Articolo metodologico

Screening della cardiotossicità ad alto rendimento utilizzando monostrati di cardiomiociti pluripotenti indotti da cellule staminali umane mature

DOI:

10.3791/64364

⸱

24 marzo 2023

 ,  ,  ,  , 
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CM) offrono un'alternativa all'uso di animali per lo screening preclinico della cardiotossicità. Una limitazione all'adozione diffusa di hiPSC-CMs nello screening preclinico della tossicità è il fenotipo immaturo e fetale delle cellule. Qui sono presentati protocolli per la maturazione robusta e rapida delle hiPSC-CM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I cardiomiociti derivati da cellule staminali indotte umane (hiPSC-CM) sono utilizzati per sostituire e ridurre la dipendenza da animali e cellule animali per i test di cardiotossicità preclinica. Nei formati monostrato bidimensionali, le hiPSC-CM ricapitolano la struttura e la funzione delle cellule muscolari cardiache umane adulte quando coltivate su una matrice extracellulare ottimale (ECM). Una ECM (matrice extracellulare che induce la maturazione-inducendo la maturazione (MECM) derivata da cellule staminali perinatali umane matura la struttura, la funzione e lo stato metabolico dell'hiPSC-CM in 7 giorni dopo la placcatura.

Anche i monostrati maturi di hiPSC-CM rispondono come previsto a farmaci clinicamente rilevanti, con un rischio noto di causare aritmie e cardiotossicità. La maturazione dei monostrati hiPSC-CM è stata un ostacolo all'adozione diffusa di queste preziose celle per la scienza normativa e lo screening di sicurezza, fino ad ora. Questo articolo presenta metodi convalidati per la placcatura, la maturazione e la fenotipizzazione funzionale ad alto rendimento della funzione elettrofisiologica e contrattile hiPSC-CM. Questi metodi si applicano ai cardiomiociti purificati disponibili in commercio, nonché ai cardiomiociti derivati da cellule staminali generati internamente utilizzando protocolli di differenziazione altamente efficienti e specifici per camera.

La funzione elettrofisiologica ad alto rendimento viene misurata utilizzando coloranti sensibili alla tensione (VSD; emissione: 488 nm), fluorofori sensibili al calcio (CSF) o sensori di calcio geneticamente codificati (GCaMP6). Un dispositivo di mappatura ottica ad alta produttività viene utilizzato per le registrazioni ottiche di ciascun parametro funzionale e un software dedicato personalizzato viene utilizzato per l'analisi dei dati elettrofisiologici. I protocolli MECM sono applicati per lo screening dei farmaci utilizzando un inotropo positivo (isoprenalina) e bloccanti specifici del gene umano Ether-a-go-go-related (hERG). Queste risorse consentiranno ad altri ricercatori di utilizzare con successo hiPSC-CM maturi per lo screening preclinico della cardiotossicità ad alto rendimento, i test di efficacia dei farmaci cardiaci e la ricerca cardiovascolare.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-CM) sono stati convalidati su scala internazionale e sono disponibili per lo screening cardiotossicologico in vitro 1. Gli hiPSC-CM altamente puri possono essere generati in numero virtualmente illimitato, crioconservati e scongelati. Dopo la riplaccatura, si rianimano e iniziano a contrarsi con un ritmo che ricorda il cuore umano 2,3. Sorprendentemente, i singoli hiPSC-CM si accoppiano tra loro e formano sincizia funzionale che batte come un singolo tessuto. Al giorno d'oggi, le hiPSC sono abitualmente derivate da campioni di sangue dei pazienti, quindi qualsiasi persona può essere rappresentata utilizzando saggi di screening della cardiotossicità hiPSC-CM in vitro 4,5. Ciò crea l'opportunità di eseguire "Clinical Trials in a Dish", con una rappresentanza significativa di diverse popolazioni6.

Un vantaggio critico rispetto agli attuali approcci di screening della cardiotossicità su animali e cellule animali è che gli hiPSC-CM utilizzano l'intero genoma umano e offrono un sistema in vitro con somiglianze genetiche con il cuore umano. Ciò è particolarmente interessante per la farmacogenomica e la medicina personalizzata: si prevede che l'uso di hiPSC-CM per lo sviluppo di farmaci e altre terapie fornisca prescrizioni di farmaci più accurate, precise e sicure. Infatti, i saggi monostrato bidimensionali (2D) hiPSC-CM hanno dimostrato di essere predittivi della cardiotossicità dei farmaci, utilizzando un pannello di farmaci clinicamente usati con un rischio noto di causare aritmie 1,7,8,9. Nonostante il vasto potenziale delle hiPSC-CM e la promessa di semplificare e rendere lo sviluppo di farmaci più economico, c'è stata una riluttanza a utilizzare questi nuovi saggi10,11,12.

