Articolo metodologico

Una tecnica modificata per la costrizione aortica trasversale nei topi

DOI:

10.3791/64386

⸱

18 agosto 2022

 ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Hubei Key Laboratory of Genetics and Molecular Mechanism of Cardiological Disorders, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive una tecnica modificata e semplificata con una procedura di costrizione aortica trasversale mini-invasiva (TAC) utilizzando un divaricatore autocostruito. Questa procedura può essere condotta senza un ventilatore o un microscopio e introduce un sovraccarico di pressione, portando infine a ipertrofia cardiaca o insufficienza cardiaca.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La costrizione aortica trasversa (TAC) è un intervento chirurgico frequentemente utilizzato nella ricerca sull'insufficienza cardiaca e l'ipertrofia cardiaca basata sulla formazione di sovraccarico di pressione nei modelli murini. La sfida principale di questa procedura è visualizzare chiaramente l'arco aortico trasversale e fasciare con precisione il vaso bersaglio. Gli approcci classici eseguono una toracotomia parziale per esporre l'arco aortico trasverso. Tuttavia, è un modello a torace aperto che causa un trauma chirurgico piuttosto grande e richiede un ventilatore durante l'intervento chirurgico. Per evitare traumi inutili e semplificare la procedura operativa, l'arco aortico viene avvicinato attraverso la proporzione prossimale dello sterno, raggiungendo e legando la nave bersaglio utilizzando un piccolo divaricatore autocostruito che contiene una trappola. Questa procedura può essere eseguita senza entrare nella cavità pleura e non richiede un ventilatore o un'operazione microchirurgica, che lascia i topi con schemi respiratori fisiologici, semplifica la procedura e riduce significativamente i tempi operativi. A causa dell'approccio meno invasivo e del minor tempo operativo, i topi possono subire meno reazioni di stress e recuperare rapidamente.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'insufficienza cardiaca è un sintomo clinico complesso che deriva da una compromissione della struttura e della funzione del riempimento ventricolare o dell'espulsione del sangue1. Lo stadio della malattia è definito principalmente attraverso la classificazione della funzione della New York Heart Association in base alla gravità dei sintomi e all'attività fisica2. Per quei pazienti con una frazione di eiezione superiore al 50%, anomalie strutturali e/o funzionali hanno generato peptidi natriuretici per supportare la diagnosi di insufficienza cardiaca con frazione di eiezione conservata (HFpEF)2. La cardiopatia ischemica è una delle principali cause tra le molteplici eziologie dell'insufficienza cardiaca. Pertanto, il modello di infarto miocardico (come la legatura coronarica permanente) viene spesso utilizzato per studiare la fisiopatologia dopo ipoperfusione cardiaca o danno da ischemia-riperfusione 3,4. Oltre al danno miocardico acuto, altri fattori di rischio come ipertensione, diabete, obesità e una storia familiare di cardiomiopatia contribuiscono anche allo sviluppo di insufficienza cardiaca. Dopo che i pazienti superano lo stadio A (a rischio di insufficienza cardiaca) ed entrano nello stadio B (pre-insufficienza cardiaca), si verifica una modifica strutturale1. Ad esempio, i pazienti ipertesi passano prima attraverso l'ipertrofia adattativa del ventricolo sinistro e poi gradualmente si sviluppano in ipertrofia cardiaca disadattiva e transitano verso l'insufficienza cardiaca attraverso il rimodellamento patologico5.

Come stadio terminale di varie malattie cardiovascolari, l'insufficienza cardiaca cronica è stata studiata per decenni6. Diversi modelli murini sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sull'insufficienza cardiaca, tra cui l'infusione di farmaci (angiotensina II), i disturbi metabolici (diabete o dieta ad alto contenuto calorico) e la costrizione aortica7. Tra questi modelli, la perfusione dell'angiotensina II è accompagnata da vari effetti collaterali degli organi, come il rene7. L'induzione di disturbi metabolici di solito richiede un periodo di tempo piuttosto lungo. La costrizione aortica ascendente è stata considerata di scarsa rilevanza per la malattia umana7.

