Microscopia a super-risoluzione del complesso sinaptonemale all'interno della linea germinale di Caenorhabditis elegans

Summary

La microscopia a super-risoluzione può fornire una visione dettagliata dell'organizzazione dei componenti all'interno del complesso sinaptonemale nella meiosi. Qui, dimostriamo un protocollo per risolvere le singole proteine del complesso sinaptonemale Caenorhabditis elegans .

Abstract

Durante la meiosi, i cromosomi omologhi devono riconoscersi e aderire l'uno all'altro per consentire la loro corretta segregazione. Uno degli eventi chiave che assicura l'interazione dei cromosomi omologhi è l'assemblaggio del complesso sinaptonemale (SC) nella profase meiotica I. Anche se c'è poca omologia di sequenza tra i componenti proteici all'interno della SC tra le diverse specie, la struttura generale della SC è stata altamente conservata durante l'evoluzione. Nelle micrografie elettroniche, la SC appare come una struttura tripartita, simile a una scala, composta da elementi laterali o assi, filamenti trasversali e un elemento centrale.

Tuttavia, identificare con precisione la localizzazione dei singoli componenti all'interno del complesso mediante microscopia elettronica per determinare la struttura molecolare della SC rimane difficile. Al contrario, la microscopia a fluorescenza consente l'identificazione di singoli componenti proteici all'interno del complesso. Tuttavia, poiché l'SC è largo solo ~ 100 nm, la sua sottostruttura non può essere risolta dalla microscopia a fluorescenza convenzionale limitata dalla diffrazione. Pertanto, la determinazione dell'architettura molecolare della SC richiede tecniche di microscopia ottica a super-risoluzione come la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), la microscopia a deplezione a emissione stimolata (STED) o la microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM).

Per mantenere la struttura e le interazioni dei singoli componenti all'interno della SC, è importante osservare il complesso in un ambiente vicino al suo ambiente nativo nelle cellule germinali. Pertanto, dimostriamo un protocollo di immunoistochimica e imaging che consente lo studio della sottostruttura della SC in tessuto germinale intatto ed estruso di Caenorhabditis elegans con microscopia SMLM e STED. Il fissaggio diretto del tessuto al vetrino riduce il movimento dei campioni durante l'imaging e riduce al minimo le aberrazioni nel campione per ottenere l'alta risoluzione necessaria per visualizzare la sottostruttura del SC nel suo contesto biologico.

Introduction

Ridurre il numero di cromosomi della metà durante la meiosi è la chiave per generare una progenie sana negli organismi che si riproducono sessualmente. Per ottenere questa riduzione del numero di cromosomi, i cromosomi omologhi devono accoppiarsi e segregare durante la meiosi I. Per garantire l'accurata segregazione dei cromosomi omologhi, le cellule germinali subiscono una profase I estesa, durante la quale i cromosomi omologhi si accoppiano, sinapsi e si ricombinano per generare collegamenti fisici tra omologhi¹. La SC è emersa come la struttura centrale che è la chiave per regolare la corretta progressione attraverso la profase meiotica².

La SC è un complesso la cui struttura generale è evolutivamente conservata, anche se c'è poca omologia tra le sue componenti proteiche. La SC è stata identificata per la prima volta nelle micrografie elettroniche come una struttura tripartita, simile a una scala, costituita da due elementi laterali o assi, una regione centrale formata da filamenti trasversali e un elemento centrale ^3,4. Determinare l'organizzazione dei singoli componenti all'interno del complesso è la chiave per far progredire la nostra comprensione del ruolo del SC durante la profase meiotica.

L'organismo modello C. elegans è ideale per studiare la struttura e la funzione della SC poiché le sue linee germinali contengono un gran numero di nuclei meiotici con SC 5 completamente assemblati. Studi genetici e biochimici hanno rivelato che gli assi cromosomici sono formati da tre distinti complessi di coesina^6,7 e quattro proteine del dominio HORMA chiamate HTP-1/2/3 e HIM-3 7,8,9,10,11 in C. elegans. Nella regione centrale del SC, sei proteine contenenti domini a spirale sono state identificate fino ad oggi 12,13,14,15,16,17. Per colmare la distanza tra i due assi, SYP-1, -5 e -6 dimerizzano in modo testa a testa (Figura 1), mentre tre proteine aggiuntive stabilizzano la loro interazione nell'elemento centrale^16,17,18,19.

Ottenere informazioni dettagliate sull'organizzazione di queste proteine è essenziale per comprendere le molte funzioni della SC durante la meiosi. Poiché la larghezza della regione centrale del SC è solo ~ 100 nm, la sua sottostruttura non può essere risolta mediante microscopia a fluorescenza limitata dalla diffrazione. Tuttavia, la visualizzazione di componenti all'interno di una struttura di queste dimensioni è facilmente realizzabile con la microscopia a super-risoluzione. Infatti, la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), la microscopia ad espansione 20, la microscopia a deplezione a emissione stimolata (STED)²¹ e la microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM)22,23 sono emerse come strumenti essenziali per studiare l'architettura molecolare della SC tra le specie 16,24,25,26,27,28,29^{, 30}.

Per superare il limite di risoluzione, la microscopia STED si basa sulla sovrapposizione del punto limitato dalla diffrazione della luce di emissione con un raggio a forma di ciambella dal laser STED, che teoricamente restringe la funzione di diffusione del punto fino alle dimensioni molecolari^31,32. Tuttavia, la risoluzione che è praticamente raggiungibile da STED all'interno di campioni biologici rimane nell'intervallo di poche decine di nanometri in xy³³.

Una risoluzione ancora più elevata nei campioni biologici può essere ottenuta con le tecniche SMLM. SMLM sfrutta le proprietà lampeggianti di specifici fluorofori per risolvere oggetti a livello di sub-diffrazione separando nel tempo i fluorofori spazialmente sovrapposti. Il campione viene quindi ripreso ripetutamente per catturare diversi sottoinsiemi di fluorofori. La posizione dei fluorofori all'interno del campione viene quindi determinata adattando la funzione di diffusione puntuale (PSF) ai segnali ottenuti in tutte le immagini, che possono risolvere strutture fino a 15 nm ^23,34.

Nel loro insieme, le immagini localizzate codificano le posizioni di tutti i fluorofori. La risoluzione di SMLM è determinata dalla densità di etichettatura e dalle caratteristiche lampeggianti del fluoroforo. Secondo il criterio di Nyquist-Shannon, è impossibile risolvere in modo affidabile oggetti che sono meno del doppio della distanza media da etichetta a etichetta. Pertanto, è necessaria un'elevata densità di etichettatura per l'imaging ad alta risoluzione. Per la SC in C. elegans, un'alta densità di marcatura può essere ottenuta utilizzando tag epitopi attaccati a siti specifici di proteine endogene utilizzando l'editing del genoma. Le etichette epitopiche possono quindi essere colorate ad alta densità utilizzando anticorpi monoclonali specifici con alta affinità^19,30. Allo stesso tempo, il ciclo di accensione dei singoli fluorofori deve essere abbastanza breve da garantire che i fluorofori spazialmente sovrapposti non vengano catturati contemporaneamente³⁵.

