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Articolo metodologico

Un modello murino di intubazione orotracheale e chirurgia ventilata di ischemia polmonare riperfusione

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⸱

DOI:

10.3791/64383

⸱

9 settembre 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco and San Francisco General Hospital, 2Department of Physiology, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, 3Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Un modello chirurgico murino per creare lesioni da ischemia polmonare sinistra (IR) mantenendo la ventilazione ed evitando l'ipossia.

Abstract

Il danno da ischemia da riperfusione (IR) deriva frequentemente da processi che comportano un periodo transitorio di interruzione del flusso sanguigno. Nel polmone, l'IR isolata consente lo studio sperimentale di questo specifico processo con ventilazione alveolare continua, evitando così i processi dannosi composti di ipossia e atelettasia. Nel contesto clinico, il danno da ischemia da riperfusione polmonare (noto anche come IRI polmonare o LIRI) è causato da numerosi processi, inclusi ma non limitati a embolia polmonare, trauma emorragico rianimato e trapianto di polmone. Attualmente ci sono limitate opzioni di trattamento efficaci per LIRI. Qui, presentiamo un modello chirurgico reversibile di IR polmonare che coinvolge prima l'intubazione orotracheale seguita da ischemia unilaterale del polmone sinistro e riperfusione con ventilazione alveolare preservata o scambio gassoso. I topi subiscono una toracotomia sinistra, attraverso la quale l'arteria polmonare sinistra viene esposta, visualizzata, isolata e compressa utilizzando un nodo reversibile. L'incisione chirurgica viene quindi chiusa durante il periodo ischemico e l'animale viene risvegliato ed estubato. Con il topo che respira spontaneamente, la riperfusione viene stabilita rilasciando il nodo scivoloso attorno all'arteria polmonare. Questo modello di sopravvivenza clinicamente rilevante consente la valutazione del danno IR polmonare, della fase di risoluzione, degli effetti a valle sulla funzione polmonare, nonché di modelli a due colpi che coinvolgono la polmonite sperimentale. Sebbene tecnicamente impegnativo, questo modello può essere padroneggiato nel corso di poche settimane o mesi con un eventuale tasso di sopravvivenza o successo dell'80% -90%.

Introduzione

La lesione da riperfusione ischemia (IR) può verificarsi quando il flusso sanguigno viene ripristinato in un organo o in un letto di tessuto dopo un certo periodo di interruzione. Nel polmone, l'IR può verificarsi isolatamente o in associazione con altri processi dannosi come infezione, ipossia, atelettasia, volutrauma (da alti volumi correnti durante la ventilazione meccanica), barotrauma (picchi elevati o pressioni sostenute durante la ventilazione meccanica) o contusioni polmonaricontundenti (non penetranti) 1,2,3 . Rimangono diverse lacune nella nostra conoscenza dei meccanismi di LIRI e dell'impatto dei processi concomitanti (ad esempio, infezione) sugli esiti LIRI, e anche le opzioni di trattamento per LIRI sono limitate. È necessario un modello in vivo di LIRI puro per identificare la fisiopatologia del danno IR polmonare in isolamento e per studiare il suo contributo a qualsiasi processo multi-hit di cui il danno polmonare è una componente.

I modelli IR polmonari murini possono essere utilizzati per studiare la fisiopatologia polmonare specifica di più processi, tra cui il trapianto polmonare3, l'embolia polmonare4 e la lesione polmonare a seguito di trauma emorragico con rianimazione5. I modelli attualmente utilizzati includono il trapianto polmonare chirurgico6, il clampaggio ilare7, la perfusione polmonare ex vivo 8 e il polmone ventilato IR9. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello IR polmonare ventilato murino di danno polmonare sterile. Ci sono molteplici vantaggi di questo approccio (Figura 2), tra cui che induce ipossia minima e atelettasia minima, ed è un modello di chirurgia di sopravvivenza che consente studi a lungo termine.

I motivi per scegliere questo modello di LIRI rispetto ad altri modelli come il clampaggio ilare e i modelli di perfusione ex vivo sono i seguenti: questo modello riduce al minimo i contributi infiammatori di atelettasia, ventilazione meccanica e ipossia; preserva la ventilazione ciclica; mantiene intatto un sistema immunitario circolatorio in vivo che può rispondere alla lesione IR; Infine, come procedura di sopravvivenza, consente l'analisi a lungo termine dei meccanismi di generazione di lesioni secondarie (modelli 2-hit) e risoluzione delle lesioni. Nel complesso, riteniamo che questo modello IR polmonare ventilato fornisca la forma "più pura" di lesione IR che possa essere studiata sperimentalmente.

