Ordinamento negativo dei neuroni dei nuclei attivati dalla fluorescenza combinato con il sequenziamento dell'RNA dei singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo

Sommario

Presentato qui è un metodo per sequenziare singoli nuclei isolati dal giro dentato del topo che esclude la maggior parte dei neuroni attraverso l'ordinamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FAN). Questo approccio genera profili di espressione di alta qualità e facilita lo studio della maggior parte degli altri tipi di cellule rappresentati nella nicchia, comprese le popolazioni scarse come le cellule staminali neurali.

Abstract

La neurogenesi ippocampale adulta (AHN), che consiste nel mantenimento permanente delle cellule staminali neurali proliferative e quiescenti (NSC) all'interno della zona subgranulare (SGZ) del giro dentato (DG) e nella loro differenziazione dai neuroni appena nati in cellule granulari nello strato cellulare del granulo, è ben convalidata in numerosi studi. L'utilizzo di animali geneticamente modificati, in particolare roditori, è uno strumento prezioso per studiare le vie di segnalazione che regolano l'AHN e per studiare il ruolo di ciascun tipo di cellula che compone la nicchia neurogena dell'ippocampo. Per affrontare quest'ultimo, i metodi che combinano l'isolamento di singoli nuclei con il sequenziamento di prossima generazione hanno avuto un impatto significativo nel campo dell'AHN per identificare le firme geniche per ciascuna popolazione cellulare. È tuttavia necessario perfezionare ulteriormente queste tecniche per profilare fenotipicamente popolazioni cellulari più rare all'interno della DG. Qui, presentiamo un metodo che utilizza il Fluorescence Activated Nuclei Sorting (FANS) per escludere la maggior parte delle popolazioni neuronali da una sospensione di singoli nuclei isolata da DG appena sezionata, selezionando nuclei non colorati per l'antigene NeuN, al fine di eseguire il sequenziamento dell'RNA di singoli nuclei (snRNA-seq). Questo metodo è un potenziale trampolino di lancio per studiare ulteriormente la regolazione intercellulare dell'AHN e per scoprire nuovi marcatori e meccanismi cellulari tra le specie.

Introduzione

La generazione continua di neuroni ippocampali in età adulta, nota anche come neurogenesi ippocampale adulta (AHN), è associata a funzioni cognitive come l'apprendimento, l'acquisizione / cancellazione della memoria e la separazione dei modelli e sembra essere un importante meccanismo di resilienza nell'invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative per prevenire i deficit cognitivi ^1,2,3 . I roditori sono stati il modello di scelta per studiare l'AHN utilizzando diversi metodi, tra cui l'immunocitochimica e i metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS). La traduzione di questi risultati in altre specie rimane controversa. In effetti, l'AHN è stato osservato nella maggior parte delle specie, ma la misura in cui persiste per tutta la vita, in particolare negli esseri umani 4,5,6,7,8^, è regolarmente dibattuta.

Ad oggi, varie vie di segnalazione intrinseche ed estrinseche sono state confermate per modulare AHN¹. Tuttavia, l'impatto della comunicazione intercellulare sull'AHN sta appena emergendo⁹. Ciò potrebbe essere attribuito in primo luogo all'insufficiente specificità dei marcatori cellulari attualmente noti per condurre analisi in vivo con animali geneticamente modificati. In effetti, molti studi si sono basati su marcatori come la doppia cortina o la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) che sono espressi in più tipi di cellule¹. In secondo luogo, la complessità e l'alto grado di diversità cellulare nella nicchia¹⁰ dell'ippocampo adulto comporta sfide tecniche per profilare ogni tipo di cellula. Ciò è particolarmente vero per l'analisi bioinformatica con marcatori cellulari sovrapposti utilizzati nelle pipeline analitiche per diverse popolazioni, come le NSC o le cellule gliali, con conseguenti conclusioni controverse nella valutazione dell'AHN ^7,11. In terzo luogo, il vasto numero di neuroni mina lo studio di popolazioni cellulari meno abbondanti, come astrociti, oligodendrociti o cellule ependimali, anche se il loro ruolo nella regolazione fine dell'AHN sta diventando prominente⁹. Insieme, queste limitazioni influiscono sulla capacità di tradurre i risultati dai roditori ad altre specie. Ciò è particolarmente amplificato dalla difficoltà di ricapitolare in vitro un tessuto complesso, come la nicchia neurogena ippocampale, e dai numerosi ostacoli all'accesso a tessuti di alta qualità insieme alla mancanza di protocolli standardizzati per il trattamento dei tessuti negli studi che coinvolgono tessuti umani^12,13. È quindi fondamentale sviluppare nuovi approcci per profilare le popolazioni cellulari e identificare nuovi marcatori cellulari all'interno del giro dentato (DG) che alla fine porteranno a una migliore comprensione dei diversi contributi di ciascun tipo di cellula alla regolazione dell'AHN.