A causa di questi due requisiti, risolvere la struttura di grandi complessi macromolecolari come la SC richiede l'imaging di un numero sufficientemente grande di immagini e può quindi richiedere diverse ore. La trappola dei lunghi tempi di imaging è che i campioni tendono ad andare alla deriva a causa del movimento dello stadio o di piccole correnti all'interno del buffer del campione; Anche piccoli movimenti dell'ordine di 10 nm sono dannosi alla risoluzione nm e devono essere corretti. Tuttavia, i metodi di correzione della deriva comunemente usati non sono abbastanza robusti da sovrapporre accuratamente le immagini di due canali ripresi in sequenza³⁶. Questo è problematico perché le domande biologiche spesso richiedono una rilevazione precisa e la localizzazione di più bersagli all'interno dello stesso campione. Per aggirare questi problemi, sono stati sviluppati metodi come l'imaging raziometrico. L'imaging raziometrico consente l'imaging simultaneo di più fluorofori con spettri di eccitazione ed emissione sovrapposti, con una successiva assegnazione di ciascun segnale rilevato al rispettivo fluoroforo in base al rapporto di intensità in canali spettralmente distinti^37,38.

Inoltre, lo studio dell'organizzazione di complessi macromolecolari come la SC richiede informazioni tridimensionali (3D). Per ottenere una super-risoluzione in tre dimensioni (3D-SMLM), una lente cilindrica è incorporata nel percorso ottico della luce emessa che distorce la forma della PSF di un fluoroforo a seconda della sua distanza dal piano focale. Quindi, la posizione precisa di un fluoroforo nel piano z può essere estrapolata analizzando la forma del suo segnale di emissione^35,39. La combinazione di questi progressi in SMLM consente l'imaging dell'organizzazione 3D di complessi macromolecolari, incluso il SC.

Protocol

1. Preparazione di soluzioni e vetrini

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e reagenti e la Tabella 1 per la composizione delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Coprivetrini rivestiti in poli-L-lisina
   1. Preparare lo 0,01% (p/v) di poli-L-lisina (vedere Tabella 1).
   2. Lavare un coprislip di precisione (diametro 24 mm; 0,17 ± 0,005 mm, n. 1,5) in etanolo per 10-30 minuti. Risciacquare il coprivetrino con ddH₂O per rimuovere l'etanolo e lasciare asciugare il coprislip a temperatura ambiente.
   3. Pulire al plasma il vetrino usando un detergente al plasma.
      NOTA: La pulizia al plasma aumenta l'idrofilia del coprislip e facilita i passaggi successivi. Se non è disponibile un detergente al plasma, questo passaggio può essere saltato, anche se ciò potrebbe richiedere la regolazione del volume e/o della concentrazione della soluzione di poli-L-lisina. Questa modifica non è stata testata.
   4. Introdurre una goccia (120 μL) di poli-L-lisina allo 0,01% (p/v) sul vetrino. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   5. Dopo l'incubazione, sciacquare il vetrino di copertura in ddH₂O e asciugarlo a temperatura ambiente. Conservare a 4 °C fino a 1 mese.
2. Frammenti di F(ab')2 coniugati con coloranti organici fluorescenti
   1. Aggiungere il seguente ordine a una provetta PCR: 10 μL di 0,6-0,7 mg/mL di frammento di F(ab')2 in PBS, 1 μL di 0,1 M NaHCO 3 (pH_8,3 ) e 1 μL di 1 mM di fluoroforo reattivo all'estere succinimidil (NHS) nel DMSO (rapporto molare di F(ab')2:colorante è ~1:17). Mescolare bene pipettando su e giù.
   2. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   3. Separare il frammento F(ab')2 dal colorante reattivo libero rimanente utilizzando una colonna di desalinizzazione (7K MWCO) seguendo le specifiche del produttore. Utilizzare 1x PBS per l'equilibrio della colonna e l'eluizione del frammento F(ab')2 marcato.
   4. Conservare il frammento F(ab')2 marcato a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
      NOTA: i tempi di conservazione superiori a 3 mesi non sono stati testati.

2. Dissezione e fissazione

NOTA: Le procedure di dissezione e fissazione sono modificate rispetto alle procedure precedentemente raccomandate^16,40 per ottenere campioni ottimali per la microscopia a super-risoluzione.

1. Dissezione
   1. Prelevare i vermi C. elegans di pari età (cresciuti a 20 °C per questo studio) in una goccia di 30 μL di EBTT (1x tampone per uova⁴¹ con detergente non ionico allo 0,2%, Tabella 1) su un vetrino (22 mm x 22 mm, n. 1). Posizionare il vetrino su un vetrino per facilitarne la manipolazione. Lavare con 30 μL di EBTT mediante pipettaggio su e giù più volte. Rimuovere 30 μL della soluzione per lasciare una goccia di 30 μL sul vetrino.
      NOTA: Piccole quantità di detergente non ionico devono essere aggiunte a tutte le soluzioni in cui i vermi sono pipettati per evitare che i vermi si attacchino alle punte di plastica.
   2. Utilizzare una lama di bisturi per tagliare le teste e/o le code dei vermi per estrudere la gonade (Figura 2A).
2. Fissazione
   1. Pipet 30 μL di soluzione fissativa (Tabella 1) nella goccia dei vermi sezionati e pipettare su e giù per mescolare.
      NOTA: Il pipettaggio su e giù alcune volte può aiutare a rilasciare più gonadi.
   2. Fissare esattamente per 1 minuto dopo aver aggiunto la soluzione fissativa.
   3. Interrompere la fissazione trasferendo i vermi in un tubo PCR riempito con TBST (Tabella 1). Trasferire i vermi nel minor volume possibile (~15 μL).
   4. Far girare il tubo PCR su una mini centrifuga da banco (2.000 × g, 10 s). Rimuovere il surnatante e lavare 2 volte con 200 μL di TBST ciascuno.
   5. Lavare con 200 μL di PBST (Tabella 1) per 5-10 min. Ripetere i passaggi da 2.1.1 a 2.2.5 per un massimo di quattro campioni mantenendo i campioni sezionati sul ghiaccio.
      NOTA: se si elaborano più di quattro campioni, procedere con i passaggi da 2.2.6 a 2.2.7 dopo ogni quattro campioni per garantire che la fissazione del campione rimanga coerente in tutti i campioni.
   6. Far girare i campioni sezionati su una mini centrifuga da banco (2.000 × g, 10 s), rimuovere il PBST e aggiungere 50-100 μL di metanolo freddo (-20 °C).
      ATTENZIONE: Il metanolo è tossico. Indossare dispositivi di protezione ed evitare l'inalazione.
   7. Mescolare mediante pipettaggio su e giù e lasciare i campioni in metanolo per 30-60 s. Lavare i campioni 2x in 200 μL di PBST.
      NOTA: se si elaborano più di quattro campioni, procedere con la dissezione dei campioni rimanenti (punti da 2.1.1 a 2.2.7).
   8. Lavare i campioni una terza volta con 200 μL di PBST.