Fino ad ora, uno dei principali limiti dell'adozione diffusa e dell'accettazione dei test di screening hiPSC-CM è il loro aspetto immaturo, simile al feto, così come la loro funzione. La questione critica della maturazione dell'hiPSC-CM è stata rivista e dibattuta nella letteratura scientifica fino alla nausea13,14,15,16. Allo stesso modo, sono stati impiegati molti approcci per promuovere la maturazione dell'hiPSC-CM, comprese le manipolazioni della matrice extracellulare (ECM) nei monostrati 2D e lo sviluppo di tessuti cardiaci ingegnerizzati 3D (EHT)17,18. Al momento, c'è una convinzione diffusa che l'uso di EHT 3D fornirà una maturazione superiore rispetto agli approcci basati su monostrato 2D. Tuttavia, i monostrati 2D offrono una maggiore efficienza nell'utilizzo delle celle e un maggiore successo nella placcatura rispetto agli EHT 3D; Gli EHT 3D utilizzano un numero maggiore di celle e spesso richiedono l'inclusione di altri tipi di cellule che possono confondere i risultati. Pertanto, in questo articolo, l'attenzione si concentra sull'utilizzo di un metodo semplice per maturare hiPSC-CM coltivati come monostrati 2D di cellule accoppiate elettricamente e meccanicamente.

La maturazione avanzata di hiPSC-CM può essere ottenuta in monostrati 2D utilizzando un ECM. I monostrati 2D di hiPSC-CMs possono essere maturati utilizzando un coprislip morbido e flessibile in polidimetilsilossano, rivestito con matrice di membrana basale secreta da una cellula di sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM di topo). Nel 2016, i rapporti hanno mostrato che le hiPSC-CM coltivate su questa condizione di ECM morbida sono maturate funzionalmente, mostrando velocità di conduzione del potenziale d'azione vicino ai valori cardiaci adulti (~ 50 cm / s)18. Inoltre, questi hiPSC-CM maturi hanno mostrato molte altre caratteristiche elettrofisiologiche che ricordano il cuore adulto, tra cui il potenziale di membrana a riposo iperpolarizzato e l'espressione di Kir2.1. Più recentemente, i rapporti hanno identificato un rivestimento ECM derivato da cellule staminali perinatali umane che promuove la maturazione strutturale di 2D hiPSC-CMs19. Qui vengono presentati metodi facili da usare per sviluppare strutturalmente i monostrati 2D hiPSC-CM per l'uso in schermi elettrofisiologici ad alta produttività. Inoltre, forniamo la validazione di uno strumento di mappatura ottica per l'acquisizione e l'analisi automatizzata della funzione elettrofisiologica monostrato 2D hiPSC-CM, utilizzando coloranti sensibili alla tensione (VSD) e sonde e proteine sensibili al calcio.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'utilizzo di hiPSC in questo protocollo è stato approvato dal Comitato HPSCRO dell'Università del Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Vedere la tabella dei materiali per un elenco di materiali e attrezzature. Vedi Tabella 1 per i supporti e le loro composizioni.

1. Scongelamento e placcatura di hiPSC-CM crioconservate disponibili in commercio per la maturazione su una matrice extracellulare che induce maturazione (MECM)