Per raggiungere questo obiettivo, l'isolamento di singole cellule (sc) e singoli nuclei (sn) combinato con il sequenziamento dell'RNA è diventato strumentale per studiare tessuti complessi come il DG¹⁴. Pertanto, le strategie di arricchimento cellulare per isolare singole cellule dalla nicchia ippocampale adulta del topo sono state eseguite principalmente per esaminare le NSC^15,16. Un'interessante strategia per arricchire le cellule non neuronali del DG è stata applicata sequenziando le singole cellule singole doppie negative GluR1/Cd24 che hanno portato alla sequenziazione di 1.408 cellule senza cluster distinti tra astrociti e NSC dopo analisi bioinformatica¹⁷. Ciò potrebbe essere dovuto alla dura digestione enzimatica richiesta per la preparazione di singole cellule che danneggia l'integrità cellulare e l'RNA. Per aggirare questo problema tecnico, sono stati sviluppati diversi metodi che utilizzano invece l'isolamento di singoli nuclei e sono particolarmente adatti per tessuti complessi^11,18. Tuttavia, la predominanza di neuroni all'interno del DG o più in generale all'interno del sistema ippocampale-entorinale genera un bias di campionamento per studiare la totalità delle popolazioni cellulari presenti all'interno di queste aree cerebrali. Inoltre, il numero limitato di celle da caricare per la preparazione di librerie di singole cellule accentua la presenza della maggior popolazione cellulare in pipeline analitiche di singoli nuclei sequenziati. Infatti, i grandi cluster neuronali sono spesso annotati e analizzati mentre altre popolazioni cellulari sono sottorappresentate o mancate ^5,11.

Nel tentativo di superare questi pregiudizi e di essere in grado di profilare tipi di cellule diversi dai neuroni presenti nel DGG del topo, in questo studio è stato ideato un metodo che utilizza il principio del Fluorescence Activated Nuclei Sorting (FANS)¹⁸ che esclude la maggior parte delle popolazioni neuronali mediante selezione negativa di singoli nuclei colorati con antigene nucleare neuronale (NeuN, conosciuto anche come Rbfox3). Questa scelta dell'antigene è stata guidata dalla letteratura che descrive NeuN come un marcatore neuronale affidabile¹⁹ e dalla necessità di utilizzare una proteina nucleare per questo approccio. Le cellule classificate FACS neuN-negative sono state quindi preparate per il sequenziamento dell'RNA su una piattaforma genomica 10x. I risultati dimostrano che l'esclusione delle cellule che esprimono NeuN consente un profilo trascrittomico specifico per tipo cellulare e di alta qualità delle popolazioni cellulari gliali e rare.

Protocollo

La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida del Francis Crick Institute, nonché le linee guida e le leggi del Ministero degli Interni del Regno Unito.

Figura 1: Preparazione di una sospensione di singoli nuclei dal DG sezionato di topi adulti per snRNA-seq di popolazioni non neuronali. Diagramma di flusso che descrive le fasi principali del protocollo che includono la dissezione del DG, la preparazione di una sospensione di singoli nuclei, l'immunocolorazione NeuN e il sequenziamento negativo di NeuN-FANS prima di procedere con snRNA-seq. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Dissezione della DG (tempistica: 15 min)

1. Preparare i mezzi di isolamento dei nuclei 1 e 2 (NIM1 e NIM2), il tampone di omogeneizzazione (HB) e i terreni di lavaggio (WM) (Tabella supplementare 1). Posizionare tutti i tamponi, i supporti, i reagenti e gli strumenti sul ghiaccio fino al momento del bisogno. Mettere l'omogeneizzatore Dounce (vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio durante la preparazione (minimo 1 ora prima della fase di omogeneizzazione).
   NOTA: NIM1 può essere preparato e conservato a 4 °C per un massimo di 6 mesi. NIM2, HB e WM dovrebbero essere preparati al momento.
   ATTENZIONE: Manipolare con cura DTT, l'inibitore della proteasi e Triton X-100. Questi composti sono irritanti per la pelle e gli occhi, acutamente tossici e pericolosi per l'ambiente acquatico. Durante l'utilizzo di queste sostanze chimiche, indossare guanti protettivi, indumenti, protezione per occhi e viso, lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione ed evitare il rilascio nell'ambiente.
2. Eutanasia di un topo maschio C57Bl/6J di 22 mesi mediante lussazione cervicale seguendo la procedura²⁰ del Ministero degli Interni Schedule 1.
   NOTA: vedere la discussione per la logica relativa all'uso del topo di 22 mesi in questo studio. Tuttavia, questo protocollo può essere eseguito a qualsiasi età per tutta la durata della vita.
3. Sezionare il cervello da un topo eutanasia e trasferirlo in una capsula di Petri di 10 cm riempita con 1x PBS ghiacciato (Figura 1). Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio. Rimuovere il cervelletto usando un bisturi e tagliare il cervello a metà tra i due emisferi (lungo l'asse sagittale).
4. Riempire una nuova capsula di Petri da 10 cm con PBS ghiacciato e posizionarla sul ghiaccio. Trasferire una metà del cervello nella nuova capsula di Petri. Usando il binocolo, sezionare il DG e ripetere questo passaggio per ottenere il secondo DG dalla seconda metà del cervello.
   NOTA: questi passaggi (passaggi 1.2-1.4) sono stati adattati da una procedura²¹ descritta in precedenza. È importante procedere il più rapidamente possibile in questa fase per preservare l'integrità delle cellule.
5. Trasferire i due DG nell'omogeneizzatore Dounce preraffreddato e aggiungere 1 mL di HB freddo.