3. Incubazioni di anticorpi

1. Inceppamento
   1. Bloccare i campioni in 1x Soluzione di blocco (Tabella 1) per 45-60 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Il tempo di incubazione può variare da 30 minuti a temperatura ambiente a diversi giorni a 4 °C (il test è stato effettuato fino a 3 giorni).
2. Soluzione anticorpale primaria
   1. Diluire gli anticorpi anti-HTP-3 (pollo⁴²) e anti-HA (topo) (o gli anticorpi di scelta) alle soluzioni di lavoro (1:250 per SMLM e 1:1.000 per campioni di microscopia STED) in 1x Soluzione di blocco.
      NOTA: Gli anticorpi utilizzati per marcare i campioni SMLM sono più concentrati rispetto ai campioni STED poiché per la microscopia SMLM è raccomandata una densità di etichettatura più elevata.
   2. Centrifugare i campioni su una mini centrifuga da banco (2.000 × g, 10 s), rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 30-50 μL della soluzione anticorpale primaria. Incubare per una notte a 4 °C (preferibile) o per 1-2 ore a temperatura ambiente.
   3. Dopo l'incubazione, lavare 3 x 5-15 minuti con PBST.
3. Soluzione di lavoro di frammenti F(ab')2 coniugati a colorante fluorescente
   1. Diluire i frammenti F(ab')2 marcati (fase 1.2.4) nelle soluzioni di lavoro (1:100 per SMLM e 1:1.000 per campioni di microscopia STED) in 1x soluzione bloccante.
      NOTA: Per entrambe le tecniche di super-risoluzione, sono state utilizzate coppie di fluorofori precedentemente riportate, ovvero AlexaFluor647/CF680 per SMLM e AlexaFluor594/Abberior STAR635P per STED. AlexaFluor647 e STAR645P sono stati utilizzati per marcare frammenti anti-topo (Fab')2 per colpire il C-terminus di SYP-5 e CF680/AlexaFluor594-marcati anti-pollo (Fab')2 frammenti per colpire HTP-3.
   2. Far girare i campioni su una mini centrifuga da banco (2.000 × g, 10 s), rimuovere il PBST e aggiungere 30-50 μL di soluzione anticorpale secondaria. Incubare per 30 minuti a 2 ore a temperatura ambiente (preferito) o per una notte a 4 °C. Lavare 3 x 5-15 minuti con PBST.

4. Montaggio dei campioni su un vetrino

1. Postfissazione
   NOTA: Processare i campioni singolarmente attraverso i passaggi 4.1.1-4.2.1.
   1. Ruotare i campioni macchiati e rimuovere il surnatante. Aggiungere 50 μL di PBST^0,2 e trasferire i vermi colorati su un coprivetrino n. 1 da 22 x 22 mm.
      NOTA: Utilizzare PBST 0,2 fresco con detergente non ionico allo^0,2 % (Tabella 1) per questo passaggio per evitare che i vermi aderiscano al vetrino.
   2. Pipet 5,7-6,3 μL di soluzione postfissativa su un coprivetrino di poli-L-lisina.
      NOTA: I vetrini di poli-L-lisina conservati a 4 °C devono essere portati prima a temperatura ambiente.
   3. Pipet rimuove i vermi sezionati nello stesso volume (5,7-6,3 μL) e trasferiscono nella goccia di fissativo sul coprislip di poli-L-lisina (Figura 2B).
      NOTA: In questa e nella fase successiva, è molto importante mantenere il tessuto sezionato al centro del coprislip rivestito di poli-L-lisina. Ciò è particolarmente importante se si montano i campioni in un supporto personalizzato per adattarsi al microscopio SMLM personalizzato utilizzato qui (vedere il passaggio 5.1, Figura 2B).
   4. Coprire il campione con un piccolo vetrino di copertura (diametro 12 mm, figura 2B). Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando un piccolo pezzo di carta da filtro (Figura 2B). Fissare per 3-5 minuti in una camera buia.
2. "Freeze-cracking"
   1. Congelare i campioni posizionandoli su un blocco di alluminio in ghiaccio secco (Figura 2B).
      NOTA: Il blocco di alluminio deve essere ben raffreddato nel ghiaccio secco prima di posizionare i campioni su di esso. Procedere con la postfissazione dei campioni rimanenti (punti da 4.1.1 a 4.2.1). Il campione deve essere su ghiaccio secco per almeno 20 minuti o fino a 1 ora prima della fase successiva (4.2.2).
   2. Rimuovere il coprislip più piccolo con un rasoio (Figura 2B).
      NOTA: per STED, procedere al passaggio 5.2.1. Per SMLM, continuare con il passaggio 4.2.3.
   3. Immergere il foglietto in un tubo conico da 50 mL contenente PBS ghiacciato (preferito) o metanolo a -20 °C per circa 10 s.
      NOTA: La temperatura è un fattore molto importante per questo passaggio. Pertanto, utilizzare PBS appena scongelato o conservato in un bagno di ghiaccio / etanolo.
   4. Posizionare il coprislip in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti riempita con tampone PBST. Rimuovere il PBST dai pozzetti e aggiungere PBS fresco. Lasciare i campioni in PBS per 5 minuti.
      NOTA: Pipet il PBS sul lato del pozzo per evitare di danneggiare e staccare i campioni.
   5. Lavare con PBS fresco e lasciare i campioni a 4 °C fino all'imaging.
      NOTA: i campioni sono stabili per un massimo di 2 settimane, ma i migliori risultati si ottengono se i campioni vengono ripresi entro 2 giorni.
   6. Prima dell'imaging, valutare la qualità del montaggio del campione al microscopio stereo.
      NOTA: le linee germinali montate con successo sono fissate stabilmente senza alcun movimento visibile rispetto al vetrino. Le linee germinali scarsamente attaccate si sbattono nella soluzione tampone.

