Presentato qui è una procedura chirurgica per la legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra nei topi. Questo modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e la risposta infiammatoria associata dopo infarto miocardico.
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Articolo metodologico
Legatura coronaria sinistra: un modello chirurgico murino di infarto miocardico
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cardiopatia ischemica e il successivo infarto miocardico (IM) sono una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti e in tutto il mondo. Al fine di esplorare i cambiamenti fisiopatologici dopo infarto miocardico e progettare trattamenti futuri, sono necessari modelli di ricerca di IM. La legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra (LCA) nei topi è un modello popolare per studiare la funzione cardiaca e il rimodellamento ventricolare post MI. Qui descriviamo un modello di MI murino chirurgico meno invasivo, affidabile e riproducibile mediante legatura permanente dell'LCA. Il nostro modello chirurgico comprende un'anestesia generale facilmente reversibile, un'intubazione endotracheale che non richiede una tracheotomia e una toracotomia. L'elettrocardiografia e la misurazione della troponina devono essere eseguite per garantire l'infarto miocardico. L'ecocardiografia al giorno 28 dopo l'infarto miocardico discernerà la funzione cardiaca e i parametri di insufficienza cardiaca. Il grado di fibrosi cardiaca può essere valutato dalla colorazione tricromatica di Masson e dalla risonanza magnetica cardiaca. Questo modello di MI è utile per studiare le alterazioni fisiopatologiche e immunologiche dopo l'infarto miocardico.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari sono una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica che mietono 17,9 milioni di vite ogni anno, rappresentando il 31% della mortalità globale1. Il tipo più diffuso di anomalia cardiovascolare è la malattia coronarica e l'infarto miocardico (MI) è una delle principali manifestazioni della malattia coronarica2. L'infarto miocardico è solitamente causato dall'occlusione trombotica di un'arteria coronaria dovuta alla rottura di una placca vulnerabile3. L'ischemia risultante provoca profondi cambiamenti ionici e metabolici nel miocardio interessato, nonché una rapida diminuzione della funzione sistolica. L'infarto miocardico provoca la morte dei cardiomiociti, che può ulteriormente portare a disfunzione ventricolare e insufficienza cardiaca4.
La ricerca sull'infarto miocardico nei pazienti è limitata a causa della scarsità di tessuti ottenuti da pazienti con infartomiocardico 5. Pertanto, i modelli murini di infarto miocardico sono utili sia nello studio dei meccanismi della malattia che nello sviluppo di potenziali bersagli terapeutici. I modelli murini di IM attualmente disponibili includono modelli di ischemia irreversibile (LCA e metodi di ablazione) e modelli di riperfusione (ischemia/riperfusione, I/R)6. La legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra (LCA) nei topi è il metodo più utilizzato e imita la fisiopatologia e l'immunologia dell'infarto miocardico nei pazienti 7,8,9. L'infarto miocardico permanente può anche essere indotto da metodi di ablazione, che comportano danni elettrici o criolesioni. I metodi di ablazione sono in grado di generare infarto di dimensioni uniformi nella posizione precisa10. D'altra parte, la formazione di cicatrici, la morfologia dell'infarto e i meccanismi di segnalazione molecolare possono variare tra i metodi di ablazione10,11. Il metodo I/R murino è un altro importante modello di MI in quanto rappresenta lo scenario clinico della terapia di riperfusione12. Il modello I/R è associato a sfide quali una dimensione variabile dell'infarto, difficoltà nel distinguere le risposte della lesione iniziale e riperfusione6.
Sebbene ampiamente utilizzati, i metodi di legatura LCA sono associati a bassi tassi di sopravvivenza e dolore post-operatorio13. Questo protocollo dimostra il modello di infarto miocardico chirurgico murino della legatura LCA che prevede la preparazione e l'intubazione dei topi, la legatura LCA, la cura post-operatoria e la convalida dell'infarto miocardico. Piuttosto che utilizzare una tracheotomia invasiva14, questo metodo impiega l'intubazione endotracheale. L'animale viene intubato illuminando l'orofaringe usando un laringoscopio, rendendo la procedura più facile, più sicura e meno traumatica15. Il topo viene tenuto sul supporto del ventilatore e in anestesia isoflurana durante tutta la procedura. Inoltre, l'ecocardiografia e la colorazione tricromatica di Masson vengono eseguite per valutare rispettivamente la funzione cardiaca e la fibrosi cardiaca dopo l'infarto miocardico. Nel complesso, questo metodo fornisce un modello murino chirurgico affidabile e riproducibile di MI che può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e l'infiammazione dopo l'infarto miocardico.