Altre pubblicazioni hanno descritto l'uso dell'intubazione orotracheale dei topi per eseguire iniezioni o installazioni IT10,11, ma non come punto di partenza per un intervento chirurgico di sopravvivenza come in questo modello. Il posizionamento di un tubo orotracheale consente l'esecuzione della chirurgia polmonare consentendo il collasso del polmone operativo. Consente inoltre il regonfiamento del polmone alla fine della procedura, che è fondamentale per il pneumotorace e per la capacità del topo di tornare alla ventilazione spontanea al termine delle procedure. Infine, la rimozione del tubo orotracheale assicurato è una procedura semplice che, a differenza di una tracheotomia invasiva, è compatibile con un intervento chirurgico di sopravvivenza. Ciò consente studi di ricerca a lungo termine incentrati sulla comprensione della progressione e della risoluzione del LIRI e dei disturbi associati, nonché sulla creazione di modelli di lesioni croniche.

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Protocollo

Tutte le procedure e le fasi descritte di seguito sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università della California di San Francisco. È possibile utilizzare qualsiasi ceppo di topo, sebbene alcuni ceppi abbiano una risposta infiammatoria IR polmonare più robusta rispetto ad altri12. I topi che hanno circa 12-15 settimane di età (30-40 g) o più anziani tollerano e sopravvivono alla chirurgia IR polmonare meglio dei topi più giovani. Sia i topi maschi che le femmine possono essere utilizzati per questi interventi chirurgici.

1. Protocollo di intubazione del topo

  1. Anestesia e preparazione per l'intubazione
    1. Pulire l'addome del topo con un tampone di etanolo. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo (250-400 mg/kg). Valutare la profondità appropriata dell'anestesia dalla mancanza di riflesso di ritiro del pedale. Posizionare un unguento lubrificante per gli occhi ora o più tardi (passaggio 2.1.4).
      NOTA: Per questa procedura, il tribromoetanolo (e l'etomidato come opzione alternativa) fornisce un piano anestetico stabile senza influire sulle condizioni emodinamiche richieste per questo intervento chirurgico. Questo anestetico viene utilizzato solo una volta per evitare il rischio di aderenze peritoneali. Anche l'isoflurano potrebbe essere usato, ma non lo usiamo qui. Il praticante è libero di usare qualsiasi ricetta anestetica ritenga opportuna.
    2. Posizionare il topo anestetizzato su un supporto per intubazione o un supporto di plastica in posizione supina, sospeso dagli incisivi superiori su suture 4-0 ad anello (seta o altro) su due ancoraggi di supporto.
    3. Per mantenere il topo immobilizzato durante la procedura di intubazione, fissare liberamente la parte inferiore del torace (o entrambi gli arti superiori) alla piattaforma.
    4. Posizionare delicatamente la luce flessibile a fibre ottiche sulla trachea del mouse, leggermente al di sotto delle corde vocali. Regolare il livello di illuminazione in modo che sia visibile solo un campo scuro quando si guarda nell'orofaringe del topo, ad eccezione della luce rossa che emana da sotto le corde vocali, dimostrando il bersaglio per l'eventuale posizionamento del tubo endotracheale. Si noti che i movimenti delle corde vocali dovrebbero essere visibili ad occhio nudo o, se necessario, sotto ingrandimento.
  2. Procedura di intubazione
    1. Tenere le pinzette con la mano dominante e usarle per afferrare delicatamente e tirare la lingua fuori dalla cavità orale.
    2. Aprire la mascella inferiore usando una pinza tenuta dalla mano non dominante, quindi spingere la pinza nella laringe per sollevare delicatamente l'epiglottide. In questo momento, rilascia la lingua dalle pinzette.
    3. Cerca le corde vocali. Dovrebbero aprirsi e chiudersi secondo ogni respiro. Tenendo la cannula con il filo guida precaricato, inserire la punta del filo attraverso le corde vocali.
    4. Facendo molta attenzione a non muovere il filo tenendo una porzione di esso che si trova all'esterno della cannula ma appena sopra le corde vocali, ritirare la cannula, lasciando solo il filo in posizione con la sua estremità distale all'interno della trachea.
    5. A questo punto, eseguire una seconda visualizzazione delle corde vocali per confermare che la punta distale del filo rimane passata attraverso le corde vocali illuminate e nella trachea e non si trova nell'esofago spento.
    6. Tenere il filo fuori dalla bocca con la pinza curva nella mano sinistra, stabilizzata contro una superficie dura, e far avanzare con attenzione il catetere 20G con ali di nastro sul filo.
    7. Una volta che l'estremità distale del filo emerge dall'estremità posteriore del catetere 20G o del tubo endotracheale, tenere quell'estremità con la pinza curva e far avanzare dolcemente il catetere 20G nella trachea.
    8. Rimuovere con cautela il filo dall'estremità distale del catetere 20G con la pinza curva senza rimuovere il posizionamento del catetere.
    9. Collegare brevemente il catetere al ventilatore prima di fissarlo per confermare il corretto posizionamento nella trachea e non nell'esofago. Confermare il posizionamento tracheale osservando i movimenti bilaterali della parete toracica dipendenti dalla ventilazione meccanica e l'assenza di gonfiaggio dello stomaco.
  3. Post-intubazione
    1. Scollegare il catetere dal ventilatore. Fissare le ali del nastro (attaccate al catetere) attraverso il labbro inferiore del mouse utilizzando una sutura vicrylica 4-0 per fissare saldamente il tubo endotracheale (ETT) al mouse durante tutte le successive procedure / manipolazioni.
      NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare nastro di seta o altro nastro per fissare l'ETT, tuttavia è necessario prestare attenzione per evitare lo spostamento dell'ETT durante il movimento dell'animale dalla slitta di intubazione alla superficie chirurgica.
    2. Rimuovere con cautela il mouse dalla slitta di intubazione. Collegare brevemente il catetere al ventilatore impostato a un volume corrente di 0,2-0,225 ml e una frequenza respiratoria di 120-150 respiri al minuto per confermare il corretto posizionamento tracheale del tubo orotracheale e quindi disconnettere con il topo che respira spontaneamente attraverso il tubo orotracheale.
    3. Non lasciare l'animale incustodito da questo punto in poi fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la sdraiata sternale alla fine della procedura.