5. Imaging

1. Microscopia di localizzazione a singola molecola
   NOTA: Le immagini sono state acquisite presso l'EMBL Imaging Centre utilizzando un microscopio di localizzazione a singola molecola costruito su misura che è stato costruito attorno a un corpo personalizzato, come precedentemente riportato^38,43, con le caratteristiche specifiche specificate nella Tabella dei materiali; fare riferimento a https://www.embl.org/about/info/imaging-centre
   1. Acquisizione della calibrazione 3D delle perline
      1. Preparare un coprislip di precisione (diametro 24 mm; 0,17 ± 0,005 mm, n. 1,5) con perline fluorescenti aderenti da 100 nm come descritto in precedenza^38,44.
      2. Posizionare il campione di taratura del punto 5.1.1.1 su un portacampioni.
      3. Aggiungere una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo pulito 100x/1,5 e montare il campione di calibrazione sul microscopio.
      4. All'interno di MicroManager 2 45,46^, specificare^15-20 posizioni nel campione di calibrazione.
      5. All'interno della finestra⁴⁷ del plugin EMU, impostare l'acquisizione di un'immagine z-stack per ciascuna delle posizioni dal punto 5.1.1.5.
         NOTA: Qui, una lente cilindrica composta fornisce l'astigmatismo richiesto per l'imaging 3D e sono state acquisite 201 sezioni z per ogni posizione che copre l'intervallo compreso tra -1 μm e 1 μm, con un incremento di 10 nm. È stata utilizzata un'illuminazione laser da 2 kW/cm² 640 nm per 25 ms per ogni z-slice.
      6. Acquisire le immagini z-stack delle sfere fluorescenti da 100 nm attraverso un percorso ottico identico che verrà utilizzato per acquisire immagini campione nel passaggio 5.1.11.
      7. Utilizzando la piattaforma di analisi al microscopio a super-risoluzione (SMAP⁴⁸), generare un modello cspline della funzione di diffusione del punto sperimentale (PSF) che verrà utilizzato per adattare i dati 3D-SMLM nella fase 5.1.13.
   2. Preparare il portacampioni. Per il supporto personalizzato utilizzato qui che utilizza un anello magnetico per creare la camera di imaging (Figura 2B), avvolgere l'anello magnetico con parafilm.
      NOTA: In alternativa, un vetrino per microscopio con una cavità di depressione concava può essere utilizzato per montare campioni per microscopi con supporti per vetrino.
   3. Preparare 1 mL di tampone di imaging⁴⁴ (Tabella 1).
   4. Prendete un foglietto del punto 4.2.6 e mettetelo nel supporto personalizzato. Fissare il vetrino di copertura nel supporto con l'anello magnetico avvolto nel parafilm (punto 5.1.2).
   5. Pipetare delicatamente il tampone di imaging (punto 5.1.3) nella camera creata dall'anello magnetico sulla parte superiore del campione (Figura 2B). Sigillare la camera con un pezzo di parafilm.
   6. Per montare il campione, aggiungere una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo dell'olio pulito 100x/1,5. Senza introdurre aria nell'olio per immersione, posizionare delicatamente il portacampioni con il campione montato (fase 5.1.5) sul palco del microscopio.
      NOTA: Prima di posizionare il campione sul microscopio, pulire il fondo del vetrino con fazzoletto e etanolo al 70%.
   7. Utilizzando la finestra⁴⁷ del plugin EMU all'interno di MicroManager 2^45,46, spostare lo stadio piezoelettrico fino a quando il segnale del laser di blocco della messa a fuoco non viene rilevato al fotodiodo del quadrante (QPD).
      NOTA: per mantenere una messa a fuoco fissa per tutto il tempo di imaging, il blocco della messa a fuoco si ottiene mediante la riflessione interna totale di un laser accoppiato a fibre nel vicino infrarosso dal coprislip e il successivo rilevamento sensibile all'altezza su un fotodiodo a quadrante (QPD). Il segnale QPD forniva il controllo ad anello chiuso dell'attacco piezoelettrico dell'obiettivo.
   8. Acquisire un'immagine del piano focale posteriore con un laser di eccitazione a 640 nm a bassa potenza (cioè 1-5%) per confermare l'assenza di bolle d'aria nell'olio di immersione.
      NOTA: rimuovere il campione dallo stage se viene rilevata una bolla d'aria. Pulire la parte inferiore del copricostume e l'obiettivo e ripetere i passaggi 5.1.6-5.1.8. In caso contrario, procedere a bloccare lo stato attivo all'interno del software EMU⁴⁷.
   9. Localizzare il tessuto gonadico utilizzando l'illuminazione a campo chiaro. Utilizzando un'illuminazione a bassa intensità a 640 nm, concentrarsi sulla sezione del tessuto che contiene molti tratti SC.
      NOTA: Non mettere a fuoco strutture che si trovano a più di 2 μm dal coprivetrino. Non utilizzare una potenza laser superiore per localizzare il campione, poiché ciò potrebbe trasformare alcuni fluorofori in uno stato lampeggiante prematuramente. Qui, 1 kW / cm² è stato utilizzato in modalità crescente con un impulso impostato su 1.000.
   10. Procedere all'esposizione del campione con un'illuminazione di 640 nm ad alto irraggiamento (27 kW/cm²) per ~30 s fino a raggiungere una velocità di lampeggio appropriata (Video supplementare 1).
   11. Acquisite 200.000 fotogrammi con un tempo di esposizione di 20 ms utilizzando lo strumento di acquisizione multidimensionale di MicroManager 2^45,46.
   12. Nel frattempo, imposta l'attivazione UV utilizzando l'opzione di attivazione del plug-in EMU^38,47 per mantenere la velocità di lampeggio desiderata.
       NOTA: utilizzare il laser UV con un'irradianza di 3 kW/cm² in modalità crescente con lunghezza massima dell'impulso impostata su 10.000.
   13. Eseguire la ricostruzione e la post-elaborazione delle immagini SMLM.
       NOTA: per ricostruire immagini da dati SMLM non elaborati, fare riferimento ai metodi pubblicati. I dati qui presentati sono stati elaborati utilizzando il software SMAP^48,49. Nel software SMAP⁴⁸ sono stati eseguiti la ricostruzione delle immagini super-risolte, l'assegnazione dei canali, la correzione della deriva e il filtraggio delle localizzazioni con scarsa precisione di localizzazione e un filtro di massima verosimiglianza.
2. Microscopia a deplezione ad emissione stimolata
   NOTA: Le immagini sono state acquisite sul sistema microscopico STED integrato equipaggiato con un laser a luce bianca, un laser STED pulsato a 775 nm e il modulo di invecchiamento FALCON Fluorescence Lifetime IM(Table of Materials) presso l'EMBL Imaging Centre (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre).
   1. Posizionare una goccia da 20 μL di supporto di montaggio (Tabella dei materiali) su un vetrino da microscopio. Prendere un foglietto di copertina dal punto 4.2.2 e posizionare delicatamente il campione sul vetrino rivolto verso il supporto di montaggio (Figura 2B).
      NOTA: Evitare di introdurre sacche d'aria all'interno del mezzo di montaggio.
   2. Lasciare che il mezzo di montaggio polimerizzi durante la notte.
      NOTA: Visualizzare i campioni il giorno successivo o mantenerli a 4 °C fino all'imaging.
   3. Per montare il campione, aggiungere una goccia di olio ad immersione sul coperchio del campione dal punto 5.2.2. Posizionare delicatamente il campione sul palco del microscopio utilizzando un obiettivo per olio 100x/1,40.
   4. Concentrarsi sul campione e localizzare il tessuto germinale utilizzando l'illuminazione a campo luminoso.
   5. Utilizzando il software del microscopio, specificare la regione di interesse per la quale verrà acquisita l'immagine TauSTED.
   6. Selezionare i laser di eccitazione e la loro potenza appropriata utilizzata per eccitare i fluorofori utilizzati nel campione.
      NOTA: Qui, il laser a 580 nm al 4% di potenza è stato utilizzato per visualizzare frammenti di anticorpi secondari coniugati AlexaFluor 594 F(ab')2 e 635 nm al 3% di potenza per visualizzare frammenti F(ab')2 coniugati con STAR 635P.
   7. Utilizzando il software del microscopio, selezionare una potenza laser di esaurimento STED appropriata e impostare il rilevamento dell'immagine.
      NOTA: Qui, la potenza del laser a esaurimento STED da 775 nm è stata impostata al 40%. Il rivelatore è stato utilizzato in modalità di conteggio con un valore di guadagno di 10 per il rilevamento di fotoni, con una frequenza di scansione di 100 Hz e con una dimensione dei pixel di 17 nm. L'accumulo a quattro linee è stato utilizzato per l'acquisizione di TauSTED.