2. Dissociazione tissutale, isolamento di singoli nuclei e immunocolorazione anti-NeuN (Tempistica: 2 ore)

1. Omogeneizzare il tessuto con 10 colpi del pestello "A" sciolto, seguito da 15 colpi del pestello stretto "B".
   NOTA: L'omogeneizzazione Dounce deve essere eseguita con la malta su ghiaccio con colpi delicati per ridurre il calore causato dall'attrito e dalla formazione di schiuma. Tutti i tamponi e le attrezzature devono essere preraffreddati e tenuti sul ghiaccio durante la procedura.
2. Trasferire l'omogenato in un tubo prerefrigerato da 15 ml; sciacquare l'omogeneizzatore Dounce con 1 mL di HB freddo e combinarlo nello stesso tubo. Aggiungere 3 mL di HB al tubo da 15 mL e incubare 5 minuti su ghiaccio. Mescolare 2x capovolgendo delicatamente il tubo.
3. Pre-bagnare un tappo filtrante da 70 μm con 0,5 mL di HB su una provetta da 50 ml. Filtrare la sospensione dei nuclei dal punto 2.2 rovesciando delicatamente il tubo da 15 mL nel filtro cellulare. Lavare il filtro cellulare con 0,5 mL di HB.
4. Rimuovere il filtro cellulare e centrifugare la provetta a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, utilizzando una centrifuga a secchio oscillante. Scartare il surnatante.
   NOTA: Sforzare l'omogenato aiuterà a ridurre i detriti, che è fondamentale per la citometria a flusso e le fasi a valle di snRNA-seq.
5. Risospendere delicatamente il pellet in 4 mL di HB utilizzando una pipetta P1000. Incubare su ghiaccio per 5 min. Centrifugare a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 mL di WM.
6. Pre-bagnare un tappo filtrante da 35 μm su una provetta da 15 mL con 0,5 mL di WM. Filtrare la sospensione dei nuclei dal punto 2.5 attraverso il filtro cellulare, pipettare delicatamente 0,5 mL alla volta usando una pipetta P1000.
7. Lavare il tappo del filtro con 0,5 mL di WM e posizionare il tubo sul ghiaccio. Trasferire il filtrato in una nuova provetta da 15 mL e centrifugare per 5 minuti e 4 °C a 500 x g. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 mL di WM.
8. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di WM con il topo anti-NeuN, l'anticorpo coniugato Alexa Fluor 488 (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) e 1 μg/mL DAPI. Incubare per 45 minuti sul ghiaccio al buio.
   NOTA: Per ottimizzare l'immunocolorazione dei nuclei isolati, si raccomanda di titolare l'anticorpo per determinare la diluizione ottimale per l'analisi e lo smistamento della citometria a flusso. Quindi, eseguire controlli adeguati per confermare che le condizioni di colorazione siano ottimali. Ad esempio, con l'anticorpo coniugato anti-NeuN-AF488, sono stati eseguiti un controllo negativo (cioè nessuna aggiunta dell'anticorpo, Figura supplementare 1A) e un controllo positivo (cioè colorazione con l'anticorpo, Figura supplementare 1B) per valutare la segregazione delle popolazioni non colorate e colorate. Quando si inizia a lavorare con un anticorpo coniugato con AF488, si raccomanda di eseguire un controllo dell'isotipo coniugato con AF488 per valutare la specificità. Se viene utilizzato un anticorpo non coniugato, potrebbe essere necessario un controllo aggiuntivo come l'aggiunta di un anticorpo secondario solo a una preparazione di nuclei per valutare il legame aspecifico dell'anticorpo secondario.

3. Selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) per escludere le popolazioni neuronali (Timing: 45 min)

1. Trasferire la sospensione di nuclei immuno-colorati in una provetta da 5 ml e tenerla sul ghiaccio fino all'inizio della procedura di citometria a flusso.
   NOTA: Se si lavora con pezzi di tessuto più grandi di due DG, potrebbe essere necessaria un'ulteriore diluizione con tampone WM per evitare di intasare il FACS se la densità dei nuclei nella soluzione diventa elevata.
2. Vortice i campioni per 3 s a bassa velocità prima di posizionare i tubi nello strumento FACS (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: (configurazione FACS) Le selezionatrici devono essere allineate all'inizio della procedura con le particelle di calibrazione seguendo le raccomandazioni del produttore. Il ritardo di caduta è stato calibrato con perline o microsfere (vedi Tabella dei materiali) secondo il modello FACS. I campioni sono stati ordinati a 4 °C in modalità purezza. Per ridurre il volume di raccolta, i nuclei sono stati ordinati attraverso un ugello da 70 μm alla pressione raccomandata per il citometro a flusso. I nuclei sono stati suddivisi in tubi a basso legame da 1,5 mL (vedi Tabella dei materiali) contenenti 50 μL di WM. Tutti i tubi di raccolta sono stati rivestiti in PBS + 5% BSA a 4 °C durante la notte per ridurre il rischio che i nuclei si attacchino alle pareti del tubo.
3. Per acquisire i dati da un campione della sospensione dei nuclei colorati, impostare le porte in altezza DAPI e nell'area DAPI per escludere i detriti cellulari e i nuclei aggregati (Figura 2A). Inoltre, separare i singoli nuclei da eventuali aggregati colorati DAPI rimanenti o detriti cellulari impostando le porte nell'area di dispersione laterale del log (SSC) e nell'area di dispersione diretta del log (FCS) (Figura 2B).
4. Impostare le porte per l'anti-NeuN-AF488 e l'area FSC, per isolare la popolazione NeuN-AF488-negativa, come mostrato nella Figura 2C.
5. Dopo l'analisi, utilizzando la strategia di gating sopra descritta, ordinare la popolazione NeuN-AF488-negativa in una provetta di raccolta da 1,5 mL riempita con 50 μL di WM.
   NOTA: Seguendo la strategia di gating sopra descritta e la procedura di dissezione per isolare il DG dal cervello di un topo adulto, la popolazione NeuN-AF488-negativa dovrebbe rappresentare ~ 14% dei singoli nuclei.

Figura 2: Isolamento e profilo trascrittomico di popolazioni cellulari non neuronali dal DG. (A-C) Strategia di gating per isolare singoli nuclei neuN-AF488 negativi ed escludere detriti cellulari. (A) FANS dot plot di un campione rappresentativo di nuclei isolati, raffigurante l'impostazione del gate per la selezione dei nuclei DAPI+ e l'esclusione di detriti cellulari e aggregati. (B) Ulteriore selezione di singoli nuclei rilevanti utilizzando l'area FSC e l'area SSC. (C) Le porte per NeuN-AF488 per escludere la popolazione positiva e ordinare per i singoli nuclei negativi. (D) Micrografia di una buona sospensione di nuclei singoli con quantità minima di detriti e percentuale maggiore di nuclei di buona qualità (forma rotonda, freccia nera) rispetto ai nuclei di cattiva qualità (freccia bianca). Barre della scala = 50 μm, 10 μm (riquadro). (E,F) Analisi dei dati snRNA-seq e profilazione delle distinte popolazioni cellulari isolate dal DG di topi maschi C57BL/6J di 22 mesi. Grafici UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) di profili di singoli nuclei dalle (E) cellule non classificate FACS e (F) cellule classificate FACS NeuN-negative, colorate per tipo di cella. (G) Grafici a torta che confrontano le frequenze dei tipi di cellule identificati in entrambi i campioni. (H) Metriche rispettive per i campioni sequenziati: numero di nuclei, numero mediano di geni e trascritti per nucleo. (I) Grafici di violino che mostrano la distribuzione del numero di geni e trascritti rilevati per ciascun tipo di cellula in entrambi i campioni. Astr. = astrociti, Olig. = oligodendrociti, Vasc. = cellule vascolari, CRCs = cellule di Cajal-Retzius, Neur. = neuroni, Imm. = cellule immunitarie, OPC = cellule precursori degli oligodendrociti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Preparazione della sospensione di singoli nuclei per eseguire il sequenziamento dell'RNA dei singoli nuclei (Tempistica: 30 min)

1. Dopo la selezione, aggiungere 1 mL di PBS contenente l'1% di BSA alla provetta di raccolta per raccogliere le goccioline sulla parete della provetta e ruotare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante, lasciando 50 μL.
   NOTA: Maneggiare i nuclei centrifugati con cura in quanto potrebbe essere difficile osservare qualsiasi pellet sul fondo del tubo. L'uso di una centrifuga a secchio oscillante aiuterà a scartare il surnatante senza interrompere il pellet.
2. Pipet delicatamente per risospendere i nuclei centrifugati. Aggiungere 5 μL della sospensione nucleica a 5 μL di blu di Trypan in un microtubo da 0,5 ml.
   ATTENZIONE: Maneggiare Trypan blue con cura in quanto è pericoloso per la salute, può causare il cancro ed è sospettato di danneggiare la fertilità o il nascituro. Indossare guanti protettivi, indumenti e protezioni per occhi e viso. Non maneggiare fino a quando tutte le precauzioni di sicurezza non sono state lette e comprese.
3. Misurare la concentrazione e valutare la vitalità della sospensione a singola cellula utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule (vedere la tabella dei materiali). Eseguire la preparazione della libreria e il sequenziamento dei nuclei come descritto nel passaggio 5.
   NOTA: I campioni che sono stati ritenuti di buona qualità per il sequenziamento hanno mostrato nuclei rotondi e regolari al microscopio senza detriti cellulari (Figura 2D). La presenza di un alone attorno alla membrana nucleare o l'aggregazione di più nuclei insieme sono segni di nuclei danneggiati e tali sospensioni cellulari non dovrebbero essere considerate per snRNA-seq (Figura 2D). La concentrazione misurata dei nuclei era compresa tra 300 e 700 nuclei/μL.