  1. Riscaldare tutti i reagenti a temperatura ambiente e reidratare le piastre MECM con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) o soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente calcio e magnesio, per 1 ora prima della placcatura cardiomiocitaria (200 μL di tampone per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti).
  2. Lavare le piastre MECM 2x con HBSS o PBS contenenti calcio e magnesio per 1 ora prima della placcatura cardiomiocitaria (200 μL di tampone per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti) e mantenere i pozzetti idratati.
  3. Preparare un bagno d'acqua a 37 °C.
  4. Rimuovere i tubi cardiomiocitari dal serbatoio di azoto liquido, trasferire i tubi in ghiaccio secco e aprire leggermente i tappi del tubo per rilasciare la pressione.
    NOTA: Rilasciare la pressione nei tubi è estremamente importante! Se si accumula troppa pressione all'interno dei tubi, potrebbero esplodere.
  5. Richiudere i tappi del tubo e metterli a bagnomaria per scongelare per 4 minuti.
    NOTA: Lasciare che si scongelano completamente, per evitare danni alle cellule dovuti a scongelamento parziale.
  6. Dopo che le cellule si sono scongelate, spruzzare i tubi con etanolo al 70% prima di aprire. Trasferire le celle in tubi conici da 15 mL con una pipetta da 1 mL. Gocciolare lentamente 8 ml di terreno di placcatura, agitando il tubo ogni volta che viene aggiunto 1 ml, per consentire alle cellule di adattarsi ai cambiamenti di osmolarità.
    1. Lavare il crioviale con 1 mL di terreno di placcatura utilizzando una pipetta di vetro da 1 mL. Quindi, gocciolare lentamente il lavaggio nel tubo conico da 15 ml.
  7. Centrifugare i tubi a ~300 × g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno galvanico. Rimuovere un'aliquota ed eseguire il conteggio delle cellule vive con un emocitometro. Aggiungere ulteriore mezzo di placcatura per ottenere 7,5 × 105 celle/ml.
    NOTA: Sono necessari circa 10 ml di sospensione cellulare per preparare 96 pozzetti.
  8. Erogare 100 μL di sospensione cellulare per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti rivestita in MECM utilizzando una pipetta multicanale.
    NOTA: Assicurarsi di evitare la precipitazione cellulare e ottenere una densità cellulare uniforme in tutti i pozzetti durante la placcatura.
  9. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 2 giorni prima di cambiare il terreno in mezzo di mantenimento (200 μL/pozzetto). Cambiare il mezzo di manutenzione il giorno 5 dopo lo scongelamento. Eseguire i saggi EP il giorno 7 o successivo, come descritto in precedenza 8,9. Cambiare il terreno a giorni alterni quando si opta per l'estensione della coltura cellulare.

2. differenziazione diretta da hiPSC cardiaca e purificazione hiPSC-CM

  1. Soluzione calda di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) disponibile in commercio, HBSS senza calcio e magnesio (HBSS --) e piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice di membrana basale solubilizzata secreta da una cellula di sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM di topo) a temperatura ambiente.
  2. Marcare le colonie differenziate mediante microscopia a contrasto di fase e aspirare/ablare. Lavare ogni pozzetto con 1 mL di HBSS--. Eseguire due lavaggi in pozzetti contenenti >10 punti di differenziazione.
  3. Aspirare l'HBSS e aggiungere 1 mL di soluzione EDTA a ciascun pozzetto. Incubare le piastre per un massimo di 5 minuti a 37 °C. Controlla le piastre dopo 3 minuti e cerca colonie bianche traslucide e visibili.
  4. Aspirare la soluzione EDTA e aggiungere 1 mL in un singolo pozzetto. Rimuovere le cellule con 2 mL di mezzo hiPSC pipettando ripetutamente la sospensione su e giù, utilizzando una pipetta di vetro da 10 mL per staccare tutte le cellule staminali dal pozzetto e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di raccolta. Ripetere l'aspirazione e lo spostamento con i pozzi successivi.
    NOTA: rimuovere le colonie difficili da sollevare con la punta della pipetta di vetro.
  5. Contare le cellule staminali e regolare il volume sulla piastra 8,0 × 105 celle/pozzetto. Coltura delle cellule su terreno hiPSC (2 ml/pozzetto) fino a quando le cellule staminali raggiungono il 90% di confluenza (questa volta è indicato d'ora in poi come D0).
  6. Preparare 2 ml di terreno di differenziazione basale integrato con 4 μM di CHIR99021.
  7. Su D0, lavare ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti di cellule staminali con 1 mL di HBSS per pozzetto. Sostituire l'HBSS con un mezzo di differenziazione basale integrato con 4 μM di CHIR99021.
  8. Su D1, non fare nulla.
  9. Su D2, preparare il terreno di differenziazione basale integrato con 4 μM di IWP4.
  10. Sostituire il mezzo con 2 ml di terreno di differenziazione basale integrato con IWP4 per pozzetto.
  11. Su D3, non fare nulla per una differenziazione ventricolare-specifica. Per una differenziazione atriale-specifica, aspirare il mezzo e aggiungere 2 ml di mezzo basale integrato con 4 μM di soluzione di IWP4 e 1 μM di acido retinoico (RA) per pozzetto.
  12. Su D4, aspirare il mezzo e aggiungere 2 ml di mezzo basale per pozzetto per la differenziazione ventricolare. Per una differenziazione atriale, aspirare il mezzo e aggiungere 2 ml di mezzo basale integrato con una soluzione RA da 1 μM per pozzetto.
  13. Su D5, non fare nulla.
  14. Su D6, aspirare il mezzo e aggiungere 2 ml di mezzo basale per pozzetto (sia per differenziazione atriale che ventricolare).
  15. Su D7, non fare nulla.
  16. Su D8, aspirare il mezzo e aggiungere 2 ml di terreno di mantenimento dei cardiomiociti. Cambiare il mezzo a giorni alterni fino alla separazione cellulare o seguire un piano di esposizione cronica ai farmaci.

