Articolo metodologico

Imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando l'espansione del codice genetico

DOI:

10.3791/64382

⸱

10 febbraio 2023

 , 
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)

Abstract

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I sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) consentono ai batteri gram-negativi di iniettare una batteria di proteine effettrici direttamente nel citosol delle cellule ospiti eucariotiche. All'ingresso, le proteine effettrici iniettate modulano in modo cooperativo le vie di segnalazione eucariotiche e riprogrammano le funzioni cellulari, consentendo l'ingresso e la sopravvivenza dei batteri. Il monitoraggio e la localizzazione di queste proteine effettrici secrete nel contesto delle infezioni fornisce un'impronta per definire l'interfaccia dinamica delle interazioni ospite-patogeno. Tuttavia, l'etichettatura e l'imaging delle proteine batteriche nelle cellule ospiti senza interrompere la loro struttura / funzione è tecnicamente impegnativo.

La costruzione di proteine di fusione fluorescenti non risolve questo problema, perché le proteine di fusione bloccano l'apparato secretorio e quindi non vengono secrete. Per superare questi ostacoli, abbiamo recentemente impiegato un metodo per la marcatura fluorescente sito-specifica di effettori secreti batterici, così come altre proteine difficili da etichettare, utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE). Questo documento fornisce un protocollo passo-passo completo per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando GCE site-specific, seguito da istruzioni per l'imaging della localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)

Recenti scoperte suggeriscono che l'incorporazione di aminoacidi non canonici (ncAA) tramite GCE, seguita da marcatura bio-ortogonale con coloranti contenenti tetrazina, è una tecnica praticabile per la marcatura selettiva e la visualizzazione delle proteine secrete batteriche e la successiva analisi delle immagini nell'ospite. L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che possa essere impiegato dai ricercatori interessati a condurre immagini a super-risoluzione utilizzando GCE per studiare vari processi biologici in batteri e virus, nonché le interazioni ospite-patogeno.

Introduzione

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Le infezioni batteriche sono state a lungo considerate un grave pericolo per la salute umana. I patogeni utilizzano sistemi di difesa altamente evoluti, estremamente potenti e intricati, nonché una varietà di fattori di virulenza batterica (indicati come proteine effettrici) per eludere le risposte immunitarie dell'ospite e stabilire infezioni 1,2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi sistemi e il ruolo delle singole proteine effettrici sono ancora in gran parte sconosciuti a causa della mancanza di approcci adeguati per seguire direttamente i componenti proteici cruciali e gli effettori nelle cellule ospiti durante la patogenesi.

Un esempio tipico è Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che causa gastroenterite acuta. Salmonella Typhimurium utilizza sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) per iniettare una varietà di proteine effettrici direttamente nelle cellule ospiti. Non appena la Salmonella entra nella cellula ospite, risiede in un compartimento legato alla membrana acida, chiamato vacuolo contenente Salmonella (SCV)3,4. Il pH acido dell'SCV attiva il T3SS codificato per l'isola di patogenicità della Salmonella 2 (SPI-2) e trasloca una raffica di 20 o più proteine effettrici attraverso la membrana vacuolare nel citosol ospite 5,6,7,8. All'interno dell'ospite, questi complessi cocktail di proteine effettrici manipolano coordinatamente le vie di segnalazione delle cellule ospiti, con conseguente formazione di strutture di membrana tubulari altamente dinamiche e complesse estese dall'SCV lungo i microtubuli, chiamati filamenti indotti da Salmonella (SIF), che consentono alla Salmonella di sopravvivere e replicarsi all'interno delle cellule ospiti 9,10,11.

I metodi per visualizzare, tracciare e monitorare le localizzazioni degli effettori batterici ed esaminare il loro traffico e le interazioni all'interno delle cellule ospiti, forniscono informazioni critiche sui meccanismi alla base della patogenesi batterica. La marcatura e la localizzazione delle proteine effettrici T3SS secrete da Salmonella all'interno delle cellule ospiti si è dimostrata una sfida tecnologica12,13; Tuttavia, lo sviluppo di proteine fluorescenti codificate geneticamente ha trasformato la nostra capacità di studiare e visualizzare le proteine all'interno dei sistemi viventi. Tuttavia, la dimensione delle proteine fluorescenti (~25-30 kDa)15 è spesso paragonabile o addirittura superiore a quella della proteina di interesse (POI; ad esempio, 13,65 kDa per SsaP, 37,4 kDa per SifA). Infatti, la marcatura fluorescente delle proteine degli effettori spesso blocca la secrezione dell'effettore marcato e blocca il T3SS14.