5. Preparazione e sequenziamento della libreria

NOTA: la descrizione dei seguenti passaggi si basa sulla piattaforma di sequenziamento interna utilizzata in questo studio (vedere la tabella dei materiali). Pertanto, alcune impostazioni potrebbero differire quando si utilizza una piattaforma diversa. Qui, vengono descritti solo i passaggi chiave e ogni parametro deve essere determinato seguendo le linee guida e i protocolli del produttore scelto, anche se con l'ottimizzazione prima del primo utilizzo. È fondamentale garantire che la preparazione delle librerie venga eseguita il più rapidamente possibile dopo aver concentrato le sospensioni di nuclei ordinati per evitare la degradazione dell'RNA e garantire una qualità ottimale del sequenziamento.

1. Carica tra 7.000 e 10.000 nuclei in un chip microfluidico a singola cellula.
2. Dividere i nuclei caricati in goccioline su scala nanolitro utilizzando il controller fornito e i reagenti del fornitore scelto. Lisa nuclei all'interno di ogni goccia e RNA a trascrizione inversa.
   NOTA: All'interno di una goccia tutti i cDNA risultanti condividevano lo stesso codice a barre cellulare.
3. Preparare le librerie per snRNA-seq seguendo le linee guida del fornitore scelto e garantendo la compatibilità con la piattaforma di sequenziamento. Controllare la qualità e la concentrazione delle librerie finali utilizzando elettroforesi, fluorometria o metodi basati su qPCR e, se applicabile, raggrupparli equimolare prima del sequenziamento.
4. Denaturare raggruppato 3 librerie di espressione genica e diluire secondo la raccomandazione del produttore.
5. Esegui il sequenziamento a indicizzazione paired-end, singolo o doppio su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione con profondità di sequenziamento di 50.000 coppie di lettura per cella.

Risultati

Il protocollo qui presentato descrive un metodo per preparare una sospensione di singoli nuclei non neuronali isolati dal DG per eseguire snRNA-seq. Con o senza FANS, il clustering bioinformatico ha rivelato gruppi ben separati di nuclei corrispondenti a tipi cellulari noti all'interno del DG (Figura 2E,F). All'interno del campione non classificato FACS, la maggior parte dei nuclei di alta qualità che sono stati sequenziati comprendeva tre gruppi di neuroni (84,9% dei nuclei totali per questo campione, Figura 2E, G, H). Tali risultati sono attesi, considerando che le popolazioni cellulari più rappresentate nella DG sono i neuroni granuli, altri neuroni eccitatori (etichettati come neuroni eccitatori) e i neuroni inibitori¹⁰. I cluster non neuronali identificati erano per lo più costituiti da tipi di cellule gliali (11,1%), tra cui astrociti, oligodendrociti e cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), cellule immunitarie (3,3%) e cellule di Cajal-Retzius (0,6%). Quando si eseguono FANS per escludere popolazioni NeuN positive (campione classificato FACS NeuN-negativo; Figura 2F,G,H), gruppi di cellule gliali sono diventati predominanti (81,3%). L'isolamento di un maggior numero di nuclei gliali permette una migliore segmentazione di diverse popolazioni che si raggrupperebbero senza FANS. Infatti, ri-clustering e analizzando geni specifici espressi nelle NSC o negli astrociti, quattro sotto-cluster si sono separati (Figura supplementare 2A,B). Osservando marcatori cellulari più specifici e valutando i livelli di espressione genica tra i tipi cellulari, è stato rilevato un piccolo gruppo di NSC segregato separatamente dalle principali popolazioni astrocitarie con maggiore espressione di Hopx e Notch2 e quasi nessuna espressione di Aldh1a1 o Aqp4 (Figura supplementare 2C). Tuttavia, a causa della sovrapposizione nell'espressione genica tra astrociti e NSC, sarebbero necessarie ulteriori analisi per profilare e identificare in modo specifico diversi sottotipi di cellule. Inoltre, il campione FANS NeuN-negativo aveva cluster aggiuntivi etichettati come cellule vascolari (2,3%) che comprendono cellule endoteliali, periciti e cellule leptomeningee vascolari quando referenziati per l'espressione di marcatori cellulari specifici (dati non mostrati).