La TAC è un modello affidabile che aumenta il postcarico e induce ipertrofia cardiaca e insufficienza cardiaca8. Il modello TAC a torace aperto è stato descritto per la prima volta da Rockman et al. ed è stato utilizzato in numerosi laboratori in tutto il mondo9. Tuttavia, questa classica procedura TAC provoca un trauma piuttosto grande ai topi e cambia il loro comportamento normale, che può richiedere un lungo tempo di recupero e disturbare l'ulteriore trattamento10. Altre procedure TAC a torace chiuso modificate hanno ridotto alcuni passaggi invasivi, ma hanno richiesto abilità microchirurgiche o ventilazione meccanica10,11.

Il presente protocollo descrive un metodo passo-passo con un approccio minimamente invasivo all'arco aortico utilizzando un divaricatore autocostruito tramite un'incisione della linea mediana di 3 mm del bordo superiore dello sterno. Questo modello non richiede abilità microchirurgiche, ventilazione meccanica o taglio attraverso le costole, fornendo così un modo rapido, limitato al trauma chirurgico, semplice ed economico per eseguire la chirurgia TAC.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'attuale protocollo è approvato dal comitato etico del Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Cina. Questa procedura viene eseguita su topi maschi adulti C57/BL6 (>10 settimane di età). Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave prima dell'operazione.

1. Preparazione dello strumento chirurgico

  1. Preparare una siringa da 5 mL e pizzicare la punta dell'ago con un portaago per smussarlo.
  2. Preparare un ago da 27 G e smussarlo con un portaaghi. Tagliare la punta dell'ago con forbici oftalmiche è un modo alternativo per smussare l'ago.
  3. Piegare la punta dell'ago da 27 G di 90°.
    NOTA: Questo ago verrà utilizzato come distanziatore per legare con l'aorta per la costrizione del vaso.
  4. Utilizzare un filo di ferro ottenuto commercialmente (grado medico, 0,5 mm di diametro, vedi Tabella dei materiali) e spago attorno all'ago (Figura 1A). Formare una piccola trappola o un cappio sulla punta smussata dell'ago (Figura 1B).
    NOTA: Questo strumento riutilizzabile agisce come uno speciale divaricatore autocostruito e consente di passare la sutura di seta sotto l'aorta negli ultimi passaggi.
  5. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico (compreso l'apposito divaricatore realizzato sopra) per sterilizzarli.

2. Preparazione degli animali

  1. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital sodico (50 mg/kg, vedere Tabella dei materiali) in base al peso corporeo. Per via sottocutanea iniettare localmente 100 μL di lidocaina allo 0,5% nell'area chirurgica.
  2. Confermare che il mouse sia completamente anestetizzato pizzicando la punta del mouse con la punta della pinza.
  3. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  4. Rimuovere i peli dalla gola e dalla parte superiore del torace con crema depilatoria o un tagliacapelli.
  5. Disinfettare l'area non pelata con tre scrub alternati di iodio e etanolo al 70% in cerchi concentrici che si muovono verso l'esterno.
  6. Posizionare il mouse in posizione supina su una piastra riscaldante coperta da un drappo sterile con la testa rivolta verso l'operatore. Fissare le estremità con nastro adesivo e incisivi con una sutura 4-0 (Figura 2A).
  7. Inserire una sonda rettale (vedere Tabella dei materiali) per monitorare la temperatura corporea durante l'operazione. Mantenere la temperatura corporea a 37 °C durante l'intera operazione.
  8. Indossare un paio di guanti sterili.
    NOTA: Una volta indossati i guanti sterili, non toccare altre aree o oggetti non sterilizzati.
  9. Tagliare un foro (1-1,5 cm di diametro) in un nuovo drappo sterile monouso con forbici oftalmiche sterilizzate. Posizionare il drappo sterile sul mouse e assicurarsi che il campo operatorio non peloso sia visibile attraverso il foro.
    NOTA: Questo passaggio consente all'operatore di evitare di toccare altre aree non sterilizzate, il che aiuta a mantenere condizioni sterili durante l'intervento chirurgico.