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Protocollo
Il presente protocollo di studio è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Pittsburgh. Per questi esperimenti sono stati utilizzati otto topi femmina C57BL / 6J di 1 anno del peso di 24-30 g. Circa il 100% e almeno l'80% dei topi sono sopravvissuti rispettivamente nelle prime 24 ore e 28 giorni.
1. Preparazione e intubazione endotracheale dei topi
- Preriscaldare uno sterilizzatore a sfere (vedere Tabella dei materiali) a 250 °C e posizionarvi strumenti chirurgici autoclavati per alcuni minuti.
- Anestetizzare il topo in una camera di induzione con isoflurano al 3% e 1 L/min di ossigeno per 5 min.
- Garantire la profondità dell'anestesia nel mouse controllando la risposta a un pizzico fermo del dito.
- Pesare il topo per stimare il dosaggio del farmaco analgesico preoperatorio, buprenorfina (0,1 mg/kg). Iniettare il farmaco per via intraperitoniale.
- Taglia la pelliccia sul lato sinistro del torace usando un rasoio elettrico.
- Disinfettare il sito chirurgico con povidone-iodio e etanolo al 70% tre volte.
- Posizionare il mouse in posizione supina su una tavola inclinata. Fissare la testa e gli arti del mouse utilizzando una fascia elastica attaccata rispettivamente agli incisivi superiori e al nastro adesivo. Applicare lubrificante oftalmico sterile sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Apri la mascella e tira delicatamente la lingua fuori dalla cavità orale.
- Identificare l'apertura della laringe illuminando l'orofaringe usando un laringoscopio (vedere Tabella dei materiali).
- Tagliare circa 0,5 cm da un ago del catetere da 24 G e inserire l'ago smussato nello schermo di plastica. Dirigere l'ago smussato con lo scudo di plastica nella trachea. Estrarre l'ago, lasciando lo scudo di plastica nella trachea.
- Impostare il ventilatore (vedi Tabella dei materiali) su una frequenza respiratoria di 137 battiti al minuto (ottimizzata per i topi utilizzati in questo studio) e volume corrente 0,18 cc. Collegare i tubi del respiratore allo schermo del catetere e confermare la corretta intubazione cercando un movimento toracico sincronizzato con il ventilatore.
- Scollegare il tubo del respiratore dalla protezione del catetere e posizionare l'animale in posizione supina su una tavola chirurgica preriscaldata a temperatura controllata. Ricollegare il mouse al ventilatore.
2. Legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra
- Disinfettare il sito chirurgico con povidone-iodio e alcool al 70%. Applicare un drappo sterile con un foro di dimensioni quarte al centro per fissare il sito chirurgico. Sollevare delicatamente la pelle con un paio di pinze e praticare una piccola incisione trasversale cutanea (1,5-2 cm) lungo la linea tra i muscoli pettorali maggiori e minori sinistro usando un paio di forbici chirurgiche.
NOTA: Le forbici sono state utilizzate per eseguire l'incisione in quanto fornisce il controllo richiesto sulla profondità e sulla direzione del taglio. - Separare i muscoli pettorali sottostanti con una pinza e forbici da dissezione. I muscoli sono stati separati usando divaricatori attaccati a elastici.
- Fai un'incisione nel terzo spazio intercostale con un paio di micro forbici seguendo l'angolo naturale della gabbia toracica. In questa fase, è necessario prestare estrema attenzione per prevenire lesioni al cuore e ai polmoni.
- Allungare delicatamente le costole usando i divaricatori per esporre il ventricolo sinistro. Spostare il grasso pericardico da parte e individuare l'LCA, che corre dal bordo dell'atrio sinistro verso l'apice del cuore.