Seguendo le linee guida per il protocollo scelto per generare librerie per il sequenziamento, sono stati ottenuti profili di espressione di alta qualità con o senza FANS. Per i campioni sequenziati a 50.000 letture/nucleo, sono stati rilevati in media 2.510 geni per nucleo per il campione non classificato FACS (5.578 trascrizioni, Figura 2H) e 1.665,5 geni (3.508 trascrizioni) per il campione FANS NeuN-negativo, dopo aver filtrato nuclei di bassa qualità (Figura 2H,I). Queste metriche confermano che questo protocollo genera un profilo trascrittomico di alta qualità di singoli nuclei paragonabile agli studi che utilizzano approcci diversi^22,23 e che il processo di selezione FACS non danneggia i nuclei per il successivo snRNA-seq. In particolare, la differenza nel numero di geni e trascritti per nucleo tra i due campioni non è dovuta alla minore qualità dei dati, ma all'alta percentuale di neuroni nel campione non selezionato FACS (84,9% rispetto all'1,7% nel campione FANS NeuN-negativo), che hanno una maggiore attività trascrizionale (2.660 geni / nucleo e 6.170 trascritti / nucleo in campioni non classificati FACS) rispetto all'attività trascrizionale media di tutti i tipi di cellule non neuronali (1.090 geni / nucleo e 1.785 trascrizioni/nucleo, Figura 2I).

Insieme, questi risultati rappresentativi mostrano che la selezione di nuclei NeuN negativi utilizzando FANS è un potente strumento per isolare tipi di cellule a bassa abbondanza dal tessuto cerebrale appena sezionato ed eseguire profili trascrittomici singoli nuclei di alta qualità di queste distinte popolazioni cellulari tramite metodi snRNA-seq.

Figura supplementare 1: Convalida dell'immunocolorazione per FANS. La sospensione dei nuclei è stata incubata (A) senza l'anticorpo anti-NeuN-AF 488 come controllo negativo o (B) con l'anticorpo e fatta passare attraverso il selezionatore FACS per convalidare le condizioni di immunocolorazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Analisi dell'espressione genica e ri-clustering dell'ammasso di astrociti. (A) Grafico UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) che mostra il raggruppamento di 4968 nuclei sulla base dei profili di espressione dell'intero genoma dalla Figura 2F. Le chiamate di tipo di cella sono state eseguite in base a marcatori di tipo cella. (B) Ammasso di astrociti composto da 2579 nuclei scelti da (A) per ulteriori sotto-impostazioni per studiare potenziali sottotipi cellulari. Quattro sottotipi sono stati rilevati mediante clustering Seurat (0-3), mostrati da colori diversi. (C) Livelli di espressione genica di specifici marcatori cellulari nei quattro tipi di cellule. Tutti gli appezzamenti sono stati ottenuti utilizzando il pacchetto Seurat R²⁴. In breve, i conteggi di RNA-seq sono stati normalizzati per ogni cellula per l'espressione totale e moltiplicati per il fattore di scala (10.000). Questo risultato è stato quindi trasformato in log. I valori trasformati sono stati scalati (varianza scalata a uno) e centrati (media impostata a zero) all'interno di ogni cella prima che UMAP fosse applicato per calcolare gli incorporamenti, che sono stati utilizzati come valori sugli assi x e y. I grafici rappresentano l'output di una tecnica di riduzione dimensionale su un grafico a dispersione 2D in cui ogni punto rappresenta una cella con le rispettive coordinate x e y in base agli incorporamenti di celle determinati dalla tecnica di riduzione. Le cellule con firme geniche simili sono posizionate l'una vicino all'altra dagli embedding. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Analisi dell'espressione genica di NeuN nella linea neurogena. (A) Grafico UMAP che mostra il raggruppamento della linea neurogena dal set di dati pubblicamente disponibile¹⁵. Gli UMAP sono stati generati come nella Figura supplementare 2. (B) Livelli di espressione genica di specifici marcatori cellulari attraverso la linea neurogena che mostrano astrociti (acquaporina 4 = Aqp4), NSC (proteina solo omeodominio = Hopx), NeuN / Rbfox3 (NSC e cellule progenitrici intermedie [IPC]) e cellule cicliche (chinasi ciclina-dipendente 6 = Cdk6). Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Composizioni dei mezzi e dei buffer utilizzati nello studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Per eseguire con successo questo protocollo, la dissezione del DG è il primo passo critico, che richiede una certa pratica per mantenerlo intatto e limitare la contaminazione dai tessuti circostanti. Dall'esperienza, la separazione del DG dall'ippocampo potrebbe essere acquisita molto rapidamente da un ricercatore esperto che potrebbe quindi lavorare per affinare la loro tecnica per aumentare la rapidità della dissezione e quindi migliorare la freschezza del tessuto per generare dati di alta qualità. Allo stesso modo, la preparazione e la risospensione di singoli nuclei richiede coerenza tra le diverse condizioni utilizzate in un singolo esperimento, ma anche evitare un eccessivo pipettaggio che potrebbe interrompere la membrana nucleare rilasciando RNA ambientali che influenzeranno i risultati del sequenziamento. Oltre alle raccomandazioni menzionate in precedenza per preparare nuclei di alta qualità, deve essere considerata anche la concentrazione della sospensione di singoli nuclei prima di procedere con il sequenziamento. Infatti, secondo le linee guida del produttore, un preparato con una concentrazione superiore a 1.200 nuc/μL deve essere diluito, poiché questo livello di concentrazione dei nuclei avrà un rischio maggiore di formare multipletti che influiscono sulle analisi bioinformatiche a valle. Da notare che il sequenziamento di campioni con concentrazioni di nuclei inferiori a 500 nuc/μL potrebbe non essere utile a causa del costo coinvolto. Si raccomanda inoltre di seguire il consiglio di un utente FACS avanzato per impostare tutti i gating e rimanere coerenti con le impostazioni tra campioni e repliche biologiche. Allo stesso modo, la preparazione di librerie per il sequenziamento dell'RNA comporta una certa formazione per ottenere risultati di alta qualità e la maggior parte dei fornitori ha un eccellente supporto per raggiungere questo obiettivo in modo efficiente. Questo metodo è stato testato solo con tessuto fresco in questo studio; tuttavia, FANS è stato eseguito anche con tessuto congelato²⁵. È quindi ragionevole supporre che questo protocollo possa essere eseguito con tessuto congelato anche se con una piccola ottimizzazione.