2. Ischemia polmonare e protocollo chirurgico di riperfusione (IR)

  1. Analgesia e preparazione del sito chirurgico
    1. Pulire l'addome del topo con un tampone etanolo e iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via intraperitoneale.
    2. Rasare i capelli sulla zona del torace sinistro fino alla scapola sinistra. Rimuovere i peli rasati in eccesso con tamponi imbevuti di alcool.
      NOTA: I passaggi 2.1.1 e 2.1.2 possono essere eseguiti anche prima dell'intubazione se vi è preoccupazione per lo spostamento dell'ETT quando fissato con nastro di seta.
    3. Posizionare il mouse su un pad riscaldante in posizione laterale sinistra o ruotata di 3/4 e collegare il tubo tracheale sul ventilatore con un volume corrente di 0,2-0,225 ml (~ 8 mg / kg) e una frequenza respiratoria di 120-150 respiri al minuto. Non utilizzare ossigeno supplementare per questa procedura.
    4. Applicare il lubrificante per gli occhi con un tampone sterile di cotone. Ruotare il mouse a 3/4 del lato sinistro verso l'alto e immobilizzare tutti e quattro gli arti e la coda con nastro da laboratorio.
    5. Disinfettare la zona della pelle rasata e la pelliccia circostante con povidone-iodio e attendere che la soluzione si asciughi. Quindi coprire il campo chirurgico con un drappo sterile o un film plastico trasparente e creare un'apertura rettangolare nel drappo o nel film plastico per il campo chirurgico.
  2. Procedura chirurgica
    1. Confermare il livello appropriato di anestesia (fornito dalla somministrazione di tribromoetanolo e buprenorfina come descritto in precedenza) testando la risposta al pizzico del piede.
    2. Usando un paio di forbici affilate e un paio di pinze più grandi (pinze a pattern stretto o simili), fai un'incisione cutanea trasversale di 2 cm sotto l'angolo inferiore della scapola nel torace laterale sinistro. Usa le forbici e un paio di pinze più fini (pinze extra fini o simili) per tagliare lo strato muscolare e sezionare fino alle costole.
    3. Identificare il secondo spazio intercostale e tenere la seconda costola con la pinza extra fine. Tirando la costola verso l'alto, utilizzare una lama sterile #11 o #12 (curva) per bisturi (senza maniglia necessaria) per entrare nello spazio pleurico separando e tagliando attraverso i muscoli intercostali del 2 ° -3° spazio. Prendi in considerazione la sospensione della ventilazione per ridurre le lesioni all'apice del polmone sinistro.
    4. Inserire tre divaricatori sterilizzati. Utilizzare il riavvolgitore cefalo più piccolo / più stretto lungo l'orientamento delle costole, il divaricatore di medie dimensioni a sinistra lungo la 2 ° costola e il più grande divaricatore a destra lungo la superficie della 3° costola.
    5. Aprire il torace con una retrazione lenta e progressiva utilizzando le corde elastiche del divaricatore. Esporre e identificare l'arteria polmonare sinistra (PA) spostando l'apice del polmone sinistro con un tampone sterile di cotone.
    6. Utilizzare le micro pinze, le pinze ultrafini nella mano destra e le pinze dilatatorie PA o vaso nella mano sinistra, per esporre delicatamente e creare il campo in cui il PA sinistro e il bronco sono entrambi visibili.