- Passa un 8-0 sutura di nylon sotto l'LCA con l'aiuto di un portaaghi. Ligare la LCA con un doppio nodo seguito da un secondo nodo (un nodo del chirurgo modificato).
NOTA: Lo sbiancamento del ventricolo inferiore sinistro conferma una legatura LCA di successo. Oltre a questo, si consiglia anche la misurazione della troponina, il monitoraggio ECG (elevazione ST), la risonanza magnetica eco/cardio-dipendente in vivo o le immagini micro-CT per confermare le lesioni MI comparabili. - Rimuovere i divaricatori e inserire un ago da catetere da 22 G nella cavità toracica. Rimuovere l'ago, lasciando la punta dello scudo di plastica nella cavità toracica. Chiudere la gabbia toracica utilizzando una sutura di nylon 4-0.
- Collegare una siringa allo schermo di plastica da 22 G e rimuovere lentamente l'aria in eccesso intrappolata nella cavità toracica premendo delicatamente il torace per stabilire una pressione dell'aria negativa. Rimuovere lo scudo di plastica.
- Chiudere la pelle con una sutura di nylon 4-0.
- Spegnere l'alimentazione di isoflurano. In questa fase, il mouse è sul ventilatore che fornisce ossigeno.
3. Assistenza post-operatoria
- Spegnere il ventilatore una volta iniziata la respirazione spontanea.
NOTA: La procedura richiede circa 30-35 minuti per animale dalla preparazione dei topi fino a questa fase. - Tenere il mouse sotto una lampada di calore e monitorarlo fino a quando non è sveglio. L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha recuperato abbastanza coscienza per mantenere la recumbency sternale.
- Dopo l'intervento chirurgico, posizionare l'animale in una gabbia separata e riportarlo nella gabbia originale con altri animali solo dopo che si è completamente ripreso.
- Monitorare il mouse quotidianamente per qualsiasi segno di dolore o disagio.
- Continuare l'iniezione intraperitoneale di buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 6-8 ore per altri 2 giorni dopo l'intervento.
4. Valutazione ecocardiografica
NOTA: L'ecocardiografia è stata eseguita per valutare i parametri di insufficienza cardiaca il giorno 28 dopo l'infarto miocardico.
- Dopo 28 giorni dall'intervento, anestetizzare i topi con il 3% di isoflurano e 1 L/min di ossigeno, applicare un lubrificante oftalmico sterile sugli occhi e rimuovere i peli del torace con una crema depilatoria. Disinfettare l'area del torace con povidone-iodio e etanolo al 70% tre volte.
- Assicurare i topi anestetizzati in cima alla piattaforma di imaging (vedi Tabella dei materiali) in posizione supina e mantenere un livello costante di anestesia durante tutta la procedura utilizzando un cono nasale collegato al sistema anestetico (1% -2% di isoflurano e 1 L / min di ossigeno).
- Fissare le quattro zampe agli elettrodi ECG con gel per elettrodi (vedere la tabella dei materiali). Monitorare la temperatura dell'animale inserendo una sonda rettale (vedi Tabella dei materiali).
- Applicare il gel di scansione (vedi Tabella dei materiali) sul torace, posizionare il trasduttore verticalmente, abbassarlo sulla linea parasternale (parallela al torace) e ruotare di 35° in senso antiorario per ottenere la vista dell'asse lungo parasternale del ventricolo sinistro.
- Toccare il pulsante di imaging in modalità B sul software di imaging (vedere Tabella dei materiali) per ottenere una visione completa dell'asse lungo del cuore. Regolare le dimensioni e la luminosità del cancello e salvare le immagini utilizzando Save Clip o Save Frame per misurazioni successive16.
- Passare alla modalità M (modalità movimento) e posizionare l'asse M-mode a livello del muscolo papillare. Regola le dimensioni del gate e tocca il pulsante M-mode Start. Salvate le immagini utilizzando Save Clip o Save Frame16,17.
- Poiché il processo di acquisizione delle immagini in modalità 4D è automatizzato, verificare che i segnali ECG e respirazione siano attivi (Figura 1) prima di acquisire i dati.