Questo protocollo è stato sviluppato con una particolare applicazione a valle in mente, che è quella di studiare popolazioni cellulari diverse dai neuroni all'interno della nicchia neurogena ippocampale. In effetti, linee crescenti di evidenza indicano che la compromissione dell'AHN nell'invecchiamento potrebbe essere attribuita alle cellule circostanti all'interno della nicchia 1,2,3,9. In particolare, astrociti e oligodendrociti emergono come regolatori chiave dell'AHN; tuttavia, il loro isolamento dal DG accoppiato con il sequenziamento dell'RNA ha generato risultati contrastanti, rendendo questa ipotesi difficile da valutare con questa tecnica ^1,17. Questo approccio di selezione FACS dei nuclei NeuN-negativi ha permesso l'isolamento di più astrociti e oligodendrociti rispetto ai campioni che non erano classificati FACS, il che consente una migliore analisi bioinformatica. Questo protocollo è applicabile a tutte le età nel corso della vita e i dati rappresentativi presentati qui con tessuti di animali anziani forniscono una prova del concetto che questo metodo è robusto per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo che invecchia. Per ampliare l'uso di questo metodo e adattarlo a diverse questioni biologiche, è importante considerare che altri antigeni di membrana nucleare neuronale potrebbero essere testati insieme a una titolazione approfondita dei migliori anticorpi validati per questi marcatori. Ad esempio, quando si studia il processo di differenziazione neuronale dalle NSC nella DG, alcuni tipi di cellule come le cellule di tipo 2 o i neuroblasti iniziano a esprimere NeuN (Figura 3 supplementare). Pertanto, sarebbe necessario un altro antigene per studiare specificamente questi tipi di cellule. Al contrario, alcuni neuroni sono stati ancora identificati in questo studio dopo l'ordinamento FACS NeuN-negativo, probabilmente a causa della bassa o nessuna espressione di NeuN in queste popolazioni (ad esempio, neuroni corticali di Cajal-Retzius¹⁹). Inoltre, è stato riportato che NeuN è espresso in sottopopolazioni di oligodendrociti²⁶, che potrebbero dare risultati distorti se queste sottopopolazioni fossero di interesse. Pertanto, la scelta dell'antigene quando si inizia a utilizzare FANS dovrebbe essere attentamente considerata per evitare l'inclusione o l'esclusione di popolazioni cellulari che precluderebbero una risposta accurata a una specifica domanda biologica. In accordo con questo, si raccomanda inoltre che ogni risultato del sequenziamento sia ulteriormente convalidato da saggi ortogonali (ad esempio, immunoistochimica o RNA-scope) prima di convalidare o confutare l'ipotesi testata con questo protocollo. Infine, la fase che coinvolge FANS potrebbe essere ulteriormente sviluppata per includere più di un anticorpo con una strategia di selezione più elaborata per escludere e / o includere le popolazioni cellulari desiderate.

In definitiva, le tecnologie descritte in questo protocollo potrebbero avere alcune limitazioni se utilizzate con altre specie. Ad esempio, la nicchia è molto ben definita nei roditori con la presenza di NSC proliferative e quiescenti o di neuroni appena nati ristretti all'interno di specifiche sottoregioni della DG, ma non è ancora chiaro come la nicchia neurogena ippocampale dovrebbe essere delineata in altre specie. In effetti, le cellule proliferative non sono allineate all'interno di una zona continua del DG nei primati non umani e negli esseri umani, ma sono piuttosto sparse intorno ad essa e potrebbero anche essere presenti nell'amigdala⁷. Pertanto, la dissezione e l'isolamento di aree più ampie rispetto alla DG in altre specie avrebbe potenzialmente un impatto sull'uso di questo protocollo. In particolare, le fasi di dissociazione e triturazione per la preparazione del tessuto dovranno essere ottimizzate mentre si lavora con pezzi di tessuto più grandi^27,28. Per quanto riguarda l'analisi bioinformatica, mentre i roditori ospitati in consanguineità hanno un genoma molto omogeneo e molto ben annotato, la variabilità genetica del genoma umano combinata con un numero insufficiente di marcatori cellulari per distinguere chiaramente diverse popolazioni cellulari (ad esempio, NSC e astrociti) richiede molta normalizzazione per l'analisi che potrebbe portare a conclusioni diverse quando viene identificato un piccolo gruppo di cellule^{7, 11}. In tali situazioni, l'arricchimento cellulare potrebbe ancora essere un'opzione preferita o dovrebbe essere utilizzato insieme ad altre strategie per aumentare la potenza analitica.