3. Costrizione dell'aorta trasversale

  1. Praticare un'incisione cutanea verticale di 1,5 cm a livello della tacca soprasternale (Figura 2B) con lama di bisturi. Espandere l'incisione cutanea fino al livello dell'angolo sternale.
    NOTA: La tacca soprasternale è una tacca situata sul bordo superiore dello sterni del manubrio. È un simbolo di superficie che può essere rilevato quando vengono rimossi i peli del topo (Figura 2B). L'angolo sternale è l'articolazione tra manubrium sterni e corpora sterni. Quando lo sterno è esposto, si presenta come una linea bianca orizzontale sullo sterno allo stesso livello della costa secunda (Figura 2C).
  2. Separare accuratamente la pelle e la fascia superficiale ed esporre la trachea e la sternale prossimale. Effettuare con attenzione un'incisione longitudinale della linea mediana di 3-4 mm allo sterno partendo dal bordo superiore fino all'angolo sternale (Figura 2D).
    NOTA: Il taglio non deve superare l'angolo sternale, poiché esiste il rischio di causare pneumotorace acuto nel topo.
  3. Sollevare delicatamente lo sterno con una pinza e il timo e l'arcus aortae sotto di esso. Utilizzare con attenzione una pinza dritta e sezionare senza mezzi termini la nave bersaglio e i tessuti circostanti.
  4. Tenere il riavvolgitore precedentemente autocostruito (passaggio 1.4) che conteneva un laccio metallico all'estremità della mano destra dell'utente.
  5. Passare con attenzione il laccio del divaricatore fatto da sé sotto l'aorta tra l'arteria carotide comune sinistra e l'origine dell'arteria innominata destra (Figura 2E).
  6. Passa il divaricatore autocostruito alla mano sinistra per risparmiare la mano destra per altri strumenti.
  7. Con una pinzetta microscopica nella mano destra, passare una sutura di seta 7-0 attraverso il cappio del laccio alla fine ed estrarre il divaricatore. Ciò consentirà di lasciare la sutura di seta intorno all'arteria per un'ulteriore legatura (Figura 2F).
    NOTA: Sii delicato e non trascinare troppo l'arco aortico dalla sua posizione originale.
  8. Posizionare un ago da 27 G parallelamente all'aorta e legare la sutura attorno all'ago e all'aorta (Figura 2G,H).
    NOTA: La procedura fittizia dovrebbe essere la stessa, tranne per il fatto che non vi è alcuna legatura dell'aorta.
  9. Tenere l'ago da 27 G con una pinza oftalmica e un'altra pinza che tiene il nodo legato all'ago da 27 G e all'aorta. Estrarre rapidamente ma delicatamente l'ago da 27 G dalla legatura (Figura 2H).
    NOTA: Il nodo non deve essere troppo stretto, altrimenti non sarà facile estrarre l'ago. Fare attenzione quando si estrae l'ago in caso di rottura dell'aorta.
  10. Suturare la pelle con una sutura monofilamento sintetica 4-0 in uno schema di sutura interrotto (Figura 2I).

4. Assistenza postoperatoria

  1. Posizionare il mouse su un pad caldo (vedere Tabella dei materiali) e attendere che si ravviva. Generalmente, il topo si rianima in circa 60 minuti.
    NOTA: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non riacquista sufficiente coscienza alla recumenza sternale principale.
  2. Iniettare per via sottocutanea 0,5 ml di soluzione salina calda e monitorare l'omeostasi fluida degli animali.
    NOTA: Questo passaggio impedisce agli animali la disidratazione e lo stato di circolazione ipovolemica.
  3. Applicare l'unguento eritromicina sulla superficie della ferita ogni giorno per 3 giorni.
  4. Per il trattamento del dolore post-chirurgico, somministrare 1 mg/L di anestetico locale di buprenorfina per via parenterale al sito di incisione (vedere Tabella dei materiali).
  5. Dopo l'intervento, monitorare il topo per segni di infezione e compromissione (malnutrizione, postura curva e pelliccia arruffata).
    NOTA: Gli animali sottoposti a intervento chirurgico non vengono restituiti alla compagnia di altri animali fino a quando non sono completamente recuperati.