Inoltre, le proteine fluorescenti sono meno stabili ed emettono un basso numero di fotoni prima del fotosbiancamento, limitando il loro uso nelle tecniche microscopiche a super-risoluzione16,17,18, in particolare nella microscopia di localizzazione della fotoattivazione (PALM), STORM e microscopia STED (stimolation emission depletion). Mentre le proprietà fotofisiche dei coloranti fluorescenti organici sono superiori a quelle delle proteine fluorescenti, metodi / tecniche come CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 e HA-Tags 24,25 richiedono un'appendice proteica o peptidica aggiuntiva che può compromettere la struttura-funzione della proteina effettrice di interesse interferendo con la modifica o il traffico post-traduzionale. Un metodo alternativo che riduce al minimo la necessaria modificazione proteica comporta l'incorporazione di ncAA in un POI durante la traduzione attraverso GCE. Gli ncAA sono fluorescenti o possono essere resi fluorescenti tramite chimica a scatto 12,13,26,27,28.

Utilizzando la GCE, le ncAA con gruppi piccoli, funzionali, bio-ortogonali (come un gruppo azide, ciclopropene o cicloottino) possono essere introdotte in quasi tutte le posizioni in una proteina bersaglio. In questa strategia, un codone nativo viene scambiato con un codone raro come un codone di arresto ambrato (TAG) in una posizione specifica nel gene del POI. La proteina modificata viene successivamente espressa nelle cellule insieme a una coppia ortogonale amminoacil-tRNA sintetasi/tRNA. Il sito attivo della tRNA sintetasi è progettato per ricevere solo un particolare ncAA, che viene quindi attaccato covalentemente all'estremità 3' del tRNA che riconosce il codone ambrato. L'ncAA viene semplicemente introdotto nel mezzo di crescita, ma deve essere assorbito dalla cellula e raggiungere il citosol dove l'amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) può collegarlo al tRNA ortogonale; viene quindi incorporato nel PDI nella posizione specificata (vedere Figura 1)12. Pertanto, GCE consente l'incorporazione sito-specifica di una pletora di gruppi reattivi bio-ortogonali come chetone, azide, alchino, cicloottino, transciclooctene, tetrazina, norbonene, α, ammide β-insatura e biciclo [6.1.0]-nonyne in un POI, superando potenzialmente i limiti dei metodi convenzionali di etichettatura delle proteine 12,26,27,28.

Le recenti tendenze emergenti nelle tecniche di imaging a super-risoluzione hanno aperto nuove strade per studiare le strutture biologiche a livello molecolare. In particolare, STORM, una tecnica a super-risoluzione basata sulla localizzazione, è diventata uno strumento inestimabile per visualizzare strutture cellulari fino a ~ 20-30 nm ed è in grado di studiare i processi biologici una molecola alla volta, scoprendo così i ruoli delle molecole intracellulari che sono ancora sconosciuti negli studi tradizionali con media di ensemble13 . Le tecniche a singola molecola e super-risoluzione richiedono un piccolo tag con fluorofori organici luminosi e fotostabili per la migliore risoluzione. Abbiamo recentemente dimostrato che GCE può essere utilizzato per incorporare sonde adatte per l'imaging a super-risoluzione12.

Due delle migliori scelte per la marcatura delle proteine nelle cellule sono biciclo [6.1.0] noninilisina (BCN) e trans-ciclooctene-lisina (TCO; mostrato in Figura 1), che può essere geneticamente codificato usando una variante della coppia tRNA/sintetasi (qui chiamata tRNAPyl/PylRS AF), dove Pyl rappresenta la pirrolisina, e AF rappresenta un doppio mutante razionalmente progettato (Y306A, Y384F) derivato da Methanosarcina mazei che codifica naturalmente la pirrolisina12, 29,30,31. Attraverso la reazione di cicloaddizione di Diels-Alder (SPIEDAC) promossa dalla tensione inversa, questi amminoacidi reagiscono chesomelettivamente con i coniugati tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tali reazioni di cicloaddizione sono eccezionalmente veloci e compatibili con le cellule viventi; Possono anche essere fluorogenici, se un fluoroforo appropriato è funzionalizzato con la porzione di tetrazina12,26,32. Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per il monitoraggio della dinamica degli effettori batterici consegnati nelle cellule ospiti utilizzando GCE, seguito dalla localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando dSTORM. I risultati indicano che l'incorporazione di un ncAA tramite GCE, seguita da una reazione a clic con coloranti fluorogenici contenenti tetrazina, rappresenta un metodo versatile per la marcatura selettiva, la visualizzazione delle proteine secrete e la successiva localizzazione subcellulare nell'ospite. Tutti i componenti e le procedure qui descritti possono tuttavia essere adattati o sostituiti in modo che il sistema GCE possa essere adattato per indagare su altre questioni biologiche.

