparare un terreno di coltura di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Coltura della cellula tumorale pancreatica umana, PANC-1, in un matraccio di coltura di 75 cm² ad una densità di 1 x 10⁶ cellule/ml. Incubare la coltura a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Subcoltura delle cellule quando la densità cellulare raggiunge il 75% -80% sotto osservazione microscopica. Rimuovere il mezzo e risciacquare 2 volte con 3-5 ml di tampone fosfato salino (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
3. Scartare la soluzione, aggiungere 1-2 ml di soluzione di t....

Results

Il diagramma di flusso per il protocollo sperimentale è mostrato nella Figura 1. In questo metodo, sono state utilizzate microsfere di polistirene di dimensioni standard come standard di riferimento per la distribuzione granulometrica. Nella condizione del parametro strumentale specifico, il segnale delle particelle potrebbe essere chiaramente distinto dal rumore di fondo nel grafico FSC vs. SSC usando la forma logaritmica. Le strategie di gating sono illustrate nella Fi.......

Discussion

Questo protocollo delinea un metodo ottimizzato per isolare e purificare sEV con la dimensione delle particelle specificata di 50-200 nm utilizzando un selezionatore di celle a flusso, che è stato convalidato da NTA. Il metodo ha risolto il problema del collo di bottiglia di ottenere sEV con dimensioni delle particelle uniformi e elevata purezza, evitando interferenze da molecole biologiche non correlate avvolte in EV di grandi dimensioni²². Analisi rapide e ad alto rendimento sono possibili con l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta da centrifuga	Beckman Coulter	344058
Fiasche di coltura	Corning
Dulbecco' s medium aquila modificata	Corning Cellgro	10-013-CV
Siero fetale bovino	SUER	SUER050QY
Selezionatore di cellule a flusso	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Cellula tumorale pancreatica umana, PANC-1	NA	NA	PANC-1 Le cellule sono state donate dal professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Dimensione delle particelle laser e potenziale zeta analizzatore	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Soluzione salina tampone fosfato	Gibco	C20012500BT
Microsfere fluorescenti in polistirene	Beckman Coulter	6602336
Microscopia elettronica a trasmissione	JEOL	JEM-1200EX
Soluzione tripsina-EDTA	Gibco	1713949
Particelle fluorescenti ultra arcobaleno	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Rotore per ultracentrifuga	Beckman Coulter	SW32TI