5. Imaging ad ultrasuoni

  1. Confermare la corretta legatura dell'aorta trasversale calcolando la velocità del flusso sanguigno tramite un sistema di imaging a ultrasuoni12,13 (24 MHz, vedere la tabella dei materiali) 28 giorni dopo l'intervento.
    1. Anestetizzare l'animale con isoflurano al 4,5% in aria arricchita di ossigeno al 20% e mantenere con isoflurano allo 0,5% in aria arricchita di ossigeno al 20%.
    2. Posizionare il mouse in posizione supina e fissare le estremità all'elettrodo con nastro adesivo.
    3. Utilizzando la crema depilatoria, rimuovere i peli del petto e applicare un agente di accoppiamento ad ultrasuoni sul petto.
    4. Inclinare la piattaforma verso sinistra il più lontano possibile. Mantenendo la sonda in posizione verticale, abbassarla gradualmente lungo la linea parasternale destra sul petto con la tacca rivolta verso il mento dell'animale.
    5. Sotto la modalità B dello strumento, regolare l'asse X e Y fino a quando l'arco aortico e il sito di costrizione sono chiaramente visibili.
    6. Fare clic sul pulsante Pulse Wave Doppler per passare alla modalità onda pulsata.
    7. Regolare la casella del volume del campione del cursore tratteggiato in modo distale sul sito ristretto e trovare il getto stenotico con la massima velocità.
    8. Fare nuovamente clic sul pulsante Pulse Wave Doppler per ottenere la forma d'onda del flusso aortico e misurare la velocità di picco. Calcolare la velocità del flusso sanguigno in base al picco dei modelli d'onda (Figura 3A,B).
    9. Impostare l'imager sulla modalità B. Appoggiare la piattaforma in posizione orizzontale. Ruotare la sonda di 30° rispetto alla linea parasternale sinistra.
    10. Regolate gli assi X e Y per ottenere una vista dell'asse corto. Premere la modalità M per visualizzare la linea dell'indicatore e fare clic su Cine Store per salvare l'immagine per una successiva misurazione dello spessore della parete cardiaca, della dimensione della camera e della frazione di eiezione.
      NOTA: La formula per il calcolo della frazione di eiezione: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). La formula per il calcolo della gittata cardiaca: Volume dell'ictus * Frequenza cardiaca (al primo fotogramma disegnato) / 1000. La maggior parte degli indici come la frazione di eiezione e la gittata cardiaca possono essere misurati automaticamente tramite il software del sistema di imaging a ultrasuoni. LV Vol;d: volume diastolico del ventricolo sinistro. LV Vol;s: volume sistolico del ventricolo sinistro.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopo il successo della chirurgia TAC, il sovraccarico di pressione è stato rilevato utilizzando un sistema di imaging ad ultrasuoni. Quattro settimane dopo l'intervento chirurgico, i topi sviluppano una diminuzione della funzione cardiaca. Nel presente studio, l'efficacia della chirurgia TAC è stata convalidata tramite frazione di eiezione (EF), accorciamento frazionato (FS), massa ventricolare sinistra (massa LV) e diametro interno ventricolare sinistro (LVID) di topi sottoposti a chirurgia TAC dopo 4 settimane...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'induzione di un sovraccarico di pressione prolungato può gradualmente causare ipertrofia cardiaca e insufficienza cardiaca. Questo modello è stato utilizzato in numerosi laboratori in tutto il mondo14,15,16. Il protocollo ha fornito un metodo TAC migliorato che non richiede competenze microchirurgiche o ventilazione meccanica.