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Protocollo

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1. Costruzione plasmidica

  1. Clonare il gene che esprime il POI in un plasmide di espressione (ad esempio, pET28a-sseJ 10TAG) che esprime il POI in E. coli BL21 (DE3). Questo passaggio facilita nel determinare che i mutanti sono funzionali.
  2. Per la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti, costruire un plasmide di espressione (pWSK29-sseJ-HA) che esprima il POI bersaglio SseJ sotto il controllo del suo promotore nativo, come descritto nei precedenti rapporti 7,12,24. Utilizzando la mutagenesi sito-diretta, sostituire il codone di fenilalanina-10 con un codone ambrato (TAG) in SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), assicurando il motivo AAT-TAG-ACT33,34.
  3. Oltre ai plasmidi di cui sopra, per l'incorporazione genetica della trans-ciclooct-2-en-L-lisina (TCO*A) in un POI, utilizzare un altro plasmide di espressione (pEVOL-PylRS-AF)31 che contiene la coppia evoluta tRNA/sintetasi (tRNAPyl/PylRS AF ) geni codificati nel plasmide pEVOL.
    NOTA: Le descrizioni dettagliate del plasmide e dei protocolli di clonazione sono descritte nella relazione precedente30,31.
  4. Utilizzare kit di preparazione del plasmide disponibili in commercio per ottenere DNA plasmidico di alta qualità. Per il DNA purificato, il rapporto ottimale 260/280 è ~ 1,8. Controllare la purezza del DNA utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%, se necessario.

2. Preparazione della coltura batterica

  1. Ottenere doppi trasformanti per verificare che il mutante sia funzionale in E. coli
    1. Prelevare le cellule competenti BL21 da -80 °C e scongelarle sul ghiaccio per circa 20-30 minuti.
    2. Mescolare 1-5 μL di ciascun plasmide (~50 ng di pEVOL-PylRS-AF e pET28a-sseJ 10TAG) con 200 μL di cellule BL21 chimicamente competenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Mescolare delicatamente le cellule competenti e la miscela di plasmidi; Incubare per 30 minuti su ghiaccio.
    3. Shock termico della provetta della microcentrifuga a bagnomaria a 42 °C per 45 secondi. Rimettere i tubi sul ghiaccio per 2 minuti.
    4. Aggiungere 1 mL di mezzo LB caldo al tubo della microcentrifuga e trasferire rapidamente la miscela in un tubo conico da 15 ml. Incubare le cellule a 37 °C in uno shaker a 250 rpm per 1 h. Placcare una parte o tutte le cellule trasformate su piastre di agar LB contenenti antibiotici appropriati. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
      NOTA: In questo protocollo, sono stati utilizzati 35 μg/mL di cloramfenicolo e 50 μg/mL di kanamicina per selezionare rispettivamente pEVOL-PylRS-AF e pET28a-sseJ 10TAG. Nella fase di trasformazione, valutare la trasformazione riuscita utilizzando controlli negativi e positivi.
  2. Trasferire il mutante in Salmonella per la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti:
    1. Aggiungere 2–3 μL ciascuno di pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG a 40–60 μL di Salmonella Typhimurium ceppo 14028s elettrocompetente in una provetta di microcentrifuga refrigerata. Mescolare delicatamente la miscela con una pipetta.
    2. Trasferire la miscela di elettroporazione in una cuvetta refrigerata (spazio tra gli elettrodi di 0,2 cm); impostare le impostazioni di elettroporazione su 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Posizionare la cuvetta all'interno della camera di elettroporazione. Assicurarsi che l'elettrodo della camera sia saldamente in contatto con la cuvetta del micro pulser.
    3. Tieni premuto il pulsante dell'impulso finché non emette un segnale acustico.
    4. Aggiungere immediatamente 1 mL di mezzo LB caldo nella cuvetta. Trasferire l'intero contenuto in un tubo conico da 15 ml. Incubare le cellule a 37 °C agitando a 250 giri/min per 1 ora.
    5. Placcare una parte o tutta la miscela elettroporazionale di Salmonella su una piastra di agar LB contenente antibiotici appropriati. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
      NOTA: In questo protocollo, 35μg/mL di cloramfenicolo e 100 μg/mL di ampicillina sono stati utilizzati per la selezione di pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG, rispettivamente.
  3. Preparazione della cultura
    1. Inoculare una singola colonia di Salmonella o E. coli in 5 ml di terreno LB contenente antibiotici appropriati. Crescere per una notte a 37 °C, agitando a 250 giri/min.