Tuttavia, l'approccio attuale può consentire di studiare il ruolo di popolazioni cellulari poco studiate, anche se potenzialmente importanti, nella regolazione dell'AHN. Ciò potrebbe essere particolarmente vero per le popolazioni di astrociti, che svolgono un ruolo centrale nell'insorgenza e nella progressione delle malattie neurodegenerative^29,30. Questo studio ha dimostrato che gli astrociti e altre popolazioni cellulari rare possono essere identificati e profilati semplicemente escludendo la stragrande maggioranza dei neuroni presenti all'interno della DG. Altri studi che utilizzano approcci diversi non sono stati in grado di ottenere un recupero simile di nuclei dalla stessa gamma di popolazioni cellulari 5,11,17. Inoltre, i risultati di questo studio dimostrano che è possibile utilizzare questo approccio per isolare un cluster di NSC senza arricchimento specifico di questa popolazione cellulare¹⁵.

In conclusione, seguire e migliorare questo metodo sarebbe un passo avanti per affrontare le questioni in sospeso relative al ruolo contestuale della nicchia neurogena ippocampale per la modulazione dell'AHN. In particolare, potrebbe portare nuove conoscenze sui livelli di espressione genica nei cervelli anziani e malati nelle popolazioni cellulari associate alla regolazione dell'AHN⁹, supportare l'identificazione di una potenziale eterogeneità delle NSC¹ o affrontare il ruolo della vascolarizzazione nell'AHN. In definitiva, questo metodo potrebbe essere adattato per altre nicchie di cellule staminali adulte con domande e problemi simili.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microprovetta da 0,5 ml	Eppendorf	30124537
10,00µ m Flouresbrite YG Microsfere carbossilate	Polysciences	15700-10
15 mL provette da centrifuga	in polipropilene Corning	430052
2 paia di pinze sterili Dumont #5	Fine Science Tools	11252-30
4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
4150 TapeStation System	Agilent	N/A
Provetta da 5 mL in polipropilene ad alta trasparenza a fondo tondo con tappo a scatto	Falcon	352063
Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL con filtro cellulare Tappo a scatto	Falcon	352235
Provette da centrifuga in polipropilene da 50 mL	Corning	430829
70 &; filtro cellulare m	Falcon	352350
8 picchi SPHERO Arcobaleno Calibrazione Particelle	BD Biosciences	RCP-30-5A
Accudrop Beads	BD Biosciences	N/A
Allegra X-30R Centrifuga	Beckman Coulter	N/A
Anticorpo anti-NeuN, clone A60, Alexa Fluor 488 coniugato	Millipore	MAB377X
BD FACSAria Citometro a flusso a fusione	BD Biosciences	N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/A
Regolatore di cromo	10x Genomics	N/A
Cromo Next GEM Single Cell 3' Kit di reagenti v3.1	10x Genomics	PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213
BSA 7,5%	Gibco	15260037
Ditiotreitolo (DTT)	Thermo Scientific	R0861
Dounce set di smerigliatrici per tessuti: mortaio, pestello sciolto (A) e pestello stretto (B)	KIMBLE	D8938-1SET
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1,5 ml	Eppendorf	30108116
Halt, 100x Inibitore della proteasi	ThermoFisher	78429
HiSeq 4000 Sistema di sequenziamento	Illumina	N/A	Configurazione del sequenziamento: 28-8-0-91
KCl	Qualsiasi fornitore		Laboratorio realizzato
LUNA-FX7 Contatore cellulare automatizzato	Loghi Biosystems	N/A
MgCl2	Qualsiasi fornitore		Laboratorio realizzato
N° 10 bisturi monouso sterili custoditi	Swann-Morton	6601
Acqua priva di nucleasi	Sigma Aldrich	W4502-1L
Paio di forbici chirurgiche sterili per studenti Strumenti di	scienze fini	91401-12
PBS	Qualsiasi fornitore
Inibitore della RNasi realizzato in laboratorio 40 U e micro; l-1	Ambion	AM2684
RNasin 40 U µ l-1	Promega	N211A
Piastra di Petri sterile	Corning	430167
Saccarosio	Sigma Aldrich	59378-500G
Tris tampone, pH 8.0	Qualsiasi fornitore		Laboratorio realizzato
Triton X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Trypan blue	Invitrogen	T10282