Results

Per visualizzare la SC all'interno del tessuto germinale di C. elegans mediante SMLM, abbiamo impiegato 3D-SMLM raziometrico a 2 colori per localizzare HTP-3, un componente degli assi cromosomici, e il C-terminale del filamento trasversale SYP-5 etichettato endogenamente con un tag emoagglutinina (HA). La posizione di entrambe le proteine all'interno della SC di C. elegans è stata precedentemente determinata da altri studi^16,30.

Per ridurre al minimo la diffusione della luce e le aberrazioni ottiche inerenti ai campioni biologici spessi, abbiamo ripreso la sezione z più in basso dei nuclei meiotici che contengono gli SC (Figura 3, linee gialle). Per ogni immagine acquisita, la posizione dello stadio piezoelettrico del piano di imaging è stata contrassegnata rispetto alla posizione dello stadio piezoelettrico quando l'obiettivo è stato focalizzato sulla vetrina. Ciò ha permesso il calcolo della distanza piezoelettrica dal coprifoglio. I campioni montati con successo sono fissati stabilmente vicino al vetrino di copertura e mantengono la forma gonade (cioè, il tessuto non viene schiacciato tra i due vetrini di copertura durante la fase di postfissazione). La qualità del montaggio del campione può essere facilmente valutata al microscopio stereoscopico poiché le gonadi ben fissate non mostrano alcun movimento in soluzione (punto 4.2.6). Tuttavia, a causa della stocasticità del processo di montaggio, il tessuto gonadico non sarà necessariamente disposto completamente piatto sul vetrino. Pertanto, il piano inferiore dei nuclei contenenti SC può essere trovato a distanze variabili rispetto al coprivetrino all'interno della stessa gonade.

Per illustrare come la risoluzione cambia a seconda dell'attacco del tessuto al vetrino, abbiamo acquisito immagini a diverse distanze piezoelettriche dal vetrino. Per valutare la qualità di una singola immagine, sono state calcolate le curve di correlazione dell'anello di Fourier (FRC)^50,51 e la risoluzione è stata determinata utilizzando il plugin FRCResolution all'interno del software SMAP⁴⁸. Due nuclei rappresentativi estratti da due immagini 3D-SMLM separate prese a distanze diverse dal coprivetrino sono mostrati nella Figura 4. Nelle SC situate vicino al coprivetrino, gli assi cromosomici e il C-terminale di SYP-5::HA sono ben risolti in tutte e tre le dimensioni (Figura 4A, 0,8 μm dal coprifoglio). Per risolvere due strutture separate da una data distanza, la risoluzione FRC ottenuta deve generalmente essere inferiore alla metà di questa distanza nella risoluzione assiale.

Per separare lateralmente le stesse strutture, è necessario ottenere valori di risoluzione FRC ancora più piccoli. Infatti, nei campioni che si trovano in prossimità del coverslip, la risoluzione FRC è di 38 nm per il canale AlexaFluor 647 e 34 nm per il canale CF680, e quindi ben al di sotto della distanza prevista di 84 nm tra i termini C di SYP-5¹⁶. Questa risoluzione risolve quindi prontamente l'organizzazione del CS non solo in vista frontale ma anche laterale (Figura 4B i,ii). Al contrario, la risoluzione si deteriora negli SC situati a una distanza di 5 μm dal vetrino di copertura a causa della diffusione della luce e delle aberrazioni sferiche (Figura 4B). Le risoluzioni FRC a questa distanza scendono a 47 nm (AlexaFluor 647) e 41 nm (CF680), che non possono risolvere completamente il C-termini di SYP-5. Poiché le aberrazioni ottiche compromettono la risoluzione laterale in modo più grave rispetto alla risoluzione assiale, le bande HTP-3 e SYP-5 non sono più chiaramente risolte nella sezione trasversale della vista laterale nei campioni situati a una distanza di 5 μm dal vetrino di copertura (Figura 4B ii). Il confronto della risoluzione FRC delle immagini acquisite a diverse distanze piezoelettriche dal coprivetrino ha rivelato che il tessuto ripreso non deve trovarsi più di 2 μm dal coprivetrino (Figura 5). Questo risultato evidenzia l'importanza della corretta esecuzione della fase di postfissazione, durante la quale il tessuto deve essere reticolato con successo al rivestimento in poli-L-lisina del vetrino.

Per dimostrare la risoluzione ottenibile con un'altra tecnica di super-risoluzione, abbiamo anche ripreso SC in tessuto germinale intatto fisso con microscopia TauSTED. La Figura 6A mostra le immagini TauSTED con la risoluzione più alta e più bassa raggiunta nell'ambito di questo studio, come stimato dai profili lineari del SC in vista frontale (Figura 6B). In entrambi i nuclei, abbiamo potuto risolvere le due bande di localizzazione di HTP-3 negli assi cromosomici e i C-termini di SYP-5 nella regione centrale, dimostrando che la risoluzione ottenibile in TauSTED utilizzando questo protocollo ottimizzato è inferiore a 84 nm. In condizioni ottimali (Figura 6A, in alto), abbiamo potuto risolvere i C-termini in viste leggermente inclinate della SC che erano separate da soli 50 nm (Figura 6A, rettangolo giallo e 6C).