3. Espressione ed etichettatura fluorescente di proteine portatrici di ncAA

  1. Espressione di proteine portatrici di ncAA in E. coli
    1. Trasferire 100 μL di coltura primaria in 5 mL di terreno LB (diluizione 1:50) contenente 35 μg/mL di cloramfenicolo e 50 μg/mL di kanamicina, seguito da incubazione a 37 °C con agitazione a 250 giri/min fino a quando OD600 raggiunge 0,4-0,6.
    2. Preparare 1 mM di TCO*A di soluzione madre (10 mL; Tabella 1).
    3. Quando le colture raggiungono OD600 = 0,4-0,6, sostituire il mezzo LB con LB fresco contenente 1 mM TCO*A, 35 μg/mL di cloramfenicolo e 50 μg/mL di kanamicina.
      NOTA: In alternativa, è possibile preparare TCO*Una soluzione madre come descritto al punto 5.4.2.
    4. Indurre l'espressione proteica in presenza di 1 mM IPTG, 0,2% arabinosio e agitare per una notte a 34 °C, 250 rpm. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione per 5 minuti a 11.000 × g. Rimuovere il surnatante e congelare il pellet a -20 °C fino a un ulteriore utilizzo.
    5. Per un esperimento di controllo, ripetere lo stesso esperimento ma esprimere le proteine portatrici di ncAA in assenza di ncAA. Per la marcatura fluorescente in vitro di proteine contenenti ncAA in E. coli, seguire la procedura dettagliata descritta al punto 3.3.
  2. Espressione di proteine contenenti ncAA in Salmonella
    1. Trasferire 100 μL di coltura primaria in 5 mL di terreno LB (diluizione 1:50) contenente 35 μg/mL di cloramfenicolo e 100 μg/mL di ampicillina, seguito da incubazione a 37 °C con agitazione a 250 giri/min fino a quando OD600 raggiunge 0,6.
    2. Preparare il terreno N-minimo modificato (MgM, pH 5,6) come descritto nella Tabella 1.
    3. Sostituire il mezzo LB con un mezzo N-minimo modificato (MgM) integrato con 1 mM TCO*A (Tabella 1). Far crescere i batteri a 34 °C per 30 minuti. Quindi, aggiungere 0,2% arabinosio, 25 mg / ml di cloramfenicolo e 100 mg / ml di ampicillina e far crescere le cellule per altre 6 ore, agitando a 250 giri / min.
    4. Dopo 6 ore, lavare i batteri 4 volte per un intervallo di 30 minuti, con mezzi freschi di MgM (pH 5,6) (Tabella 1) senza ncAA. Nelle fasi di lavaggio, utilizzare 972 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.
    5. Centrifugare i batteri, risospendere in 1x tampone PBS e incubare per 1 ora a 4 °C al buio per rimuovere gli ncAA in eccesso. Dopo 1 ora, centrifugare i batteri a 3.000 × g, 4 °C per 15 minuti e conservare per un ulteriore utilizzo.
    6. Per un esperimento di controllo, ripetere lo stesso esperimento esprimendo proteine portatrici di ncAA in assenza di ncAA.
  3. Marcatura in vitro con fluorescenza di proteine contenenti ncAA in Salmonella Typhimurium
    1. Risospendere le cellule di Salmonella che esprimono SseJ-F10TCO-HA in assenza o presenza di TCO*A (dalla fase 3.2) in 1x PBS. Regolare l'OD600 su 4 in PBS. Incubare le cellule con 20 μM di Janelia Fluor 646-tetrazina (JF646-Tz) o 20 μM di BDP-Fl-tetrazina (5 mM di soluzioni madre in DMSO) a 37 °C al buio e agitare per 1-2 ore a 250 giri/min.
    2. Pellettare le cellule, lavare 3-4 volte con PBS contenente il 5% di DMSO e lo 0,2% di Pluronic F-127, risospendere in PBS contenente il 5% di DMSO e incubare per una notte a 4 °C al buio. Lavare nuovamente 2 volte con 1x PBS. Nelle fasi di lavaggio, utilizzare 972 × g, per 15 minuti a temperatura ambiente.
    3. Immagina immediatamente le cellule usando un microscopio confocale o fissale con paraformaldeide (PFA) all'1,5% in PBS per 30-45 minuti a temperatura ambiente al buio.
    4. Lavare le celle fisse 2x con PBS e infine in 50 mM NH4Cl in PBS per 15 minuti per rimuovere l'eccesso di PFA. Risospendere le cellule in PBS e conservare a 4 °C per non più di 3-4 giorni. Immagini dei batteri utilizzando la microscopia confocale come descritto nel paragrafo 6.

4. Caratterizzazione biochimica di proteine contenenti ncAA

  1. Lisi cellulare
    1. Risospendere le cellule dalla sezione 3.1 nel tampone di lisi (Tabella 1) e incubare a temperatura ambiente per più di 30 minuti. Raffreddare la miscela sul ghiaccio per 15 minuti.
      NOTA: mantenere il rapporto tra tampone di lisi e peso della cella utilizzato a 1:10.
    2. Sonica le cellule risospese mentre sei ancora sul ghiaccio. Pulsare per 30 s all'impostazione 7 almeno 6x, con intervalli di 1 minuto, utilizzando un sonicatore (vedere la tabella dei materiali).
    3. Ruotare il lisato cellulare a 20.500 × g, 4 °C per 15 minuti (mantenere 4 °C è fondamentale). Trasferire il surnatante in un tubo fresco e scartare il pellet.
  2. Analisi SDS-PAGE
    1. Preparare il colorante di caricamento SDS 5x (Tabella 1). Aggiungere 5 μL di tampone di carico gel SDS a 13 μL di lisato cellulare. Denaturare le proteine con tampone campione di sodio dodecilsolfato (SDS) in una provetta da 2 mL a 95 °C per 10 minuti, centrifugare la miscela a 2.000 × g per 50 s e caricare su un gel di poliacrilammide SDS al 12%.
    2. Assemblare la cassetta di gel, posizionarla in un apparecchio di elettroforesi su gel e collegare l'apparecchio di elettroforesi a un alimentatore elettrico. Versare il tampone corrente, caricare i marcatori di peso molecolare e i campioni proteici e far scorrere il gel a 100 V, fino a quando il bromofenolo raggiunge il fondo del gel risolvente.
      NOTA: Iniziare immediatamente l'analisi, poiché i lisati conservati a -20 °C tendono a perdere qualità dopo ogni ciclo di congelamento-scongelamento.
    3. Colorare il gel con la colorazione proteica blu Coomassie.