3. purificazione hiPSC-CM tramite MACS (selezione cellulare attivata magneticamente)

  1. Aspirare il terreno di coltura cellulare e lavare ogni pozzetto con 1 mL di HBSS--. Dissociare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina/EDTA allo 0,25% e incubando a 37 °C, 5% CO2 per 10 minuti. Risospendere e singolarizzare le cellule in ciascun pozzetto con 2 ml di terreno di placcatura per inattivare la tripsina/EDTA.
  2. Raccogliere le cellule dai sei pozzetti in un tubo conico da 50 ml con un filtro da 70 μm. Quindi, lavare il colino con 3 ml di terreno di placcatura. Contare le celle.
  3. Centrifugare la sospensione a ~300 × g per 5 min. Aspirare il surnatante e lavare le celle con 20 ml di tampone di separazione MACS ghiacciato. Quindi, centrifugare di nuovo a ~300 × g per 5 minuti.
  4. Risospendere il pellet in 80 μL di tampone di separazione MACS freddo per 5 × 106 celle. Aggiungere 20 μL di cocktail freddo di deplezione non cardiomiocitaria (umano) per 5 × 106 cellule. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e incubare su ghiaccio per 10 minuti.
  5. Lavare il campione aggiungendo 4 ml di tampone di separazione MACS freddo per 5 × 106 celle. Centrifugare il campione a ~300 × g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
  6. Risospendere il pellet in 80 μL di tampone di separazione MACS freddo per 5 × 106 celle. Aggiungere 20 μL di microsfere anti-biotina fredde per 5 × 106 cellule. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e incubare per 10 minuti su ghiaccio.
  7. Durante l'incubazione dei campioni, posizionare le colonne di esaurimento positivo (dotate dei filtri di pre-separazione da 30 μm) sul separatore MACS e posizionare i tubi di raccolta da 15 ml etichettati sotto le colonne. È necessaria una colonna ogni 5 × 106 celle.
  8. Innesca ogni colonna con 3 ml di buffer di separazione MACS freddo. Mescolare la sospensione cellulare trattata con anticorpi con 2 ml di tampone di separazione MACS per 5 × 106 cellule e aggiungere alla colonna.
    NOTA: Non centrifugare! La centrifugazione in questa fase ha effetti dannosi sulla resa dei cardiomiociti.
  9. Aggiungere 2 mL di tampone di separazione MACS a ciascuna colonna e raccogliere il flowthrough fino a raccogliere 12 mL di sospensione cardiomiocitaria flowthrough.
    NOTA: Non lasciare mai asciugare completamente le colonne.
  10. Centrifugare i cardiomiociti a ~300 × g per 5 minuti, scartare il surnatante e sospendere i cardiomiociti in 1 ml di terreno di placcatura.
  11. Contare le celle per determinare la concentrazione, regolare il volume alla densità di semina desiderata e placcare le celle. Placcare i cardiomiociti purificati sulle piastre MECM a 96 pozzetti, come descritto sopra nei punti 1.9-1.11 (7,5 × 105 cellule/pozzetto).

