Affrontare i problemi pratici nella microindentazione basata sulla microscopia a forza atomica su espianti di cartilagine articolare umana

Summary

Presentiamo un approccio passo-passo per identificare e affrontare i problemi più comuni associati alle micro-indentazioni di microscopia a forza atomica. Esemplificamo i problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare umana nativa caratterizzati da vari gradi di degenerazione guidata dall'osteoartrite.

Abstract

Senza dubbio, la microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente una delle tecniche più potenti e utili per valutare micro e persino nano-segnali in campo biologico. Tuttavia, come con qualsiasi altro approccio microscopico, possono sorgere sfide metodologiche. In particolare, le caratteristiche del campione, la preparazione del campione, il tipo di strumento e la sonda di indentazione possono portare ad artefatti indesiderati. In questo protocollo, esemplificamo questi problemi emergenti sugli espianti di cartilagine articolare sana e osteoartritica. A tal fine, mostriamo innanzitutto attraverso un approccio passo-passo come generare, classificare e classificare visivamente i dischi di cartilagine articolare ex vivo in base ai diversi stadi di degenerazione per mezzo di un grande imaging a fluorescenza a mosaico 2D dell'intero tessuto espianto. Il principale punto di forza del modello ex vivo è che comprende cartilagine umana invecchiata, nativa, che consente di studiare i cambiamenti correlati all'osteoartrite dall'esordio precoce alla progressione. Inoltre, vengono presentate anche le insidie comuni nella preparazione dei tessuti, nonché l'effettiva procedura AFM insieme alla successiva analisi dei dati. Mostriamo come le fasi di base ma cruciali come la preparazione e l'elaborazione del campione, le caratteristiche topografiche del campione causate dalla degenerazione avanzata e l'interazione campione-punta possano influire sull'acquisizione dei dati. Sottoponiamo inoltre ad esame i problemi più comuni nell'AFM e descriviamo, ove possibile, come superarli. La conoscenza di questi limiti è della massima importanza per la corretta acquisizione dei dati, l'interpretazione e, in ultima analisi, l'integrazione dei risultati in un ampio contesto scientifico.

Introduction

A causa delle dimensioni sempre più ridotte dei dispositivi e dei sistemi elettronici, il rapido sviluppo di tecnologie e apparecchiature a base di micro e nano ha guadagnato slancio. Uno di questi dispositivi è la microscopia a forza atomica (AFM), che può scansionare superfici biologiche e recuperare informazioni topografiche o biomeccaniche su scala nanometrica^e micrometrica ^1,2. Tra le sue vaste caratteristiche, questo strumento può essere utilizzato sia come micro che come nano-penetratore per ottenere informazioni sulle proprietà meccaniche di vari sistemi biologici 3,4,5,6.^<....

Protocol

Sono stati utilizzati condili femorali prelevati da pazienti sottoposti ad artroplastica totale del ginocchio presso l'ospedale universitario di Tubinga, in Germania. In questo studio sono stati inclusi solo campioni di cartilagine articolare di pazienti con patologie articolari degenerative e post-traumatiche. Prima dell'inizio dello studio è stata ottenuta l'approvazione del comitato etico dipartimentale, istituzionale e locale (Progetto n.674/2016BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della partecipazione.

NOTA: Nella Figura 1 è riportato un diagramma di flusso delle f....

Results

Utilizzando un dispositivo di taglio autocostruito, siamo stati in grado di espiantare e generare piccoli dischi di cartilagine (4 mm x 1 mm) da condili umani freschi contenenti un singolo modello spaziale cellulare³⁰ di singole stringhe (SS, Figura 2A), doppie stringhe (DS), piccoli cluster (SC), grandi cluster (BC; Figura 2A) e diffusa (Figura 2B). Un espianto di cartilagine rappresentativo è raffigurato ne.......

Discussion

Essendo una malattia progressiva e multifattoriale, l'OA innesca cambiamenti strutturali e funzionali nella cartilagine articolare. Durante il decorso dell'OA, le compromissioni delle caratteristiche meccaniche sono accompagnate da cambiamenti strutturali e biochimici sulla superficie della cartilagine articolare^27,31. I primi eventi patologici che si verificano nell'OA sono la deplezione dei proteoglicani accoppiata con l'interruzione della rete di collagene

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amfotericina B	Merck KGaA, Darmstadt, Germania	1397-89-3
Testa di microscop a forza atomica (AFM)	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlino, Germania	JPK00518
Colla per campioni biocompatibile	Bruker Nano GmbH, Berlino, Germania	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Colorante permeabile alla membrana cellulare, utilizzato per lo smistamento del disco cartilagineo - imaging con vista dall'alto
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlino, Germania	SAA-SPH-5UM	Frequenza nom: 30KHz, k: 0,2 N / m, lunghezza nom: 115μ m, larghezza nom: 40μ m,  Geometria: rettangolare, punta cilindrica con un 5μ m raggio terminale
Dispositivo di ctting della cartilagine	Autoprodotto	n/a	Dispositivo di taglio in plastica contenente interi predefiniti di fotocamera CDD da 4 mm x 1 mm
integrata nell'AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Brema, Germania	DFK 31BF03
Fotocamera CDD integrata nel microscopio a fluorescenza	Leica Biosystems, Wetzlar, Germania	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germania	CM3050S
Il software di elaborazione dati per l'AFM	Bruker Nano GmbH, Berlino, Germania	n/a	Versione 5.0.86, può essere scaricato gratuitamente dal seguente sito web https://customers.jpk.com
il mezzo di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germania	41966052
Microscopio a fluorescenza (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germania	11889113
Supporto per fegato a blocchi di vetro	Bruker Nano GmbH, Berlino, Germania	SP-90-05	Blocco di vetro extra lungo con facce angolate, progettato appositamente per l'uso con il JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Microscopio a contrasto di fase invertito (integrato nell'AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germania	L201306_03
il terreno L-15 di Leibovitz senza L-glutammina	Merck KGaA, Darmstadt, Germania	F1315
Vetrini per microscopio	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mezzo di montaggio Con DAPI	ibidi GmbH, Grä felfing, Germania	50011	Mezzi di montaggio con controcolorazione nucleare DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilidolo) utilizzato per dischi di cartilagine  imaging con vista laterale
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Riscaldatore per piastre di Petri associato a AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlino, Germania	T-05-0117
Bisturi	Feather Medical Products, Osaka, Giappone	2023-01
Gonna in silicone	Bruker Nano GmbH, Berlino, Germania	n/a	Membrana protettiva in silicone (D55x0.25) che viene posizionata sulla base della base del blocco di vetro per prevenire la condensa media nella testa AFM.
Programma statistico - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Visualizzazione 280.0.0.0 (190)
Piastre per colture tissutali	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Svizzera	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Paesi Bassi	SA6255012	Mezzo di inclusione solubile in acqua