5. Marcatura bio-ortogonale dell'effettore secreto di Salmonella SseJ-F10TCO-HA nelle cellule HeLa

  1. Coltivare e mantenere le cellule HeLa a 37 °C, 5% CO2 e 95% di umidità in un mezzo di aquila modificato (DMEM) ad alto contenuto di glucosio (4,5 g / L) di Dulbecco, integrato con FBS al 10% (v / v) in aggiunta a penicillina-streptomicina (1x).
  2. Batteri di coltura 1 giorno prima dell'infezione. Inoculare una singola colonia di Salmonella 14028 che ospita pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG in 5 mL di brodo LB standard contenente antibiotici per una notte a 37 °C, agitando a 250 giri/min.
  3. Cellule HeLa seme 1 giorno prima dell'infezione. Prendere un pallone di coltura tissutale (T-75) contenente cellule HeLa a ~ 80% di confluenza, come determinato dall'esame microscopico della densità cellulare. Lavare le celle con PBS caldo. Staccare le cellule con 3 ml di tripsina/EDTA caldo allo 0,25% per 5 minuti a 37 °C, 5% CO2.
    1. Spegnere la tripsina utilizzando 2 ml di DMEM (+ 10% FBS). Trasferire l'intero contenuto del matraccio in una provetta da 15 mL dopo aver risospeso le cellule. Ruotare le cellule a 1.000 × g per 5 minuti. Togliere il surnatante dal tubo. Risospendere il pellet di cellule HeLa in substrato di crescita preriscaldato.
    2. Utilizzare un emocitometro per esaminare la sospensione e contare le cellule presenti. Preparare uno stock di cellule diluito a 1 × 105 celle/ml. Seme 0,5 × 105 cellule HeLa per pozzetto in 500 μL di DMEM + 10% di terreno di crescita FBS in un vetrino a otto pozzetti. Tenere la slitta della camera in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2, 95% di umidità per 24 ore.
  4. Infezione batterica
    1. Sottocoltura Salmonella 14028s contenente pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG, diluendo 100 μL di coltura batterica notturna (dalla fase 5.2) in 3 mL di terreno LB (diluizione 1:30) contenente 35 μg/mL di cloramfenicolo e 100 μg/mL di ampicillina, seguita da incubazione a 37 °C con agitazione a 250 giri/min per 5-7 ore.
      NOTA: Durante questa fase, le colture raggiungono la fase esponenziale tardiva e i batteri sono altamente invasivi.
    2. Preparare una soluzione madre TCO*A da 100 mM e un mezzo completo (Tabella 1).
    3. Per iniziare l'infezione delle cellule HeLa, estrarre le cellule HeLa dall'incubatore e lavare le cellule con DPBS preriscaldato prima di aggiungere 500 μL di DMEM fresco (+10% FBS) a ciascun pozzetto. Posizionare il vetrino della camera nell'incubatore di CO2 fino all'inizio dell'infezione.
    4. Dopo 5-7 ore di incubazione, diluire la coltura di Salmonella a OD600 = 0,2 in 1 mL di terreno di crescita DMEM (~3 × 108 ufc/mL). Aggiungere le quantità necessarie di inoculo di Salmonella in ciascun pozzetto del vetrino della camera in modo che la molteplicità di infezione (MOI) sia 100.
    5. Incubare le cellule infette in un incubatore di CO2 per 30 minuti. Lavare le cellule 3 volte con DPBS preriscaldato per rimuovere la Salmonella extracellulare. Impostare questo punto temporale su 0 h dopo l'infezione. Aggiungere 500 μL di terreno completo (Tabella 1) contenente 100 μg/mL di gentamicina per 1 ora. Dopo 1 ora, lavare le celle 3 volte con DPBS. Aggiungere 500 μL del mezzo completo (dal punto 5.4.2; Tabella 1) integrato con 0,2% arabinosio, 10 μg/mL di gentamicina per ciascun pozzetto del vetrino della camera.
    6. In un esperimento di controllo, eseguire infezioni simili di cellule HeLa senza TCO * A.
    7. Incubare il vetrino da camera per 10 ore nell'incubatore CO2 .
  5. Fare clic sull'etichettatura basata sulla chimica nelle celle vive