    7. Usando la pinza PA, prendi il PA sinistro e tira delicatamente ma saldamente verso l'alto e cefalade per visualizzare il bronco trasparente sottostante. Aumentare l'ingrandimento sul microscopio a dissezione (vedere l'elenco delle apparecchiature per maggiori dettagli) a questo punto al massimo (2x).
      NOTA: Sterilizzare tutte le apparecchiature prima dell'uso. Inoltre, per mantenere la sterilità, solo le punte degli strumenti chirurgici dovrebbero entrare nel campo chirurgico sterile.
    8. Mentre si ritrae il PA lontano dal bronco, passare con attenzione la pinza ultrafine chiusa attraverso lo spazio tra il PA sinistro e il bronco. Quindi, usa queste pinze per tenere e tirare un 7-0 o 8-0 sutura di prolene attraverso lo spazio tra l'arteria polmonare sinistra (sopra) e il bronco (sotto).
    9. Circondare il PA sinistro legando un nodo per creare un'occlusione nel PA. L'interruzione del flusso sanguigno è facilmente visualizzabile al microscopio. Questo segna l'inizio del periodo ischemico.
    10. Esternare l'estremità libera del nodo attraverso un diverso punto di ingresso nel torace anteriore sinistro utilizzando un ago 24G-28G e fissare l'estremità della sutura con un piccolo pezzo di nastro adesivo per una più facile identificazione in seguito.
    11. Rigonfiare il polmone per espellere quanta più aria possibile dalla cavità toracica utilizzando una valvola / tubo PEEP sul ventilatore del roditore. Quindi, chiudere la gabbia toracica con due suture di nylon 4-0 interrotte.
    12. Chiudere lo strato muscolare e sottocutaneo con una sutura di nylon 4-0 in esecuzione. Quindi applicare due o tre gocce di bupivacaina topica (0,5%) all'incisione. Utilizzare una sutura di nylon 4-0 per chiudere lo strato di pelle con una sutura corrente.
  3. Assistenza post-operatoria
    1. Quando la ventilazione spontanea è ripresa, scollegare il tubo endotracheale dal ventilatore ed estubare il topo.
    2. Posizionare il mouse sul pad riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante il recupero post-anestesia.
    3. Monitorare attentamente il mouse durante il recupero dall'anestesia generale. Tirare delicatamente lo slipknot esternalizzato alla fine del periodo ischemico (30 min o 1 h).
    4. Spostare il mouse dal pad riscaldante a una gabbia una volta che ha mostrato segni di recupero: auto-raddrizzamento e / o movimento.
    5. Dopo il periodo di riperfusione (1 ora o 3 ore), eutanasia l'animale e raccogliere il sangue mediante puntura cardiaca e tessuto polmonare per ulteriori analisi. Per 1 ora di riperfusione, raccogliere plasma per ELISA, tessuto per RNA e analisi delle proteine; Per 3 ore di riperfusione, raccogliere inoltre il tessuto per l'istologia.

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Risultati

Infiammazione generata da lesione unilaterale ventilata da ischemia polmonare sterile (IR): dopo 1 ora di ischemia, abbiamo osservato un aumento dei livelli di citochine nel siero e all'interno del tessuto polmonare sia mediante ELISA che qRT-PCR che hanno raggiunto il picco a 1 ora dopo la riperfusione e sono tornati rapidamente al basale entro 12-24 ore dopo la riperfusione13. Per i campioni raccolti a 3 ore dopo la riperfusione, abbiamo osservato un'intensa infiltrazione di neutrofili all'inter...