Il passo più importante in questo protocollo è passare la sutura di seta ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori hanno dichiarato che non ci sono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC 81822002). Ringraziamo tutti i membri che hanno preso parte a questo lavoro.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sutura non assorbibile 4-0JinhuanHM403Utilizzato per suturare la pelle
Siringa da 5 mlHaifuda Technology Co., Ltd.BD-309628Utilizzato per realizzare trappole contenenti
sutura non assorbibile retrattore 7-0JinhuanHM701Utilizzato per la legatura dell'aorta
Monitoraggio della temperatura animaleKaerwenFT3400Utilizzato per il monitoraggio della temperatura corporea
Buprenorfina SigmaB-044Utilizzato per il trattamento del dolore post-chirurgico
Crema depilatoria VeetN/AUtilizzato per rimuovere i peli del corpo dall'area chirurgica
Pad riscaldanteXiaochuangxinN/AUtilizzato per il mantenimento della temperatura corporea
IbuprofeneMCEHY-78131Utilizzato per il trattamento del dolore post-chirurgico
Filo di ferro (0,5 mm)Qing YuanFilo di ferro #26Utilizzato per realizzare trappole contenenti divaricatore
Pinzette microscopicheRWDF12006-10Utilizzato per penetrare e separare il tessuto per aprire lo spazio operativo
Porta agoRWDF12005-10Utilizzato per pizzicare la punta dell'ago di calibro e smussarlo
Pinze oftalmicheRWDF14012-10 Utilizzato per trattenere la pelle e altri tessuti
Forbici oftalmicheRWDS11001-08Utilizzato per eseguire l'incisione di puntura del topo
Pentobarbital sodicoSigmaP3761Utilizzato per l'anestesia del topo
Tappetino operatorio sterileHale & heartyUtilizzato per posizionare l'animale durantel'intervento
Sistema di imaging a ultrasuoniFujifilm visualsonicsvevo1100Utilizzato per misurare la velocità del flusso sanguigno, lo spessore della parete ventricolare sinistra e la frazione di eiezione, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100
211002 chirurgico

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heidenreich, P. A., et al. AHA/ACC/HFSA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. Circulation. 145 (18), 895(2022).
  2. McDonagh, T. A., et al. ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure. European Heart Journal. 42 (36), 3599(2021).
  3. Lv, B., et al. Induction of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury in mice. Journal of Visualized Experiments. (179), e63257(2022).
  4. Curaj, A., Simsekyilmaz, S., Staudt, M., Liehn, E. Minimal invasive surgical procedure of inducing myocardial infarction in mice. Journal of Visualized Experiments. (99), e52197(2015).
  5. Nakamura, M., Sadoshima, J. Mechanisms of physiological and pathological cardiac hypertrophy. Nature Reviews Cardiology. 15 (7), 387-407 (2018).
  6. Wang, H., et al. Bibliometric analysis on the progress of chronic heart failure. Current Problems in Cardiology. 47 (9), 101213(2022).
  7. Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
  8. Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
  9. Rockman, H. A., Wachhorst, S. P., Mao, L., Ross, J. ANG II receptor blockade prevents ventricular hypertrophy and ANF gene expression with pressure overload in mice. The American Journal of Physiology. 266, 2468-2475 (1994).
  10. Eichhorn, L., et al. A closed-chest model to induce transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57397(2018).
  11. Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of minimally invasive transverse aortic constriction in mice for induction of left ventricular hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (127), e56231(2017).
  12. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).
  13. Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101(2016).
  14. Wang, X., et al. ATF4 protects the heart from failure by antagonizing oxidative stress. Circulation Research. 131 (1), 91-105 (2022).
  15. Li, J., et al. GCN5-mediated regulation of pathological cardiac hypertrophy via activation of the TAK1-JNK/p38 signaling pathway. Cell Death & Disease. 13 (4), 421(2022).
  16. Syed, A. M., et al. Up-regulation of Nrf2/HO-1 and inhibition of TGF-beta1/Smad2/3 signaling axis by daphnetin alleviates transverse aortic constriction-induced cardiac remodeling in mice. Free Radical Biology and Medicine. 186, 17-30 (2022).
  17. Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K., Chow, B. K. Minimally invasive transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (121), e55293(2017).
  18. Lao, Y., et al. Operating transverse aortic constriction with absorbable suture to obtain transient myocardial hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (163), e61686(2020).
  19. Veldhuizen, R. A., Slutsky, A. S., Joseph, M., McCaig, L. Effects of mechanical ventilation of isolated mouse lungs on surfactant and inflammatory cytokines. European Respiratory Journal. 17 (3), 488-494 (2001).
  20. Withaar, C., Lam, C. S. P., Schiattarella, G. G., de Boer, R. A., Meems, L. M. G. Heart failure with preserved ejection fraction in humans and mice: embracing clinical complexity in mouse models. European Heart Journal. 42 (43), 4420-4430 (2021).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Ipertrofia cardiacamodello di insufficienza cardiacachirurgia dell arco aorticochirurgia del toposovraccarico di pressionechirurgia mininvasivadivaricatore autocostruitotecnica di suturamassa ventricolare sinistra

Articoli correlati