    1. Procedere all'etichettatura delle cellule infette da batteri. Preriscaldare il mezzo completo senza TCO*A (Tabella 1).
    2. Dopo 10 ore dall'infezione, sostituire il mezzo completo con un mezzo completo fresco senza TCO * A e lavare le celle HeLa 4 volte in un intervallo di 30 minuti ciascuna con DPBS preriscaldato, seguito da terreno completo fresco (senza TCO * A).
    3. Preparare una soluzione madre di colorante-tetrazina da 0,5 mM in DMSO.
      NOTA: Per l'etichettatura degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti, vengono presentati due protocolli. Per il protocollo 1, preparare la miscela di colorante diluendo il brodo JF646-Tz in 1x PBS contenente l'1% di caseina sodica di sale di latte bovino in modo che la soluzione di lavoro finale sia di 2 μM. Per il protocollo 2, preparare un mezzo completo caldo (senza FBS e TCO*A) e aggiungere 2 μM JF646-Tz. Rendi fresca questa miscela di coloranti per ogni sessione di etichettatura. Lavorare al buio, se possibile (abbassare le luci nella cappa e/o nella stanza).
    4. Dopo 12 ore dopo l'infezione, aspirare il mezzo dalle cellule. Lavare la cella con DPBS preriscaldato 2x o 3x. In un gruppo di pozzetti, aggiungere 500 μL della miscela di soluzione colorante descritta nel protocollo 1 e, in un altro gruppo di pozzetti dello stesso vetrino della camera, aggiungere 500 μL della miscela di soluzione colorante descritta nel protocollo 2 menzionato al punto 5.5.3 e nella nota successiva. Posizionare nuovamente i vetrini della camera nell'incubatore di CO 2 per 1,5-2 ore.
    5. Dopo 13,5-14 ore dopo l'infezione, sciacquare le cellule HeLa 2x con DPBS preriscaldato. Aggiungere 500 μL di DMEM fresco (integrato con FBS). Posizionare il vetrino della camera nell'incubatore per 30 minuti. Lavare le celle con DPBS preriscaldato seguito da DMEM fresco 4x per un intervallo di 30 minuti.
    6. A 16 ore dopo l'infezione, fissare le cellule HeLa con PFA aggiungendo 200 μL di PFA al 4% in ciascun pozzetto e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Aspirare il PFA, sciacquare 3 volte con PBS e conservare le cellule in PBS a 4 °C al buio.
      NOTA: PFA è una sostanza chimica altamente tossica. Evitare l'inalazione, così come il contatto con la pelle e gli occhi. Indossare dispositivi di protezione durante la manipolazione. Per evitare che il campione etichettato venga esposto alla luce, spegnere la luce nella cappa di coltura cellulare.
  6. Immunocolorazione di proteine marcate con HA
    1. Aspirare il PBS e risciacquare una volta in soluzione bloccante (Tabella 1).
    2. Incubare le cellule HeLa fisse con una soluzione di anticorpi primari a base di PBS (Tabella 1) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Utilizzare un anticorpo primario anti-HA di coniglio per colorare SseJ secreto (diluizione 1:500).
    3. Dopo 1 ora, lavare delicatamente le celle 2x con 0,5 ml di 0,1% Tween-20/1x PBS. Durante i lavaggi con soluzione Tween/PBS, incubare le cellule 3x con 0,5 mL di Tween20/1x PBS allo 0,1% per 5 minuti.
    4. Diluire l'anticorpo secondario dell'asino anti-coniglio 555 1:500 in soluzione anticorpale secondaria e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
    5. Dopo 1 ora, lavare delicatamente le cellule 2x con 0,5 mL di 0,1% Tween-20/1x PBS e incubare 2x con 0,5 mL di 0,1% Tween20/1x PBS per 5 min.
    6. Lavare le celle 3 volte con 0,5 ml di 1x PBS e conservarle a 4 °C al buio.
      NOTA: Le celle fisse possono essere conservate per un paio di settimane in PBS a 4 °C. L'immunocolorazione deve essere eseguita all'ultimo minuto.