- Inizia ad acquisire i dati in B-Mode. Aprire il pannello di scansione 4D e avviare il motore 3D. Impostare i parametri dell'immagine nel pannello di scansione 4D e toccare il pulsante Scansione per iniziare la scansione. Dopo aver esaminato le immagini nella vista 2D, caricarle in modalità 4D utilizzando il pulsante Carica in 4D .
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Risultati
La Figura 1 mostra i segnali rappresentativi attivi dell'ECG e della respirazione durante la valutazione ecocardiografica dei topi sham (Figura 1A) e MI (Figura 1B). La verifica dei segnali attivi ECG e respirazione è importante prima di acquisire i dati ecocardiografici. La Figura 2 mostra la misurazione ecocardiografica dei parametri funzionali cardiaci dopo 28 giorni dopo la legatur...
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Discussione
Il modello murino di infarto miocardico sta guadagnando popolarità nei laboratori di ricerca cardiovascolare e questo studio descrive un modello di infarto miocardico riproducibile e clinicamente rilevante. Questo protocollo migliora il processo di legatura LCA in diversi modi. Per cominciare, si evita l'uso di anestetici pre-operatori iniettabili come xilazina / ketamina o pentobarbital di sodio14,15. È stata utilizzata solo l'anestesia con isoflurano, che aiuta...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Health (R01HL143967, R01HL142629, R01AG069399 e R01DK129339), AHA Transformational Project Award (19TPA34910142), AHA Innovative Project Award (19IPLOI34760566) e ALA Innovation Project Award (IA-629694) (a PD).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ago per catetere 22 G | Exel INT | 26741 | Toracentesi |
| Ago per catetere 24 G | Exel INT | 26746 | Intubazione endotracheale |
| 4-0 sutura in nylon | Covetrus | 29263 | Sutura dei muscoli e della pelle |
| 8-0 sutura in nylon | S& T | 3192 | Legatura di LAD |
| Vaporizzatori anestetici | Vet equip | VE-6047 | Supporto anestetico |
| Monitor fisiologico animale | Fujifilm | VEVO 3100 | Monitoraggio della frequenza cardiaca, della frequenza respiratoria e della temperatura corporea |
| Soluzione di betadina | PBS salute animale | 11205 | Antispetico |
| Buprenorfina | Covetrus | 55175 | Analgesico |
| Microscopio sezionatore | OMANO | OM2300S-V7 | Binocolo |
| Rasoio elettrico | Wahl | 79300-1001M | Gel |
| elettrodi | Parker Laboratories | W60698L | Gel elettricamente conduttivo |
| Etanolo | Decon Laboratories | 22-032-601 | Pinze disinfettanti |
| FST | 11065-07 | Acciaio inossidabile | |
| Garza | Curity | CAR-6339-PK | |
| Lampada termica | Satco | S4998 | Cura post-operatoria |
| Termoforo | Kent scientific | Surgi-M | Controllo della temperatura |
| Sterilizzatore a perline calde | Germinatore 500 | 11503 | Sterilizzazione dello strumento chirurgico |
| Isoflurano | Covetrus | 29405 | Anestesia |
| Masson’ s kit di colorazione tricromica | Thermoscientific | 87019 | Misurazione della fibrosi cardiaca |
| Micro porta aghi | FST | 12500-12 | Micro forbici in acciaio inossidabile |
| FST | 15000-02 | ||
| Unguento oftalmico | Dechra | Puralube Vet | Lubrificante oculare sterile |
| Gel di scansione | Parker Laboratories | Aquasonic 100 | Gel acquoso per la trasmissione degli ultrasuoni |
| Forbici | FST | 14060-11 | |
| Laringoscopio per piccoli animali | Penn-Century | Model LS-2-M | Illuminazione dell'orofaringe |
| Ventilatore per piccoli animali | Apparecchio Harvard | 557058 | Supporto per ventilatore |
| Luce chirurgica | Cole parmer | 41723 | Larghezza dell'illuminatore (in): 7 |
| Piattaforma di imaging preclinico Vevo 3100 | Fujifilm | VEVO 3100 | Ecocardiografia |
| Software VevoLAB | Fujifilm | VevoLAB 3.2.6 | Analisi dei dati dell'ecocardiografia |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