4. Mappatura ottica mediante coloranti sensibili alla tensione (VSD) e fluorofori sensibili al calcio (CSF)

  1. Preparare la quantità appropriata di VSD in HBSS con calcio e magnesio, aggiungendo 1 μL di colorante VSD per mL di HBSS e 10 μL di adiuvante di carico per mL di HBSS.
    NOTA: In genere, una piastra a 96 pozzetti richiede 10 ml di soluzione VSD.
  2. In alternativa, preparare HBSS con calcio e magnesio integrati con 5 μM di CSF. Aspirare il mezzo di mantenimento dei cardiomiociti e sostituirlo con 100 μL di VSD o CSF per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Incubare le cellule per 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare.
  3. Rimuovere i coloranti e sostituirli con il mezzo di analisi o HBSS. Equilibrate a 37 °C per l'acquisizione della mappatura ottica dei dati di base con un dispositivo di mappatura ottica ad alta produttività.
  4. Trattare le cellule con farmaci per test di esposizione acuta o mappare le cellule che sono state cronicamente esposte a farmaci di interesse.
  5. Per i test di cardiotossicità in piastre a 96 pozzetti, utilizzare quattro dosi di un composto con almeno sei pozzetti per dose. Utilizzare dosi comprese tra il basso e al di sopra della concentrazione plasmatica terapeutica efficace, compresa una dose della concentrazione plasmatica terapeutica efficace clinica.
  6. Diluire i farmaci in dimetilsolfossido, conservarli come soluzioni madre a -20 °C e quindi diluirli in HBSS alle concentrazioni desiderate.
  7. Effettuare misurazioni elettrofisiologiche al basale prima dell'applicazione del farmaco, come descritto nel paragrafo 5. Una volta che i farmaci sono stati applicati, effettuare registrazioni elettrofisiologiche almeno 30 minuti dopo per gli studi cronici. Vedere le sezioni seguenti per le procedure di acquisizione e analisi dei dati di mappatura ottica.

5. Mappatura ottica mediante indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI)

  1. Piastre disponibili in commercio o hiPSC-CM purificate con MACS, come descritto sopra, utilizzando piastre a 96 pozzetti rivestite in MECM per realizzare hiPSC-CM mature. Per formare monostrati confluenti, piastra 7,5 × 104 CM per pozzetto di ogni piastra da 96 pozzetti. Utilizzare il mezzo di placcatura.
  2. Dopo 48 ore in mezzo di placcatura, passare al mezzo di mantenimento dei cardiomiociti.
  3. Il giorno 4 dopo lo scongelamento e la riplaccatura, aggiungere adenovirus ricombinante per esprimere GCaMP6m (AdGCaMP6m) alle cellule a una molteplicità di infezione (MOI) = 5. Aggiungere il virus utilizzando il mezzo di analisi CM.
    NOTA: Qui, gli esperimenti che utilizzano GCaMP6m sono stati eseguiti in cardiomiociti iCell2 da un fornitore commerciale.
  4. Il giorno 5, rimuovere il terreno adGCaMP6m e sostituirlo con un nuovo RPMI + B27 (mezzo di mantenimento dei cardiomiociti).
  5. Il giorno 7, osservare le CM utilizzando la microscopia o l'imager di mappatura ottica, per visualizzare le contrazioni spontanee e i corrispondenti transitori di calcio.
  6. Il giorno 7 o successivo, per lo screening dei farmaci, trasferire direttamente le piastre a 96 pozzetti di monostrati hiPSC-CM maturi che esprimono GCaMP6m all'imager di mappatura ottica dall'incubatore per l'acquisizione dei dati di base.
  7. Dopo l'acquisizione dei dati elettrofisiologici, restituire le piastre delle CM all'incubatore di coltura tissutale, per le misurazioni su un successivo punto temporale.
  8. Dopo le registrazioni di base, applicare i farmaci, utilizzando almeno quattro dosi di ciascun farmaco e almeno sei pozzetti per dose. Equilibrare i farmaci sulle cellule per almeno 30 minuti prima della raccolta dei dati. Riscaldare la temperatura del pozzo a ~37 °C prima e durante l'acquisizione dei dati.
  9. Dopo le registrazioni basali di un'intera piastra, aggiungere isoproterenolo (500 nM) a ciascun pozzetto per consentire dati di risposta al farmaco affidabili. Quantificare gli effetti dell'isoproterenolo sulla frequenza di battito monostrato, sull'ampiezza della contrazione (ampiezza transitoria del calcio) e sulla durata dei transitori di calcio (vedere Figura 6), come descritto nel paragrafo 5.