6. Imaging confocale

  1. Utilizzare un microscopio confocale, come il disco rotante (SD) o il microscopio STED.
    1. Regolare le impostazioni di acquisizione delle immagini, ad esempio la modalità di scansione (XYZ), la velocità di scansione (400 Hz), la risoluzione (512 x 512), l'ingrandimento (100x) e lo stacking Z.
    2. Utilizzare i filtri di eccitazione/emissione corretti per DAPI, BDP-Tz e JF646 tetrazina.
      NOTA: Per questo protocollo, l'imaging confocale è stato eseguito su un sistema di microscopio STED dotato di un laser a luce bianca pulsata, che consente la selezione dell'eccitazione nell'intervallo 470-670 nm e un laser a diodi UV da 405 nm per l'eccitazione a 405 nm, 488 nm e 647 nm. Gli intervalli di emissione appropriati sono stati impostati utilizzando il beam splitter acusto-ottico incorporato in combinazione con un rilevamento spettrale multibanda sintonizzabile basato su prismi del sistema confocale.
    3. Acquisisci le immagini utilizzando un obiettivo di immersione in olio 100×/1.4.

7. Imaging a super-risoluzione (dSTORM)

  1. Accendere il microscopio 3 ore prima dell'imaging per consentire l'equilibrio termico (è più probabile che si verifichi una deriva se l'imaging inizia prima di questo). Raffreddare la fotocamera a -70 °C.
  2. Nel frattempo, preparare un nuovo tampone di imaging GLOX-BME (Tabella 1).
  3. Porta le cellule al microscopio. Posizionare la camera di imaging sul palco del microscopio nel supporto del campione. Nel supporto, assicurarsi che il campione sia piatto e sicuro. Cambiare il mezzo nel pozzetto con 0,4 mL del tampone di imaging GLOX-BME appena fatto.
  4. Impostare la linea laser e i set di filtri corretti. Diminuire la potenza del laser a ~ 1 mW per identificare una cella HeLa di interesse. Regolare il piano focale e l'angolo del fascio laser illuminando il campione con basse densità laser di 647 nm (in questo caso, si suggerisce un angolo fortemente inclinato [HILO], poiché HILO aumenta il segnale-sfondo [SBR]). Regolare l'angolo di illuminazione HILO.
    NOTA: In questo protocollo, l'imaging a super-risoluzione di SseJ è stato acquisito nel canale Alexa Fluor 647 utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito (vedere la Tabella dei materiali), dotato di un obiettivo TIRF (obiettivo ad immersione in olio Apo TIRF 100x, NA 1.49). La fluorescenza è stata rilevata con una telecamera EMCCD, controllata tramite μManager.
  5. Impostare il guadagno del preamplificatore su 3 e attivare il trasferimento del frame in μManager. Impostare EM-gain su 200 per una maggiore sensibilità nelle misurazioni dSTORM, come descritto in un precedente rapporto35.
  6. Prima dell'imaging dSTORM, acquisire un'immagine limitata dalla diffrazione di riferimento della struttura target. Passa i fluorofori allo stato scuro accendendo il laser alla sua massima potenza.
    NOTA: Singole molecole lampeggianti di fluorofori JF646 sono state osservate quando i fluorofori JF646 sono stati trasformati in uno stato prevalentemente scuro mediante illuminazione continua della luce di eccitazione a 647 nm, come descritto in precedenza36.
  7. Regolare la potenza del laser a un livello adeguato in cui gli eventi lampeggianti sono separati nello spazio e nel tempo, impostare il tempo di esposizione a 30 ms e iniziare l'acquisizione. Acquisisci 10.000-30.000 fotogrammi.
    NOTA: è necessario apportare modifiche alla forza del laser per ottimizzare il lampeggio. Prendi in considerazione l'aumento dell'intensità del laser se vengono rilevati troppi eventi (particelle lampeggianti che si sovrappongono). La lunghezza ideale dipende dalla qualità del campione, ma ~ 10.000 fotogrammi dovrebbero mostrare caratteristiche distinguibili.

8. Ricostruzione dell'immagine di dSTORM

  1. Utilizzare un software appropriato per l'analisi delle immagini.
    NOTA: ThunderSTORM, uno dei tanti programmi di ricostruzione di immagini open source disponibili, è brevemente descritto di seguito.
  2. Aprire ImageJ e importare i dati non elaborati. Apri il plug-in ThunderSTORM e configura l'impostazione della fotocamera corrispondente al dispositivo.
  3. Vai a Esegui analisi e imposta le impostazioni appropriate, come il filtraggio delle immagini (differenza dei filtri medi), i metodi di localizzazione (massimo locale) e la localizzazione sub-pixel delle molecole (PSF gaussiana integrata). Fare clic su OK per avviare la ricostruzione dell'immagine.
    NOTA: Se necessario, sono già state descritte istruzioni dettagliate per l'impostazione dei parametri in ThunderSTORM37.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo documento protocollare descrive un metodo basato su GCE per l'etichettatura fluorescente sito-specifica e la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella , come illustrato nella Figura 1. La struttura chimica del gruppo bioortogonale (TCO) transciclooctene contenente ncAA e del colorante fluorescente sono mostrati nella Figura 1A. La marcatura di SseJ è stata ottenuta mediante incorporazione genetica di n...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'approccio qui descritto è stato utilizzato per tracciare la posizione precisa delle proteine effettrici iniettate nella cellula ospite dal batterico T3SS dopo l'infezione. I T3SS sono impiegati da patogeni intracellulari come Salmonella, Shigella e Yersinia per trasportare componenti di virulenza nell'ospite. Lo sviluppo di tecnologie di imaging a super-risoluzione ha permesso di visualizzare fattori di virulenza con una risoluzione precedentemente inimmaginabile12,13,24