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Discussione

Questo manoscritto descrive in dettaglio i passaggi coinvolti nell'esecuzione del modello IR polmonare ventilato sviluppato da Dodd-o et al.9. Questo modello ha contribuito a identificare i percorsi molecolari coinvolti nella generazione e risoluzione dell'infiammazione da IR polmonare in isolamento 14,15,16,17, IR polmonare in combinazione con infezione coesistente 18 e IR polmonare in relazione all'asse intestino-polmone e al contributo del microbioma intestinale

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal supporto dipartimentale del Dipartimento di Anestesia e Cure Perioperatorie, dell'Università della California di San Francisco e del San Francisco General Hospital, nonché da un premio NIH R01 (ad AP): 1R01HL146753.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
Tubo luminoso in fibra otticaCole-ParmerUX-41720-65Tubo luminoso in fibra ottica
Sorgente luminosa in fibra otticaAmScopeSKU: CL-HL250-BSorgente luminosa per luci a fibre ottiche
Germinator 500Cell Point Scientific, Inc.No.5-1450Termoforo sterilizzatore per perline
AIMS14-370-223Opzione alternativa
Kit per la toelettatura agli ioni di litio (tagliacapelli)Prodotti per la casa WAHLSKU 09854-600BPer rimuovere i peli di topo sul sito chirurgico
MicroscopioNikonSMZ-10Altre opzioni più recenti disponibili sul sito web dell'azienda
Ventilatore MiniVentModello di apparecchio Havard 845Ventilatore per topi
Pulitore ad ultrasuoniCole-ParmerUX-08895-05Strumenti di pulizia che sono stati utilizzati durante il funzionamento
Tappetino riscaldanteKent ScientificRT-0501Per mantenere il mouse caldo durante il recupero da un intervento chirurgico
BilanciaCole-ParmerUX-11003-41Bilancia
Strumenti chirurgici
Sutura di seta 4-0Ethicon683GPer la chiusura dello strato muscolare
7-0 Sutura in proleneEthicon IndustryEP8734HUtilizzo per fare un nodo scorsoio dell'arteria polmonare sinistra
Bard-Parker (11) Bisturi (lama chirurgica in acciaio al carbonio Rib-Back, sterile, monouso)Aspen Surgical372611Per entrare nella cavità toracica (opzione 1)
Bard-Parker (12) BisturiAspen Surgical372612Per l'ingresso nella cavità toracica (opzione 2)
Pinza Graefe extra fineFST11150-10Pinza per il mantenimento di muscoli/costole
Sistema di retrazione del fissatore magneticoFST1. Piastra di base (n. 18200-03)
2. Fissatori (n. 18200-01)
3. Divaricatori (da 18200-05 a 18200-12)
4. Elastomero (n. 18200-07) 5. Divaricatore (n. 18200-08)		Sistema di retrazione per piccoli animali
Ago ipodermico standard monojectCOVIDIEN05-561-20Per la somministrazione di farmaci
Pinze a modello strettoFST11002-12Pinze a livello cutaneo
Porta ago/Cacciavite per aghiFST12565-14per tenere gli aghi
AghiBD305110Ago calibro 26 per esternalizzare il nodo scorsoio (va bene anche l'ago calibro 24 o 26
PA / Pinza dilatatrice vascolareFST00125-11Per tenere PA; pinza non dannosa
ForbiciFST14060-09Utilizzato per l'incisione e il taglio dello strato muscolare durante la chirurgia
Micro pinza Dumont ultra fineFST11295-10 (pinza Dumont #5, punta per biologia, dimensione della punta: 0,05 * 0,02 mm, 11 cm)Per il passaggio attraverso lo spazio tra l'arteria polmonare sinistra e i bronchi
reagenti
0,25% BupivacainaHospira, Inc.0409-1159-02Analgesico topico utilizzato durante la chiusura chirurgica della ferita
Avertin (2,2,2-Tribromoetanolo)Sigma-AldrichT48402-25GAnestetico, utilizzando per anestetizzare il topo per la chirurgia IR, la concentrazione utilizzata nella chirurgia IR è 250-400 mg / kg.
BuprenorfinaCovetrus North America59122Analgesico: la concentrazione utilizzata per la chirurgia è 0,05-0,1 mg/kg
Lubrificante per gli occhiBAUSCH+LOMBLubrificante lenitivo Unguento per gli occhiAllevia la secchezza dell'occhio
Soluzione di iodio povidone al 10%MEDLINE INDUSTRIES INCSKU MDS093944H (2 FL OZ, antisettico topico)Liquido topico applicato per un efficace antisettico di primo soccorso all'inizio dell'intervento chirurgico
Materiali
Tampone imbevuto di alcolMarca BD  BD 326895per la sterilizzazione dell'area di iniezione e chirurgia
Film plasticoKIRKLANDStretch-Tite premiumAlternativa per coprire il campo chirurgico sterilizzato (più conveniente)
Teli chirurgici per roditoriStoelting50981Campo sterile o telo per il campo chirurgico
Applicazione sterile con punta in cotonePwi-Wnaps703033utilizzato per l'applicazione di lubrificante
Top SpugneDukal CorporatonReorder # 5360Fermare il sanguinamento da pelle / muscolo
IP ) per gli occhi

Riferimenti

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