Figura 1: Schema dell'organizzazione del complesso sinaptonemale in Caenorhabditis elegans. Il fumetto mostra una struttura semplificata della SC in C. elegans che collega due cromosomi omologhi (grigio). La struttura è mostrata in viste frontali, laterali e trasversali. Gli assi cromosomici sono visualizzati come barre rosse mentre i filamenti trasversali sono mostrati in ciano. Le proteine del filamento trasversale (SYP-1, 5, 6 in C. elegans) sono orientate testa a testa (grafica ciano a sfera a bastone) nella regione centrale per colmare la distanza tra i due assi. Sono indicate le distanze previste tra gli assi e i termini C dei filamenti trasversali. Abbreviazione: SC = complesso sinaptonemale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Illustrazione della preparazione del campione utilizzata nello studio . (A) I giovani adulti di C. elegans vengono sezionati alla testa o alla coda (linee tratteggiate verdi) e trattati come descritto nel protocollo. (B) I singoli passaggi del metodo sono indicati con grafici collegati a frecce grigie. Abbreviazioni: STED = esaurimento delle emissioni stimolate; SMLM = microscopia di localizzazione a singola molecola; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Posizione della sezione di tessuto che può essere osservata mediante microscopia di localizzazione di una singola molecola. MIP di un'immagine confocale del disco rotante di un'intera gonade di C. elegans. Il tessuto è stato colorato per HTP-3 e il C-terminale di SYP-5 (SYP-5::HA), e il segnale combinato è mostrato in grigio. Le singole immagini confocali sono state cucite utilizzando il plugin⁵² delle Fiji per creare un'immagine dell'intera gonade. L'inserto mostra una vista xy del piano z più in basso contenente gli SC. La localizzazione di questo piano è mostrata in viste ortogonali della sezione di tessuto indicate da un rettangolo nell'immagine MIP della gonade (linee gialle). Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: MIP = proiezione di intensità massima; SCs = complessi sinaptonemali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Microscopia di localizzazione a singola molecola di HTP-3 e C-termini di SYP-5. (A,B) A sinistra: immagini SMLM che mostrano nuclei di pachitene colorati per HTP-3 (rosso) e il C-terminale di SYP-5 (SYP-5::HA, ciano) (barra di scala = 1 μm). Centro: Immagini ingrandite delle regioni di interesse indicate in A e B con corrispondenti viste in sezione trasversale visualizzate sotto ogni immagine (i, ii; barra di scala = 100 nm). I tratti della SC all'interno delle immagini ingrandite vengono ruotati per orientare gli assi cromosomici parallelamente all'asse y. A destra: Rappresentazione grafica della localizzazione delle proteine di interesse all'interno del SC che rappresenta l'orientamento della SC nelle regioni ingrandite visualizzate al centro della figura. Abbreviazioni: SMLM = microscopia di localizzazione a singola molecola; SC = complesso sinaptonemale. I dati grezzi per ricostruire le immagini SMLM sono disponibili attraverso il database BioStudies⁶⁰ (ID adesione: S-BIAD504). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: La risoluzione di correlazione dell'anello di Fourier delle immagini al microscopio di localizzazione di singole molecole dipende dalla distanza del piano z ripreso dal piano del vetrino. Le linee colorate mostrano le curve FRC delle immagini acquisite a diverse distanze (come raffigurato dalla barra dei colori) dalla copertina. La soglia di 1/7 utilizzata per determinare la risoluzione FRC è indicata da una linea orizzontale nera. Gli inserti mostrano la dipendenza della risoluzione FRC dalla distanza piezoelettrica dal coprifoglio. Il plottaggio è stato eseguito da uno script R scritto su misura (versione 4.1.2, file supplementare 1) in cui le curve originali sono state smussate con funzioni del pacchetto "ggplot2". Abbreviazioni: FRC = correlazione dell'anello di Fourier; SMLM = microscopia di localizzazione a singola molecola; SC = complesso sinaptonemale. I dati per le curve FRC e i dati SMLM sono disponibili attraverso il database BioStudies⁶⁰ (ID adesione: S-BIAD504). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: La microscopia a deplezione ad emissione stimolata potenziata da informazioni basate sulla vita di fluorescenza (TauSTED) risolve due bande di localizzazione sia per HTP-3 che per il C-terminale di SYP-5. (A) Due immagini rappresentative di TauSTED mostrano nuclei di pachitene colorati per HTP-3 (rosso) e il C-terminale di SYP-5 (SYP-5::HA, ciano) con definizione strutturale superiore (superiore) e inferiore (inferiore) (barra di scala = 1 μm). I rettangoli segnano le regioni con i termini C risolti di SYP-5 in frontale (bianco) e una vista leggermente inclinata (giallo) del SC. (B,C) Distribuzione dell'HTP-3 (rosso) e del C-terminale del segnale SYP-5 (ciano) risolto da TauSTED. I profili delle linee delle regioni di interesse che contengono la SC nelle viste frontali (B) o leggermente inclinate (C) sono mostrati come linee complete con intensità normalizzata al valore massimo. I profili di linea sono stati generati utilizzando Fiji ImageJ. Le linee tratteggiate in B mostrano i dati medi per ciascuna proteina. La linea ciano spessa in C corrisponde al profilo della linea con la distanza risolta più breve tra i termini C di SYP-5. Per determinare le distanze tra gli anticorpi che colpiscono proteine specifiche, i profili di linea (n = 9 (B), n = 7 (C)) sono stati dotati di doppi gaussiani utilizzando uno script R scritto su misura (versione 4.1.2, file supplementare 1). La distanza media ± la deviazione standard (B) e l'intervallo con il valore minimo evidenziato in grassetto (C) sono indicati rispettivamente nella parte superiore di ciascun grafico. Abbreviazioni: STED = microscopia a deplezione ad emissione stimolata; SC = complesso sinaptonemale. Le immagini visualizzate e i punti dati dei profili delle linee tracciate sono disponibili attraverso il database BioStudies⁶⁰ (ID adesione: S-BIAD504). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Composizione dei buffer e delle soluzioni utilizzate in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Video supplementare 1: Acquisizione microscopica di localizzazione di singole molecole. Video che mostra fluorofori che lampeggiano a una velocità appropriata (vengono mostrati 50 fotogrammi, barra di scala = 5 μm, 20 ms / fotogramma). Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: script di analisi dei dati. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

L'organizzazione a scala della SC, che è essenziale per la corretta ricombinazione e segregazione dei cromosomi omologhi, è stata osservata per la prima volta quasi 70 anni fa nella microscopia elettronica ^3,4. Mentre l'organizzazione complessiva della SC è facilmente risolvibile al microscopio elettronico, la localizzazione dei singoli componenti all'interno di questo complesso richiede un approccio più mirato. Con la sua larghezza di soli ~ 100 nm, la sottostruttura della SC non può essere risolta dalla microscopia a fluorescenza convenzionale. Tuttavia, la microscopia a super-risoluzione è diventata un importante motore per nuove scoperte sulla struttura e la funzione del complesso sinaptonemale 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Per facilitare questa ricerca, abbiamo dimostrato una procedura di montaggio che consente di studiare l'architettura della SC all'interno del tessuto gonadico di C. elegans con microscopia SMLM e STED.