6. Acquisizione di dati cartografici ottici e analisi

  1. Assicurarsi che la fotocamera, il transilluminatore e il riscaldatore del dispositivo di mappatura ottica siano accesi.
  2. Aprire il software di acquisizione e determinare la posizione di salvataggio dei file.
  3. Aprire il cassetto anteriore e posizionare la piastra sul riscaldatore a piastre.
  4. Acquisisci una cornice scura facendo clic sul pulsante Cornice scura .
  5. Selezionare Durata (10-30 s) e Frequenza fotogrammi di acquisizione (ad esempio, 100 fps; 250 fps per una risoluzione temporale più elevata) e fare clic su Avvia acquisizione.
  6. Aprire il software di analisi e, nella scheda Importa/Filtro , selezionare Cerca un singolo file o Affianca multiplo per ricostruire una lastra.
  7. Selezionare Modalità parametro (APD o CaTD), immettere Distanza per pixel e utilizzare la Creazione guidata pozzo per determinare la posizione dei pozzi nell'immagine. Fare clic su Elabora salvataggio per passare alla scheda successiva.
  8. Apri la scheda ROI (regioni di interesse) e scegli di disegnare i ROI manualmente, automaticamente o non utilizzare affatto i ROI, che considererebbero quindi l'intero pozzo per l'analisi. Dopo aver selezionato i ROI, fare clic sul pulsante Elabora/Salva per passare al passaggio successivo. Seleziona Nascondi pozzetti e Mostra solo caselle filtrate per visualizzare i ROI.
  9. Apri la scheda Analisi e, nella parte in alto a destra dello schermo, seleziona ciascun pozzo o ROI per confermare l'accuratezza del rilevamento automatico dei battiti. Aggiungete o rimuovete battute dalle tracce premendo Aggiungi battuta/Salva battute oppure selezionando una battuta individuale e premendo Canc sulla tastiera.
  10. Facoltativamente, utilizzare la funzione Mappe di calore medie per creare mappe di calore dei parametri selezionati per la piastra.
  11. Fare clic sul pulsante Grafico spazio-temporale nella scheda Analisi per visualizzare i dati per ciascun pozzo o il ROI. Dopo esserti assicurato che il rilevamento dei battiti sia accurato, vai alla scheda Esporta e seleziona Formato file. Premere Esporta e creare una cartella in cui esportare i dati. Procedere all'apertura dei file di dati ed eseguire la routine di analisi statistica scelta.
    NOTA: i file .xlxs sono preferiti in quanto tutti i parametri vengono esportati in un unico file; Altri formati (.csv o TSV) generano un file per parametro.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maturazione hiPSC-CM caratterizzata da contrasto di fase e imaging confocale immunofluorescente
La tempistica per la maturazione mediata da ECM di hiPSC-CM disponibili in commercio utilizzando piastre a 96 pozzetti rivestite MECM è presentata nella Figura 1A. Questi dati vengono raccolti utilizzando cardiomiociti disponibili in commercio che arrivano in laboratorio come fiale crioconservate di cellule. Ogni flaconcino contiene >5 × 106 cardiomiociti vitali. ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esistono diversi approcci allo screening della cardiotossicità in vitro utilizzando hiPSC-CMs. Un recente documento "Best Practices" sull'uso di hiPSC-CMs ha presentato i vari saggi in vitro , le loro letture primarie e, soprattutto, la granularità di ciascun test per quantificare la funzione elettrofisiologica cardiaca umana20. Oltre all'utilizzo di elettrodi perforanti a membrana, la misura più diretta della funzione elettrofisiologica cardiaca umana è fornita dai VSD. Le lettu...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TJH è consulente e consulente scientifico di StemBioSys, Inc. TB è un dipendente di StemBioSys, Inc. AMR e JC sono ex consulenti di StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR e JC sono azionisti di StemBioSys, Inc.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH HL148068-04 e R44ES027703-02 (TJH).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina EDTAGibco25200-056
0,5 mg/mL BSA (7,5 µ mol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumina umanaSigmaA9731-1G
alfa anticorpo actinaThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Terreno di prova trasparente (fluorobrite)ThermoFisherA1896701Per adenovirus per trasduzione
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (siero fetale bovino)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM mezzi di manutenzioneFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenoloMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idratoSigmaA8960-5g
L-glutamminaGibcoA2916801
colonne LSMiltenyii Biotec130-042-401
Buffer MACS (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Microscopio confocale Nikon A1RAminoacidi non essenziali Nikon
Gibco11140-050
Miltenyii Biotec130-041-407
Kit di isolamento dei cardiomiociti derivati da PSC, umanoMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separatore (Magnete)Miltenyii Biotec130-091-051
Acido retinoicoSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutammina)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
Anticorpo TnI (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (acido etilendiamminotetraacetico - soluzione EDTA)Gibco15040-066
Y-27632 dicloridratoTocris1254
β-mercaptoetanoloGibco21985023
Filtro di pre-separazione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834(2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638(2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071(2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941(2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368(2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cardiomiociti da HiPSCCultura in monostratoMatrice extracellulareMappatura otticaAnalisi elettrofisiologicaImaging del calcioSelezione cellulare magneticaTest di risposta ai farmaciMisurazione del potenziale d azione

Articoli correlati