Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)
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Articolo metodologico
Imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando l'espansione del codice genetico
In questo articolo
Sommario
Abstract
I sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) consentono ai batteri gram-negativi di iniettare una batteria di proteine effettrici direttamente nel citosol delle cellule ospiti eucariotiche. All'ingresso, le proteine effettrici iniettate modulano in modo cooperativo le vie di segnalazione eucariotiche e riprogrammano le funzioni cellulari, consentendo l'ingresso e la sopravvivenza dei batteri. Il monitoraggio e la localizzazione di queste proteine effettrici secrete nel contesto delle infezioni fornisce un'impronta per definire l'interfaccia dinamica delle interazioni ospite-patogeno. Tuttavia, l'etichettatura e l'imaging delle proteine batteriche nelle cellule ospiti senza interrompere la loro struttura / funzione è tecnicamente impegnativo.
La costruzione di proteine di fusione fluorescenti non risolve questo problema, perché le proteine di fusione bloccano l'apparato secretorio e quindi non vengono secrete. Per superare questi ostacoli, abbiamo recentemente impiegato un metodo per la marcatura fluorescente sito-specifica di effettori secreti batterici, così come altre proteine difficili da etichettare, utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE). Questo documento fornisce un protocollo passo-passo completo per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando GCE site-specific, seguito da istruzioni per l'imaging della localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)
Recenti scoperte suggeriscono che l'incorporazione di aminoacidi non canonici (ncAA) tramite GCE, seguita da marcatura bio-ortogonale con coloranti contenenti tetrazina, è una tecnica praticabile per la marcatura selettiva e la visualizzazione delle proteine secrete batteriche e la successiva analisi delle immagini nell'ospite. L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che possa essere impiegato dai ricercatori interessati a condurre immagini a super-risoluzione utilizzando GCE per studiare vari processi biologici in batteri e virus, nonché le interazioni ospite-patogeno.
Introduzione
Le infezioni batteriche sono state a lungo considerate un grave pericolo per la salute umana. I patogeni utilizzano sistemi di difesa altamente evoluti, estremamente potenti e intricati, nonché una varietà di fattori di virulenza batterica (indicati come proteine effettrici) per eludere le risposte immunitarie dell'ospite e stabilire infezioni 1,2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi sistemi e il ruolo delle singole proteine effettrici sono ancora in gran parte sconosciuti a causa della mancanza di approcci adeguati per seguire direttamente i componenti proteici cruciali e gli effettori nelle....
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Protocollo
1. Costruzione plasmidica
- Clonare il gene che esprime il POI in un plasmide di espressione (ad esempio, pET28a-sseJ 10TAG) che esprime il POI in E. coli BL21 (DE3). Questo passaggio facilita nel determinare che i mutanti sono funzionali.
- Per la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti, costruire un plasmide di espressione (pWSK29-sseJ-HA) che esprima il POI bersaglio SseJ sotto il controllo del suo promotore nativo, come descritto nei precedenti rapporti 7,12,24. Utilizz....
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Risultati
Questo documento protocollare descrive un metodo basato su GCE per l'etichettatura fluorescente sito-specifica e la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella , come illustrato nella Figura 1. La struttura chimica del gruppo bioortogonale (TCO) transciclooctene contenente ncAA e del colorante fluorescente sono mostrati nella Figura 1A. La marcatura di SseJ è stata ottenuta mediante incorporazione genetica di n.......
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Discussione
L'approccio qui descritto è stato utilizzato per tracciare la posizione precisa delle proteine effettrici iniettate nella cellula ospite dal batterico T3SS dopo l'infezione. I T3SS sono impiegati da patogeni intracellulari come Salmonella, Shigella e Yersinia per trasportare componenti di virulenza nell'ospite. Lo sviluppo di tecnologie di imaging a super-risoluzione ha permesso di visualizzare fattori di virulenza con una risoluzione precedentemente inimmaginabile12,13,24
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da fondi di start-up della University of Texas Medical branch, Galveston, TX, e un premio Texas STAR a L.J.K. Ringraziamo il Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germania) per il plasmide pEVOL-PylRS-AF. Le immagini nella Figura 1 sono state create utilizzando BioRender.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x Tris/Glicina SDS tampone di corsa | BIO-RAD | 1610732 | |
| Cloruro di ammonio | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Solfato di ammonio | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillina Sodica | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotico-Antimicotico (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinosio | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (Centrifuga ad alte prestazioni) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazina | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoetanolo | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Blu di bromofenolo | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Caseina | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalasi | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Cloramfenicolo | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Fare clic sull'aminoacido / trans-Cyclooct-2-en – L - Lisina (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Formato: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Spettrofotometro Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV* | Utilizzato per il mantenimento di HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Utilizzato per l'infezione batterica in presenza di ncAA, vedere paragrafo 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Asino anti-coniglio Alexa fluoro555 anticorpo secondario | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ceppo E. coli BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Amburgo, Germania | 30123.328 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand - Sterili (PVDF 0,22 &; micro; m) | Fischer Scientific | 97203 | Confezione da 100 |
| Gene Pulser Xcell Elettroporatore | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamicina | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutammina (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucosio ossidasi | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glicerolo | Fischer Scientifico | BF229-4 | |
| Cellule HeLa | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Tampone | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Acido cloridrico | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Elaborazione e analisi delle immagini: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Colorante a base di Coomassie |
| Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazina | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamicina | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Brodo | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μ Manager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Cuvetta per micropulsatore | BIO-RAD | 165-2086 | 0,2 cm distanza tra gli elettrodi, confezione da 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Fiasche per colture cellulari | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Microscopia elettronica Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | Per la costruzione e la mappa del plasmide vedere i seguenti riferimenti 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. | ||
| Kit di mini-preparazione del plasmide | Qiagen | 27106 | |
| plasmide pWSK29-sseJ10TAG-HA | Rif.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmide pWSK29-sseJ-HA | Rif.: elife. 2021, 10, e67789. Mappa vettoriale di PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | grado proteico, soluzione al 10% |
| Fosfato di potassio monobasico | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Solfato di potassio | Acros Inibitore organico | della | |
| Cocktail Set I - Soluzione Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x |
| Anticorpo primario anti-HA di coniglio | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. sierotipo Typhimurium 14028s | Rif.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Dodecil solfato di sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Idrossido di sodio | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Piruvato di sodio (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Smembratore sonico Modello 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (sistema Leica TCS SP8 STED 3X) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germania | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tripsina-EDTA (1x), 0,25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well vetrini per camera di coltura tissutale | SARSTEDT | 94.6190.802 |
Riferimenti
- Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretio....
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Ristampe e permessi