Un passo fondamentale per ottimizzare la risoluzione nell'imaging SMLM è la reticolazione diretta del tessuto germinale a un coprivetrino rivestito di poli-L-lisina (fase 4). L'attacco covalente del tessuto al vetrino di copertura è essenziale per ridurre i movimenti all'interno del campione che si tradurrebbero in grandi derive e renderebbero impossibile l'imaging per lunghi periodi di tempo per SMLM. Inoltre, anche un attacco non ottimale che lascia i nuclei contenenti SC a una certa distanza dal vetrino di copertura porta ad un calo significativo della risoluzione ottenibile derivante da aberrazioni sferiche (Figura 4). In alternativa all'attacco covalente qui utilizzato, il tessuto germinale colorato può anche essere immobilizzato tra due vetrini sigillati in una piccola goccia di tampone di imaging^19,30. Tuttavia, questo metodo di immobilizzazione riduce notevolmente il volume del tampone di imaging nel campione da 1 mL utilizzato nel protocollo ottimizzato qui a pochi μL, il che comporterà un'acidificazione del tampone di imaging e ridurrà gravemente il tempo per il quale il campione può essere ripreso 38,53,54.

I lunghi tempi di acquisizione sia per la microscopia SMLM che per la microscopia STED limitano l'uso di questi metodi all'imaging di campioni fissati chimicamente. Qui, la fissazione della paraformaldeide assicura che la struttura del SC sia preservata durante la preparazione del campione e l'imaging. Tuttavia, nonostante le precauzioni prese qui per visualizzare il SC all'interno di tessuto intatto, la struttura risultante della SC dopo la fissazione non è necessariamente identica alla struttura nel suo stato nativo all'interno di un organismo vivente. Inoltre, poiché una singola immagine del SC fisso rappresenta una singola "istantanea" della struttura biologica, questo approccio rimane cieco alla dinamica della struttura nativa in vivo.

Tuttavia, le informazioni sulla dinamica e la variabilità delle strutture macromolecolari possono essere ottenute anche acquisendo non una singola ma molte "istantanee". Mentre questo approccio può risolvere i cambiamenti nella struttura del SC durante il pachitene¹⁹, ci sono diversi fattori che limitano il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo campione preparato utilizzando questo protocollo. In primo luogo, le elevate potenze laser utilizzate durante l'acquisizione delle immagini portano allo sbiancamento permanente dei fluorofori e precludono l'imaging di regioni adiacenti di interesse o piani z multipli, riducendo così significativamente il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo campione. In secondo luogo, la densità del campione/tessuto sul vetrino preparato con questo metodo è bassa, il che limita significativamente il numero di immagini che possono essere acquisite da un singolo vetrino. La bassa densità del campione vieta anche l'uso di pipeline di acquisizione automatica delle immagini che hanno contribuito a far luce su altre questioni biologiche 34,55,56,57,58,59. Tuttavia, la densità del campione può essere leggermente aumentata da un utente esperto.

Il protocollo qui presentato è ottimizzato per ottenere un'elevata densità di etichettatura necessaria per ottenere una risoluzione ottimale in SMLM³⁵. Mentre i protocolli precedenti attaccano covalentemente il tessuto al vetrino prima dell'immunocolorazione¹⁶, questo nuovo protocollo collega il tessuto al vetrino solo dopo che i campioni sono stati colorati in soluzione. Questa modifica consente agli anticorpi utilizzati per l'immunomarcatura di accedere liberamente al tessuto da tutti i lati, mentre l'attaccamento covalente del tessuto al coprislip può impedire agli anticorpi di raggiungere i nuclei più vicini al vetrino, riducendo così il grado di etichettatura. Insieme, le modifiche qui descritte migliorano la risoluzione da 40-50 nm (risoluzione FRC)¹⁶ a 30-40 nm (questo protocollo).