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da fondi di start-up della University of Texas Medical branch, Galveston, TX, e un premio Texas STAR a L.J.K. Ringraziamo il Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germania) per il plasmide pEVOL-PylRS-AF. Le immagini nella Figura 1 sono state create utilizzando BioRender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x Tris/Glicina SDS tampone di corsaBIO-RAD1610732
Cloruro di ammonioFischer ScientificA661-500
Solfato di ammonioFischer ScientificBP212R-1
Ampicillina SodicaSigma-AldrichA01665 g
Antibiotico-Antimicotico (100x)ThermiFischer Scientific15240096
ArabinosioSigma-AldrichA3256500 g
Avanti J-26XP (Centrifuga ad alte prestazioni)Beckman Coulter
Bacto-AgarBD Diagnostics, Franklin Lakes, USA214010
BDP-FL-tetrazinaLumiprobe (USA)2.14E+02
β-mercaptoetanoloMillipore444203250 mL
Blu di bromofenoloSigma-AldrichB8026
BSASigma-AldrichA4503500 g
CaseinaSigma-AldrichC8654
CatalasiSigma-AldrichC9322
CloramfenicoloSigma-AldrichC1919
Fare clic sull'aminoacido / trans-Cyclooct-2-en – L - Lisina (TCO*A)SiChem GmbHSC-8008Formato: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)Spettrofotometro InvitrogenH3570
DeNovix DS-11+DeNovix
DMEM*Corning10-013-CV*Utilizzato per il mantenimento di HeLa Cell
DMEM**Gibco11965-092**Utilizzato per l'infezione batterica in presenza di ncAA, vedere paragrafo 5.4.
DMSOSigma-AldrichD8418250 g
Asino anti-coniglio Alexa fluoro555 anticorpo secondarioInvitrogenA-31572
DPBS, 1xCorning21-031-CV
Ceppo E. coli BL21 (DE3)Novagen (Madison, WI)
EMCCD CameraAndoriXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)Eppendorf, Amburgo, Germania30123.328
Siero fetale bovino (FBS)Fischer10082147
Fisherbrand - Sterili (PVDF 0,22 &; micro; m)Fischer Scientific97203Confezione da 100
Gene Pulser Xcell ElettroporatoreBIO-RAD1652660
GentamicinaSigma-AldrichG127210 mL
Gibco L-Glutammina (200 mM), 100xFischer Scientific25-030-081
Glucosio ossidasiSigma-AldrichG7141-50KU
GliceroloFischer ScientificoBF229-4
Cellule HeLaATTCCCL-2
HEPES TamponeCorning25-060-C1100 mL
Acido cloridricoFischer ScientificA144-212
ImageJElaborazione e analisi delle immagini:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlueExpedeonISB1LColorante a base di Coomassie
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
Janelia Fluoro 646-tetrazinaTocris Bioscience7279
KanamicinaSigma-Aldrich606155 g
LB BrodoBD Difco244620500 g
LisozimaSigma-AldrichL6876
μ Manager (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MESSigma-AldrichM3671250 g
Cuvetta per micropulsatoreBIO-RAD165-20860,2 cm distanza tra gli elettrodi, confezione da 50
Nikon N-STORMNikon Instruments Inc.https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Fiasche per colture cellulariThermiFischer Scientific156499
Omnipur Casamino AcidCalbiochem2240500 g
Paraformaldehhyde (PFA)Microscopia elettronica Sciences 15710
PBS (10x)Roche11666789001
Soluzione di penicillina-streptomicina (100x)GenDEPOT CA005-010100 mL
pEVOL-PylRS-AFPer la costruzione e la mappa del plasmide vedere i seguenti riferimenti
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Kit di mini-preparazione del plasmideQiagen27106
plasmide pWSK29-sseJ10TAG-HARif.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmide pWSK29-sseJ-HARif.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                                                                                    Mappa vettoriale di PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127Millipore540025grado proteico, soluzione al 10%
Fosfato di potassio monobasicoFischer ScientificP285-500
Solfato di potassioAcros Inibitore organicodella
Cocktail Set I - Soluzione CalbiochemSigma-Aldrich539131100x
Anticorpo primario anti-HA di coniglioSigma-AldrichH6908
S. enterica. sierotipo Typhimurium 14028sRif.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
SaponinaSigma-Aldrich47036-50G-F
Dodecil solfato di sodio (SDS)Sigma-AldrichL3771
Idrossido di sodioFischer ScientificSS255-1
Piruvato di sodio (100 mM), 100xCorning25-060-C1100 mL
Smembratore sonico Modello 100Fischer Scientific24932
STED microsocpe (sistema Leica TCS SP8 STED 3X)Leica Microsystems, Wetzlar, Germaniahttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORMhttps://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Tripsina-EDTA (1x), 0,25%   GenDEPOT CA014-010
Tween-20Sigma-AldrichP9416100 mL
X-well vetrini per camera di coltura tissutaleSARSTEDT94.6190.802
Filtri per siringhe proteasi 424220250

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116(2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311(2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335(2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789(2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050(2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12(2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292(2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811(2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715(2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261(2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314(2022).

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