È importante sottolineare che, mentre un'alta densità di etichettatura e un'alta concentrazione di anticorpi sono essenziali per SMLM, abbiamo scoperto che migliori immagini di microscopia STED sono ottenute utilizzando concentrazioni di anticorpi più basse (fase 3). Con una risoluzione di decine di nanometri, la dimensione delle molecole utilizzate per etichettare la proteina di interesse diventa sempre più importante. Abbiamo quindi impiegato frammenti F(ab')2 che sono la metà delle dimensioni degli anticorpi a lunghezza intera. Il miglioramento del contrasto locale dovuto ad una sorgente di segnale più piccola, e quindi la risoluzione ottenuta da questa modifica rispetto all'utilizzo di anticorpi secondari full-length, ha permesso la risoluzione dei due C-termini di SYP-5 all'interno della regione centrale da parte di TauSTED, che non sono risolti da STED convenzionali utilizzando anticorpi full-length (¹⁶ e dati non mostrati). Prevediamo che questo protocollo ottimizzato per l'imaging di SC in linee germinali intatte di C. eleganfaciliterà lo studio della relazione struttura-funzione della SC durante la meiosi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Obiettivo per olio 100x/1,5	Olympus	UPLAPO100XOHR	UPLAPO100XOHR
2-mercaptoetilammina (MEA)	Sigma-Aldrich	30070-10G	Disciolto in acqua MilliQ in soluzione 5 M, pH 8,7 regolato con HCl. Aliquotato in un volume monouso, congelato e mantenuto a -80 °C.
Laser booster aggiuntivo da 640 nm	Toptica	IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, estere NHS	ThermoFischer Scientific	A37572	Disciolto in DMSO in 1 mM di soluzione, aliquotato in volume monouso, congelato e mantenuto a -80 ° C
AlexaFluor 647, estere NHS	ThermoFischer Scientific	A37573	Disciolto in DMSO in 1 mM di soluzione, aliquotato in volume monouso, congelato e mantenuto a -80 ° C
anti-HA	Thermo Fisher Scientific	2-2.2.14	Monoclonale di topo, 1:250 (SMLM), 1:1.000 (STED Microscopy)
anti-HTP-3	un dono di Abby F. Dernburg	MacQueen et al., 2005	Policlonale di pollo, 1:250 (SMLM), 1:1.000 (STED Microscopy)
Caenorhabditis elegans ceppo  YKM349	un dono di Yumi Kim	Hurlock et al., 2020	syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, estere NHS	Biotium	92139	Disciolto in DMSO in soluzione 1mM, aliquotato in volume monouso, congelato e mantenuto a -80 ° C
Vetro di copertura circolare 12 mm n. 1	Menzel-Glä Ser; VWR	631-0713
Vetro di copertura circolare 24 mm No. 1.5	Carl Roth	PK26.1
Lenti cilindriche	Thorlabs	LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Egg Buffer (10x)		Edgar 1995	250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Etanolo (assoluto per analisi)	Merck	64-17-5
F(ab')2 frammenti anti-pollo IgY	Jackson Immunoresearch	AB_2340347	asino policlonale, 1:100 (SMLM), 1:1.000 (STED Microscopy)
F(ab')2 frammenti anti-topo IgG	Jackson Immunoresearch	AB_2340761	asino policlonale, 1:100 (SMLM), 1:1.000 (STED Microscopia)
Fisherbrand Vetrini per microscopio T/F Macinato 0,8-1,0 mm di spessore	Fisher scientific	7107
Gauge Worm Pick 30 diametro 0,254 mm - Iridio 10%	Kisker	789265
Miscela di enzimi glucosio ossidasi/catalasi (GlOX/Cat )	un regalo di Jonas Ries	Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018	20x, 1916 U/mL glucosio ossidasi (Sigma G7141), 42350 U/mL catalasi (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glicerolo, acqua MilliQ. Immagazzinato a -20 °C.
Base tampone di imaging	un dono di Jonas Ries	Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018	50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucosio. Aliquotato in un volume monouso (950 μ L), congelato e mantenuto a -80 °C.
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON	Leica	N/A	Il microscopio è equipaggiato con il laser a luce bianca di ultima generazione, un laser STED pulsato da 775 nm, il modulo FALCON Fluorescence Lifetime IMaging, Obiettivo olio HC PL APO CS2 100x/1.40 e rivelatore Leica HyD X. Il sistema è in grado di utilizzare il modulo FLIM Tau-STED potenziato che misura la durata di fluorescenza specifica di un colorante ed è quindi in grado di rimuovere il segnale di fondo in base alle differenze nella durata di fluorescenza dei coloranti e alle condizioni del colorante nel campione. Inoltre, la risoluzione viene aumentata tenendo conto della variazione della durata della fluorescenza in diverse aree della ciambella di deplezione.
Filtro di emissione a canale a onde lunghe	AHF Analysentechnik	F47-702	700/100 nm passa-banda
Metanolo (assoluto per analisi)	Merck	67-56-1
NaHCO3	Sigma-Aldrich/Merck	S5761-500G	100 mM NaHCO3, pH 8.3
Laser accoppiato a fibra nel vicino infrarosso	Toptica	IBEAM-SMART-PT-CD	Design personalizzato, 808 nm - 75mW
Obiettivo con attacco piezoelettrico (PIFOC )	Physik Instrumente	P-726.1.CD	100 &; m gamma di corsa
Orca Fusion BT sCMOS camera	Hamamatsu	C15440-20UP
Provette PCR	Greiner Bio-One	673283	0,2 mL
di tampone salino fosfato (PBS 10x)		N/A	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4
Perforare il 16% di formaldeide (p/v), senza metanolo	ThermoFischer Scientific	28906	16% di formaldeide viene trasferito dalla fiala di vetro originale in una provetta da 1,5 ml e mantenuto a temperatura ambiente.
PlasmaPrep2 detergente al plasma	GaLa Instrumente GmbH	N/A
bromidrato di poli-L-lisina	Sigma-Aldrich/Merck	P2636-25MG	0,1% p/v è stato preparato in acqua Milli-Q e conservato in aliquote a -20 °C.
Dicroico primario (che riflette l'illuminazione)	AHF Analysentechnik	F73-866S	passa-banda quadruplo @ 405, 488, 561, 640
Filtro a tacca quadrupla	AHF Analysentechnik	F40-072	405/488/561/640 nm
Fotodiodo a quadrante (QPD)	Componenti laser	SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Lamette da barba	Apollo Herkenrath Solinger	N/A
Sagomatore di fascio rifrangente	AdlOptica	PiShaper 6_6_VIS
Reagente bloccante Roche La	Roche	11096176001	10x è stata preparata secondo le raccomandazioni. Le aliquote congelate sono state conservate a -20 °C.
Lama del bisturi (Feather brand #11, No. 3)	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1110911
Scatola per la rimozione del bisturi	Fisher scientific	10002-50
Dicroico secondario (riflettente l'emissione)	AHF Analysentechnik	F38-785S	750 nm passa-lungo
Filtro passa-corto	Semrock	BSP01-785R-25
Filtro di emissione a canale a onde corte	AHF Analysentechnik	F37-677	Microscopio per localizzazione di singole molecole passa-banda 676/37 nm
	EMBL Imaging Centre	Diekmann et al., 2020 con modifiche	Il microscopio fornisce un'epi-illuminazione a campo largo tramite un motore laser accoppiato a fibra monomodale, un laser booster aggiuntivo e un modellatore di fascio rifrangente per fornire un campo di illuminazione uniforme (Stehr et al, 2019). Le immagini widefield vengono acquisite con una fotocamera sCMOS. e un'ottica a relè appropriata per un ingrandimento del sistema di 61x e una dimensione dei pixel di 106 nm. Per l'imaging raziometrico di coloranti rossi lontani spettralmente sovrapposti, uno splitter di immagini produce due immagini spettralmente distinte sulla fotocamera (dicroico di scissione: 665 nm passa lungo, filtro di emissione del canale a onde corte: 676/37 nm passa banda, filtro di emissione a onde lunghe: 700/100 nm passa passa). Un ulteriore filtro quadnotch da 405/488/561/640 nm e un filtro passa-corto da 750 nm sono comuni ai due percorsi e forniscono un ulteriore blocco laser). Una lente cilindrica composta fornisce l'astigmatismo richiesto per l'imaging 3D. Per mantenere una messa a fuoco fissa durante le acquisizioni superiori a 2 ore di tempo (comprendenti 200.000 - 250.000 immagini), Il blocco della messa a fuoco è ottenuto dalla riflessione interna totale di un laser accoppiato a fibra nel vicino infrarosso. dal vetrino coprioggetti e successivo rilevamento sensibile all'altezza su un fotodiodo a quadrante (QPD). Il segnale QPD forniva un controllo ad anello chiuso della montatura piezoelettrica della lente dell'obiettivo. Per accedere a questo microscopio, fare riferimento a https://www.embl.org/about/info/imaging-centre o contattare ic-contact@embl.de
Motore multi-laser monomodale accoppiato a fibra	Toptica	iCHROME MLE-LFA-HP	Fornisce un'illuminazione epicromatica a campo largo di 100 mW a 405, 488, 561, 640 nm
Splitting dichroic	AHF Analysentechnik	F48-665SG	665 nm passaggio lungo
Vetro di copertura quadrato 22 x 22 mm No.1	Menzel-Glä Ser; VWR	630-2882
STAR 635P, estere NHS	Abberior	ST635P-0002-1MG	Disciolto in DMSO in 1 mM di soluzione, aliquotato in volume monouso, congelato e mantenuto a -80 ° C
Stereomicroscopio Stemi 305 Stand K LAB	Zeiss	N/A
tetramisole cloridrato	Sigma-Aldrich/Merck	T1512-2G	all'1% (p/v) è stata preparata in acqua Milli-Q. Le aliquote congelate sono state conservate a -20 °C. Le aliquote scongelate sono state conservate a 4 °C; C e utilizzato per diversi mesi.
Microsfere TetraSpeck	ThermoFischer Scientific	T7279	0,1 µ m, blu/verde/arancione/rosso scuro fluorescente
Tris Saline Buffer (TBS 10x)		N/A	200 mM Tris-HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5
TWEEN 20	Sigma-Aldrich/Merck	P9416-50ML	Conservato a temperatura ambiente nella confezione originale.
WormStuff plettro per vermi	Kisker	789277
tavolino per microscopio XY	Colonna di	N/A	Custom Design
Zeba Micro Spin	ThermoFischer Scientific	89877	7K MWCO, 75 e micro; L